Die Autoren danken Reiner Schultheiss und Wolfgang Schaden für ihre Inspiration für dieses Modell. Wir danken Christian Dorfmüller für seine enormen Anstrengungen aller Zeit zu unserer Forschung zu unterstützen. Vielen Dank an Robert Göschl und Hans Hohenegger für die sorgfältige technische Umsetzung unserer Ideen!

Ethische Genehmigung Nach Einholung schriftlicher Einwilligung der Patienten wurden aus Nabelschnüren Kaiserschnitt in der Abteilung für Frauenheilkunde für die Isolierung von menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) erhalten. Die Erlaubnis wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Innsbruck (Nr. UN4435) gegeben. 1. Vorbereiten des IVSWT Wasserbad <ol><li> Planen 3,5 l Leitungswasser in einem geeigneten Behälter. Wasser muss auf 37 ° C erhitzt werden (siehe Protokoll Nr. 6). </li><li> Füllen Sie das Wasser in das Wasserbad, bis der Wasserstand ca. 3 cm unter den Rand. Wohlgemerkt, um die Membran vollständig mit Wasser zu bedecken. Dies wird etwa die vorbereitete 3,5 L. erfordern </li><li> Verbinden des Temperatursensors mit der Stromversorgung. </li><li> Setzen Sie den Sensor in die vorgesehene Anschluss an der Rückwand des Wasserbades. </li><li> Verbinden Erhitzen auf Stromversorgung des Temperatursensors. Tun Sie dies nicht tun, ohneWasser in der Badewanne, wie die Heizung würde das Plexiglas schmelzen. </li><li> Warten bis das Wasser eine stabile Temperatur von 37 ° C erreicht hat Rühren Sie das Wasser regelmäßig mit irgendeiner Art von Stick auf konstante Temperatur während des Wasserbades zu gewährleisten. </li></ol> 2. Bereiten Zellen und Kulturflaschen <ol><li> Samenzellen über Nacht bei gewünschten Dichte in T25 Kulturflaschen oder Kultur werden die Zellen direkt in den Kolben, bis sie die gewünschte Konfluenz erreicht haben. </li><li> Vor dem Experiment, richten Sie die Flaschen senkrecht. </li><li> Füllen Sie die Kulturflaschen mit Kulturmedium, bis direkt unter den Hals. Nicht zu viel Medium in die Kolben als Medium in Kontakt, um den Hals oder der Verschlusskappe füllen würde nicht kontaminiert werden. </li><li> Schrauben Sie die Flaschen mit festen Kappen ohne Filter, um eine Kontamination von Wasser zu verhindern. Dagegen, dass das Wasser in dem Bad und das Bad selbst nicht steril sind. </li><li> Verschließen Sie die Kappen mit Parafilm vor dem Einsetzen in das Wasserbad. </li> &lt;li&gt; Fix verschlossenen Kulturflaschen in der vorgesehenen Ständer. </li><li> Legen Sie fest Kolben in ein Wasserbad. Darauf achten, dass die Mitte der Zellkulturflasche ist auf der gleichen Höhe wie die Mitte der Stoßwellenapplikator Membran. Eine Linie, an der Seite des Bades führt Sie. </li></ol> 3. Behandlungsparameter definieren <ol><li> Abstand zwischen Stoßwellenquelle und der Probe bestimmen. Identifizieren perfekte Behandlungsparameter, indem die Parameter Befund Pilotversuch, wie in Abbildung 6 beschrieben. </li><li> Wählen Sie die richtigen Behandlungsparameter (Energieflussdichte, Frequenz) auf dem Stoßwellengerät. Auch hier beziehen sich auf die 6. </li></ol> 4. Shock Wave Anwendungs <ol><li> Setzen viele Mengen von im Handel erhältlichen Ultraschallübertragungs Gel auf der Stoßwellenapplikator als auch auf der Membran des Wasserbades. Dies ist, um die Kopplung zu sichern. Keine Luft oder Luftblasen zwischen dem Applikator und der Membran seines würde Schockwellen zu absorbieren. </li><li> Schließen Applikator an der Membran und halten Sie es in der Mitte der Membran stabil. Achten Sie darauf, dass sie horizontal ausgerichtet. </li><li> Sicherstellen, dass die korrekte vertikale Position der Sonde innerhalb des Wasserbades im Einklang mit der angegebenen Markierung an der Seite des Bades ist. </li><li> Halten Zentren des Applikators und des Kolbens stabil in einer horizontalen Linie. </li><li> Aktivierung der Stoßwellen-Vorrichtung und Anwendung der Impulse, während die Kulturflasche sowie den Applikator in einer stabilen Position während des gesamten Verfahrens. </li></ol> 5. Nach Behandlung <ol><li> Nehmen Sie die Kulturkolben aus dem Wasserbad. </li><li> Trocknen Sie es mit gemeinsamen Papierhandtücher. </li><li> Wischen Sie die Flasche genau mit Desinfektionsmittel. </li><li> Parafilm entfernen Dicht und Mütze. </li><li> Pipettieren Sie die Medium in den Kolben in Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie entsprechend. Zentrifugieren Parameter sind abhängig von der verwendeten Zelltyp, <em&gt; ZB. für HUVECs, verwenden Sie 290 g bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen von 5 ml Zellkulturmedium in den Kolben. Resuspendieren des Zellpellets zentrifugiert, mit 2 ml Zellkulturmedium. Pipettieren Sie die Suspension in den Messkolben. So müssen Zellfragmente oder Zellen, die während der Behandlung abgenommen worden sind, können nicht verloren gehen. </li></ol> Fallstricke <ol><li> Herstellung, wie auch die Behandlung sollte unter sterilen Bedingungen in laminarer Strömung durchgeführt, um eine Kontamination der Zellkultur verhindern. </li><li> Gute Zellkultur Praxis wird empfohlen, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. Insbesondere Desinfektion von der Außenseite der Flaschen ist stark, bevor sie sie wieder in den Inkubator zu empfehlen. Das Wasserbad, als auch das Wasser im Inneren, ist nicht steril! </li><li> Sie den Ofen an die Stromversorgung anschließen, es sei denn das Wasserbad wird mit Wasser gefüllt, um eine Beschädigung der Plexiglas gebaut Bad zu vermeiden. </li><li> Verwenden Sie großzügige Mengen von Ultraschall-Gel auf die Schockwelle appleige, um eine ordnungsgemäße Kupplung und Wellenausbreitung in das Bad zu garantieren. Air und auch kleine Luftblasen zu tun absorbieren Stoßwellen! </li><li> Lage der Sonden in dem Wasserbad in Bezug auf den Applikator auf die Behandlung des gesamten Wachstumsbereich zu gewährleisten. </li><li> Sonden zu tief in das Wasser tauchen Sie nicht, um eine Kontamination zu vermeiden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Bedeutung der vorgeschlagenen Modell zur in-vitro Stoßwellenbehandlung ist die Tatsache, dass die Wellen kann nach dem Passieren der Zellkultur im Gegensatz zu existierenden Modellen ausbreiten. Dadurch können störende physikalische Effekte wie Zugkräfte vermieden werden. Das Modell ähnelt mehr in vivo-Bedingungen als die von anderen Anwendung direkt Wellen, ihre Zellkulturflaschen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die Möglichkeit der Änderung des Abstandes zwischen Stoßwellenquelle und Zellen. Dies wäre nicht möglich, wenn direkt Behandlung einer Kulturflasche. Jedoch in vivo gibt gewisse Unterschiede im Abstand zwischen dem Applikator und dem Zielbereich, je nachdem, wie tief in das Zielgewebe ist. Gleichzeitig kann man die Wirkung der Zellen in bestimmte Positionen zu Fokuspunkt der Welle zu studieren. Durchführung von ersten Experimente Nach unseren Erfahrungen mit ca.rdiomyocytes, Endothelzellen, Fibroblasten und Stammzellen braucht jeder Zelltyp seine spezifischen Behandlungsparameter. Wir empfehlen daher dringend eine Pilotstudie zur Beurteilung der adäquaten Behandlungsparameter vor der Durchführung der gewünschten Experimenten. Dieser Pilotversuch muss unterschiedliche Abstände zwischen der Stoßwelle Applikator und der Probe sowie verschiedene Energieflussdichten enthalten. Auch die geeignete Anzahl von Impulsen festgelegt werden. Die Häufigkeit der Anwendung von Stoßwellen ist immer noch ein Anliegen - auch in vivo. Ein geeignetes Protokoll für eine Behandlungsparameter finden Pilotversuch ist als Ergänzung Abbildung 6 vorgesehen. Die Verwendung des idealen Kulturgefäß ist von großer Bedeutung für den Erfolg des Experiments. Wir bevorzugen gemeinsame Zellkulturflaschen jeder Größe. ZB kleinere Volumina für das Schiff vollständig zu füllen während eine Schockwelle müssen - Es kann jedoch Gründe, um andere Schiffe zu verwendenpplication. Geeignete Materialien, aus einem akustischen Standpunkt aus sind PE (Z = 1&#39;760&#39;000 Ns / m 3), Soft-Gummi (Z = 1&#39;270&#39;000 Ns / m 3), Polyamid (Z = 1&#39;960&#39;000 Ns / m 3). Weniger ideal ist PVC (3&#39;270&#39;000 Ns / m 3) Plexiglas (Z = 3&#39;260&#39;000 Ns / m 3) Delrin (3&#39;450&#39;000 Ns / m 3) Polycarbonat (2&#39;770&#39;000 Ns / m 3) oder Polypropylen (2&#39;400&#39;000 Ns / m 3). Harte Materialien wie Glas oder Metall, dürfen nicht verwendet werden. Kritische Schritte Definieren Sie den Abstand zwischen der Stoßwellenquelle und der Probe kann sehr schwierig sein. Der Grund dafür ist, dass die Quelle (z. B. Elektrodenspitzen in einem elektrohydraulischen System) im Inneren des Applikators. Daher ist es notwendig, den Abstand von der Quelle zu den Applikatoren Mantel kennenzulernen. Möglicherweise müssen Sie sich an den Hersteller des Stoßwellengerät fragen. Ein Nachteil dieses Modells ist die Tatsache, dass die Zellkulturfläschchen sein mussmit Kulturmedium gefüllt. Füllen zB Zellkulturflaschen bedeutet einen erhöhten Verbrauch und teure Kulturmedium. Neben Kosten, bedeutet diese Tatsache auch, dass, was auch immer die Zellen sezernieren stark verdünnt wird. Erkennen Moleküle bekommt daher viel schwieriger, weil von einer verminderten Konzentration. Daher haben wir begonnen, Protein-Filter für die Zentrifugation zu verwenden und dadurch wieder zu erhöhen Konzentration. Neben der Verwendung von verschiedenen Arten von Zellkulturflaschen, wie oben beschrieben, der Haupt Modifikation für IVSWT ist seine Verwendung für die Zellkultur und ex-vivo-Modellen. Insbesondere getestet unserer Gruppe es mit perfekten Ergebnissen in der Aorten-Ring Angiogenese-Assay 10. Dies bedeutet, dass es möglich ist, jede Art von Organgewebe oder Gewebezüchtungen Transplantate in die IVSWT Wasserbad zu halten. Ex-vivo-Stoßwellenanwendung daher in Zukunft verwendet werden, um verschiedene Arten von Zellaussaat Methoden entwickelt Transplantate zu verbessern.

Stoßwellen sind Schalldruckwellen, die sich aus einer plötzlichen Freisetzung von Energie, zB. wie Donner, wenn der Blitz. In der Medizin Schockwellen sind seit über 30 Jahren in der Lithotripsie für die Behandlung von Nierensteinen eingesetzt. Da die Zufallsbefund Darmbein Verdickung in Lithotripsie Patienten in den frühen 1980er Jahren wurden erste Studien durchgeführt, um die Wirkung der Stoßwellenbehandlung (SWT) auf die Knochenheil 1 auszuwerten. Beeindruckende Ergebnisse verbessert die Heilung von Röhrenknochen Pseudarthrosen konnte 2 beobachtet werden. Anschließend wurden Hinweise auf Weichteilwunden 3 erweitert. Die Grundlagenforschung Ergebnisse zeigten, dass Stoßwellen nicht dazu führen, eine biologische Reiz auf das Zielgewebe ohne Folgeschäden. Freisetzung von angiogenetischen Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF, PIGF, FGF) durch deutliche Angiogenese gefolgt. Dies führte zu einem weiteren Ausbau der Beschilderung in Richtung ischämischen Pathologien. Unsere Gruppe und andere zeigten die positive effect von SWT auf ischämische Herzerkrankung im Tiermodell als auch in klinischen Studien 4-6. Jedoch der genaue Mechanismus, wie die physikalischen Stimulus von SWT in ein biologisches Signal (mechanotransduction) übersetzt weitgehend unbekannt. Da das Interesse in SWT aus verschiedenen Bereichen der Medizin kontinuierlich zunimmt, ist die Suche nach dem Mechanismus immer mehr und intensiver. Daher werden in vitro Experimente Schockwelle an Bedeutung. Neben der Reduktion von Tierversuchen und Wirtschaftlichkeit kann der größte Vorteil von In-vitro-Stoßwellenbehandlung (IVSWT) die Möglichkeit, das Studium der spezifische Verhalten eines bestimmten Zelltyp sein. In Stoßwellen vermittelten Geweberegeneration wahrscheinlich alle Zellen des behandelten Gewebes beteiligt sind, auch systemische Effekte werden diskutiert. Dennoch spielt jeder Zelltyp eine spezifische Rolle und hat seine eigene innere Funktion. IVSWT ermöglicht es uns, diese spezielle Funktion ein Erfassungsnd gibt uns dadurch ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden komplexen Prozessen. Das heutige Wissen über die Wirkung der Stoßwellen auf Zellkulturen umfasst die Zunahme der Verbreitung, Veränderung der Zellmembran-Rezeptoren, die Erhöhung und Beschleunigung der Zelldifferenzierung, die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und chemo Lockstoffe sowie erhöhte Zellmigration 7-9. Störende physikalische Effekte in den meisten in-vitro-Modelle sind verschiedene Verfahren zur Anwendung von Stoßwellen auf Zellkulturen beschrieben. Diese Tatsache führt zu dem Problem, dass es sehr schwierig ist, Ergebnisse zu vergleichen, als physikalische Bedingungen des Zellstimulation sehr unterschiedlich zwischen diesen Modellen sind. In der Regel konzentrieren sich alle bestehenden Modelle für die Schockwellen auf Zellen besten anzuwenden. Allerdings bleibt die Frage: Was passiert mit den Wellen nach dem Passieren der Zellkultur? Das Hauptproblem ist, dass die Differenz der akustischenImpedanz des Zellkulturmediums und der Umgebungsluft ist so hoch, dass mehr als 99% der Stoßwellen reflektiert zu werden 1. Aufgrund der Differenz in der akustischen Impedanz der beiden Medien die Wellen nicht nur reflektiert, sondern eine Phasenverschiebung von 180 ° auf, was zu starken Zugkräfte auf die Zellen Fig. 2 beschrieben. Akustische Impedanz als das Produkt aus der Dichte des Materials und seiner Schallgeschwindigkeit Z = ρ x C definiert. Wasser für die akustische Impedanz ZWater = 1.440.000 Ns / m 3 für Luft ist es nur 420 Ns / m 3. Die große Differenz der beiden Werte ergibt sich Reflexion und die Phasenverschiebung von Stoßwellen. Die Phasenverschiebung stellt sich eine positive Druckimpuls in eine Zug-Welle. Auch wenn diese Zugkraft ist nicht schädlich für die Zellen, stört es mit der Idee der Nachahmung in vivo Stoßwelleneffekte in vitro. In vivo dieseZugkräfte kaum durch große Körperstrukturen auftreten. Darüber hinaus kann die Rücklaufwellen stören auch die ankommenden Einsen. Dies kann Störungen verursachen. Zwei Arten von Störungen sind bekannt. Konstruktive Interferenz bedeutet, dass beide Wellen aufgenommen wodurch sich verdoppelt Amplitude Abbildung 3. Destruktive Interferenz tritt auf, wenn Wellen treffen diametral entgegengesetzt. Es verursacht Abschaffung der Wellen (3). Daher muss IVSWT ein Modell, das Schockwellen ermöglicht, nach dem Passieren der Zellkultur vermehren. IVSWT Wasserbad Überlegungen im Anschluss an die oben genannten Bedenken führen uns zu einer Wasser-Bad-Design zur Vermeidung der beschriebenen Probleme Abbildung 4. Grundsätzlich besteht es aus einem Plexiglas-Behälter gebaut mit einer Membran, jede Art von Stoßwellenapplikator verbinden. Zur Kopplung zwischen dieser Membran und der Applikator Ultraschallübertragung gel zu verwenden. Das Wasserbad wird mit entgastem Wasser gefüllt ist, um Kavitation, die auftreten würde, wenn Gas in dem Wasser gelösten vermeiden. Eine Heizvorrichtung am Boden mit einem Temperatursensor mit einer Steuereinheit verbunden ermöglicht Temperatur Nachahmung in vivo-Bedingungen zu regulieren und Zellkulturen zu vermeiden, um sich während des Verfahrens zu kühlen. Die Temperatur kann bei 37 Grad Celsius stabil gehalten werden, wie es in einem Inkubator getan. Ein Halter für die Zellproben können zum Eintauchen jede Art von Kulturkolben oder Röhrchen. Dabei muss das Probengefäß vollständig mit Kulturmedium gefüllt werden, wie Luftblasen würde Schockwellen blockieren! Eine keilförmige Absorber an der Rückwand des Bades selbst zerstört Wellen um nicht reflektiert und laufen zurück um Störungen zu vermeiden bekommen. Ein weiterer Vorteil gegenüber anderen IVSWT Modelle ist die Möglichkeit der Änderung des Abstandes zwischen dem Applikator und den Kulturflaschen. Die Ergebnisse unserer Gruppe und andere, die verwenden dieses Modell eindeutig swie, dass jeder Zelltyp reagiert sehr spezifisch auf verschiedene Behandlungsparameter. Außerdem ist entscheidend definiert den Abstand zwischen der Quelle der Wellen und der Probe ermöglicht es, die Zellen zu steuern, um an einer bestimmten Position in Bezug auf den Schwerpunkt der Stoßwellenapplikator sein.

<table><tbody><tr><td>Orthogold shock wave device</td><td>Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA &amp;ndash; manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVSWT Water Bath V2.0</td><td>Johann Hohenegger - Technical Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. &amp;amp; Growth Factors</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 &amp;amp; CC-4176</td><td>This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html&quot;&gt;Pechiney&amp;nbsp;Parafilm M PM996&lt;/a&gt;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PH-LF-PM996-EA at labplanet.com</td><td>for sealing flasks</td></tr><tr><td>Falcon Serological pipettes 25 ml</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>CellMate II Serological Pipette&amp;nbsp;</td><td>Matrix Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skintact Ultrasonic Gel</td><td>Skintact</td><td>UL-01 250 ml</td><td></td></tr><tr><td>T25 Cell culture flasks</td><td>COSTAR</td><td>3056</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozid disinfectant</td><td>Sch&amp;uuml;lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 L Degassed water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

shock wave application to cell cultures

Stoßwellen sind heute bekannt für ihre regenerierende Wirkung bekannt. Die Grundlagenforschung Ergebnisse zeigten, dass Stoßwellen nicht dazu führen, eine biologische Reiz auf Zellen oder Gewebe gezielt ohne Folgeschäden. Daher sind in vitro-Experimenten von zunehmendem Interesse. Verschiedene Methoden der Anwendung von Stoßwellen auf Zellkulturen beschrieben. In der Regel konzentrieren sich alle bestehenden Modelle für die Schockwellen auf Zellen besten anzuwenden. Allerdings bleibt die Frage: Was passiert mit den Wellen nach dem Passieren der Zellkultur? Der Unterschied der akustischen Impedanz des Zellkulturmediums und der Umgebungsluft ist so hoch, dass mehr als 99% der Stoßwellen reflektiert zu werden! Wir haben daher ein Modell entwickelt, das im Wesentlichen aus einem Plexiglas-Behälter gebaut, die die Wellen im Wasser nach dem Passieren der Zellkultur ausbreiten kann. Dies vermeidet Kavitation Effekte sowie Reflexion der Wellen, die sonst stören würden kündigte. With diesem Modell sind wir in der Lage, in vivo-Bedingungen zu imitieren und dadurch gewinnen mehr und mehr Wissen darüber, wie die physikalischen Reiz von Stoßwellen wird in einer biologischen Zelle Signal (&quot;mechanotransduction&quot;) übersetzt.

Mit dem beschriebenen Verfahren angewendet wir Schockwellen der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs), die wir zuvor aus der Nabelschnur isoliert. Nabelschnüre wurden von elektiven Kaiserschnitte erhalten. HUVECs wurden bei einem Zusammenfluss von 90% in einer T25-Zellkulturflasche mit einer elektrohydraulischen Stoßwellentherapiesystem behandelt. Behandlungsparameter waren eine Energieflussdichte von 0,1 mJ / mm 2 und einer Frequenz von 5 Hz ist. 300 Impulse wurden aus einer Entfernung von 5 cm von der Stoßwellenquelle zu der Zellschicht aufgetragen. Genexpression von Tie-2 (Tyrosinkinase mit Immunglobulin-ähnliche und EGF-ähnlichen Domänen 2)-mRNA wurde durch Echtzeit-PCR-Analyse gemessen. Es war über die Zeit signifikant hochreguliert (2 h nach der SWT: 156,75 ± 14,49, 4 Std.: 141,03 ± 9,71, 6 Std.: 166,68 ± 2,15, p &lt;0,05 vs CTR: 100,03 ± 7,5) 5B. Diese Angiopoietin-Rezeptor gibt einen direkten Hinweis auf Endothelzellen c<html> ell Proliferation und ist ein Indikator für die Fähigkeit zur Angiogenese. Als Positivkontrolle verwendeten wir Poly (I: C) (Polyinosin Polycytidylsäure), die als RNA-Struktur analog ist bekannt, dass Endothelzellen (2 h nach der SWT stimulieren: 125,7 ± 10,08, 4 Std.: 191,73 ± 5,15, 6 Std.: 400,93 ± 19,62, p &lt;0,05 vs CTR: 103,65 ± 6,18) 5A. Ein Zytokin-Array wurde 48 Stunden nach der Behandlung durchgeführt, um zu analysieren Haupt inflammatorischen Zytokinen IL-6 (59,97 ± 1,24, p &lt;0,05 vs CTR 19,00 ± 0,44) und IL-8 (71,89 ± 1,52, p &lt;0,05 vs CTR 29,50 ± 0,87 ), die im Wesentlichen in der frühen Angiogenese beteiligt sind. Beide wurden in der Behandlungsgruppe signifikant erhöht, wie durch die Zytokin-Array nach Fig. 5C und 5D gezeigt Quantifizierung. ighres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51076/51076fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schockwellen direkt auf eine Zellkulturflasche aufgebracht. Fast 99% der Wellen zu bekommen an der Rückwand des Kolbens, wodurch Zellen und kommenden Wellen verursacht körperliche Störungen reflektiert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51076/51076fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51076/51076fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51076/51076fig2.jpg" /> Abbildung 2. Phasenverschiebung der Wellen an Wasser, um Luftdurchlass. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51076/51076fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" fo:c<html> NHALT-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51076/51076fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Interferenz zwischen Rücken läuft und ankommenden Wellen auftreten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51076/51076fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51076/51076fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51076/51076fig4.jpg" /> Abbildung 4. Abgebildet ist das IVSWT Wasserbad mit Beschreibung der wichtigsten Teile. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51076/51076fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> es/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51076/51076fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5 (A) HUVECs mit dem TLR-3-Agonisten und RNA-Struktur analogen Poly stimuliert.. (I: C) und (B) Tie-2-mRNA-Expression von Stoßwellen stimuliert HUVECs klar, das eine deutliche Steigerung in der Zellproliferation Daten gegeben sind als relative mRNA-Expression, Mittelwert ± SEM. (C) Ergebnisse der Zytokin-Array mit erhöhten Werten von IL-6 und IL-8. (D) Quantifizierung der Darstellung der Ergebnisse (Pixeldichte) von Zytokin-Array, Mittelwert ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51076/51076fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 6/51076fig6highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51076/51076fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. Schema für Pilotversuch, um die perfekte Behandlungsparameter für den jeweiligen Zelltyp zu identifizieren. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51076/51076fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Shock Wave Application to Cell Cultures

Stoßwellen sind heute bekannt für ihre regenerierende Wirkung bekannt. Daher in vitro-Experimenten sind von zunehmendem Interesse. Wir haben daher ein Modell entwickelt, für die in vitro-Studien Schockwelle (IVSWT), die es uns ermöglicht, in vivo-Bedingungen dadurch vermeiden störende physikalische Effekte zu imitieren.

Shock Wave Anwendung auf Zellkulturen

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

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Serie: Shock Wave Application to Cell Cultures

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

Einem mikrofluidischen System mit Oberflächenstrukturierung zur Untersuchung Kavitationsblase (e) -Cell Interaktion und die Resultierende Bioeffects auf der Ebene einzelner Zellen

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such blast-induced injuries is of great importance considering the recent trend towards the use of explosives in modern warfare and terrorist-related incidents. To fully understand blast-induced injury, we must first be able to replicate such blast events in a controlled environment using a reproducible method. In this technique using shock tube equipment, shock waves at a range of pressures can be propagated over live cells grown in 2D, and markers of cell viability can be immediately analyzed using a redox indicator assay and the fluorescent imaging of live and dead cells. This method demonstrated that increasing the peak blast overpressure to 127 kPa can stimulate a significant drop in cell viability when compared to untreated controls. Test samples are not limited to adherent cells, but can include cell suspensions,&#160;whole-body and tissue samples, through minor modifications to the shock tube setup. Replicating the exact conditions that tissues and cells experience when exposed to a genuine blast event is difficult. Techniques such as the one presented in this article can help to define damage thresholds and identify the transcriptional and epigenetic changes within cells that arise from shock wave exposure.

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Understanding how cells are modulated by exposure to shock waves can help identify the mechanisms behind injuries triggered from blast events. This protocol uses custom-built shock tube equipment to apply shock waves at a range of pressures to cell monolayers and to identify the subsequent effects on cell viability.

Bewertende primäre Explosion Effekte In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Biologie

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

Medizin

Exosome Isolation after in vitro Shock Wave Therapy

Shock wave therapy is routinely applied in orthopedic indications including tendinopathies such as lateral epicondylitis (tennis elbow) and Achilles tendinitis (heel spurs) as well as non-healing wounds and bones. Despite different pathologies, the combination of an angiogenic and an anti-inflammatory effect of shock wave therapy leads to regeneration in soft tissue and bones. In over 30 years of clinical application, no side effects were observed. Furthermore, basic research even revealed regenerative effects on ischemic myocardium.
In a previous work we could show that the mechanical stimulus of cultured cells is translated via an exosome release into a biological response. However, the exact mechanism remains to be elucidated. Mechanical coupling is crucial when applying shock wave therapy as even small air bubbles can absorb shock waves. The previously described water bath method is a valid method to guarantee adequate and reproducible shock wave application in vitro.
We were able to develop a feasible and replicable protocol to isolate exosomes from cultured cells after shock wave application. Thereby we demonstrate a possibility to study underlying mechanisms of mechanotransduction as well as the regenerative and angiogenic potential of shock wave released exosomes.

Exosomes are released upon in vitro application of shockwaves. Here, we describe how to apply shockwaves on cultured endothelial cells and subsequently isolate exosomes for further investigation.

Shock wave therapy is routinely applied in orthopedic indications including tendinopathies such as lateral epicondylitis (tennis elbow) and Achilles ...