Wir danken der Whitehall Foundation aufrichtig für ihre finanzielle Unterstützung und Start-up-Mittel vom Scripps Research Institute für die Durchführung dieser Arbeit.

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica
<ol><li>Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten.</li>
	<li>Isolierung von Bauchganglien.<ol>
<li>Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl2 Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres).</li>
		<li>Identifizieren Sie das Bauchganglien basierend auf seiner Position im zentralen Nervensystem24,28.</li>
		<li>Entfernen Sie die Ganglien durch chirurgische Operation und lagern Sie sofort in künstlichem Meerwasser bestehend aus 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3und 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protease-Behandlung.<ol>
<li>Inkubieren Bauchganglien für 30 min bei 34 °C±0,5 in einer Petrischale mit 0,1% Protease (Dispase) in ASW beschrieben oben beschrieben. HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protease muss mit dem Alter und Gewicht der Tiere standardisiert werden. Im Allgemeinen würden ältere und größere Tiere mehr Protease benötigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernung von Ganglienscheide.<ol>
<li>Nach der Enzymbehandlung die Ganglien auf die Sylgard-Silikonbasis einer Zellkammer (= 1 cm; Vol. = 0,3 ml) festsetzen und mit ASW (Durchflussrate: 150 l/min) bei Raumtemperatur (18 °C±2 ) durchdringen. HINWEIS: Um die Sichtbarkeit der identifizierten Neuronen zu erhöhen, legen Sie das Ganglien auf die Oberseite eines Polycarbonat-Glaszylinders (Abbildung 1) (Durchmesser = 2 mm modifizierte Zellkammer), die mit einem binokularen Stereomikroskop mit 20-facher und 40-facher Vergrößerung leicht von unten beleuchtet werden kann.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig den Mantel aus dem Ganglion mit Zangen und Mikroschere.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung von zwei Neuronen.<ol>
<li>Identifizieren Sie Neuron von Interesse.</li>
		<li>Impale das Neuron mit einer einzigen intrazellulären scharfen Mikroelektrode mit Widerstand 10-15 M, gefüllt mit 3 M KCl-Lösung.</li>
		<li>Aufzeichnen der neuronalen Aktivität (10 kHz Bandpass) mit einem intrazellulären Aufzeichnungssystem.</li>
		<li>Verarbeiten Sie die Aufzeichnungsdaten mit einer elektrophysiologischen Software wie Axograph. HINWEIS: Man kann leicht Aufnahmen von mehreren Neuronen durchführen. Die Neuronen L7, L11 oder R15 und R2 lassen sich anhand ihrer Position leicht identifizieren. Für die gleichzeitige Aufnahme von zwei L7- und R15-Neuronen werden zwei Verstärker und zwei Mikromanipulatoren benötigt (Abbildung 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drogenanwendung.<ol>
<li>Tragen Sie ein Medikament der Wahl durch sanftePipettierung oder direkte Injektion in Neuronen in die Zellkammer auf.</li>
		<li>Führen Sie elektrophysiologische Messungen durch. HINWEIS: Je nach versuchsweisem Ziel könnte man verschiedene elektrophysiologische Parameter von Neuronen messen, wie z. B. die Veränderungen des Membranpotenzials (MP) oder des Aktionspotentials (AP) vor, während und nach der Anwendung des Arzneimittels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolierung einzelner Neuronen.<ol>
<li>Am Ende der elektrophysiologischen Experimente, stoppen Sie die Perfusion von ASW und waschen Sie das Ganglien mit 100% Ethanol.  Die Exposition gegenüber Ethanol versteinert die Neuronen und macht es mit feinen Zangen einfach, einzelne Neuronen zu entfernen, ohne andere Neuronen aus dem Ganglion zu beschädigen.</li>
		<li>Entfernen Sie einzelne Neuronen unter einem Stereomikroskop und übertragen Sie sie in eine kleine Eppendorf-Röhre, die eiskaltes 500-l-RNA-Extraktionsreagenz enthält. Isolierte Einzelneuronen können für zukünftige Analysen in RNA-Extraktionsreagenz bei -80 °C gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA-Isolation aus Einzelnen Neuronen und Genexpressionsanalyse durch quantitative Real Time PCR (qPCR)
<ol><li>Vorsichtsmaßnahmen zur Minimierung des RNA-Abbaus: Ribonukleasen (RNasen) abbauen die RNA und sind sehr stabile und aktive Enzyme. Führen Sie die folgenden Schritte bei der Behandlung von RNAs aus.<ol>
<li>Reinigen Sie den Arbeitsbereich und die Instrumente mit RNase-Deaktivierungsmitteln.</li>
		<li>Tragen Sie beim Umgang mit RNA jederzeit Handschuhe und wechseln Sie oft handschuhe.</li>
		<li>Verwenden Sie nur RNase-freie Kunststoffe, um RNAs zu handhaben.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung der Total-RNA aus einzelnen Neuronen:<ol>
<li>Standard-Trizol-Protokoll für RNA-Isolierung kann verwendet werden, um RNAs aus einzelnen Neuronen zu isolieren. Kurz 20% v/v Chloroform zu Trizol hinzufügen, durch kurzes Wirbeln gut vermischen.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre 10 min bei 4 °C auf den Rotator. Die Trizol-Chloroform-Mischung bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C drehen.</li>
		<li>Sammeln Sie die wässrige Phase und übertragen Sie in ein frisches Rohr.</li>
		<li>Natriumacetatlösung (pH 5.5) zu einer Endkonzentration von 0,3 M, 100 ng/ml des Coprecipitantglycos GlycoBlue und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzufügen, um DIE RNA auszufällen.</li>
		<li>Mischen Sie die Proben gut und brüten Sie bei -80 °C über Nacht.</li>
		<li>Drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C und ein kleines blaues Pellet wird an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.</li>
		<li>Den Überstand entfernen und das Pellet mit 850 l 75% eiskaltem Ethanol bei 12.000 x g 10 min bei 4 °C waschen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und trocknen Sie das RNA-Pellet für maximal 7-10 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die RNA nicht lange zum Trocknen als über- dasTrocknen des RNA-Pellets macht die Löslichkeit sehr schwierig.
</li>
		<li>Nach dem Trocknen setzen Sie das RNA-Pellet in 10 l RNAs freies Wasser wieder auf und bestimmen die RNA-Konzentration. HINWEIS: Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Wenn Sie die RNA nicht sofort verwenden, lagern Sie die RNA bei -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>aRNA-Synthese aus einzelnen Neuronen:<ol>
<li>Amplizieren Sie die RNA (eine oder zwei Runden je nach experimentellem Ziel) mit dem handelsüblichen linearen RNA-Verstärkungssystem. HINWEIS: Die gesamte RNA aus einzelnen Neuronen reichte von 10-60 ng. Die erwartete Ausbeute der ersten Amplifikationsrunde beträgt 100-300 ng und die zweite Verstärkerrunde beträgt 0,8-1,5 g RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Reverse Transkription der RNA:<ol>
<li>Um cDNA aus aRNA zu erzeugen, verwenden Sie 1,0 g aRNA in 20 l einer umgekehrten Transkriptionsreaktion. Mehrere Kits sind für diesen Zweck im Handel erhältlich. HINWEIS: cDNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll unter Verwendung der folgenden Einstellungen auf Thermocycler synthetisiert. 5 min bei 25 °C 30 min bei 42 °C 5 Min. bei 85 °C Halten bei 4 °C</li>
		<li>Nach dem umgekehrten Transkriptionsschritt die cDNA bei -20 °C für eine Langzeitlagerung aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Primer-Design und Standardisierung: Für die Entwicklung von Primern für Echtzeitverstärkungen stehen ihnen kostenlos mehrere hervorragende Softwareprogramme zur Verfügung.<ol>
<li>Wählen Sie 18-24 mer Oligonukleotide, die 70-110 bp Amplicons produzieren und die Primer mit kommerziellen Quellen synthetisieren. HINWEIS: Für jedes Gen von Interesse sollten zwei bis drei Primerpaare entworfen werden. Jeder Primer-Satz muss durch qPCR standardisiert werden. Die Vorwärts- und Reverse-Primer-Paare, die für das Gen CREB1 (Abbildung 4) verwendet wurden, sind unten: Primer-Set 1 Vorwärts: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAAGA-3' Rückseite: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Primer Set 2 Vorwärts: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Umgekehrt: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Um den besten Primer auszuwählen, der für die nachgeschalteten Analysen verwendet werden soll, überwachen Sie den Ct-Wert und die Form der Amplifikationskurve in qPCR. HINWEIS: Primer, die Ct-Werte (Zyklusschwelle) zwischen 10-35 in der 40-Runden-Verstärkung und glatte Kurven während der exponentiellen Phase der PCR geben, gefolgt von einem glatten Plateau, sind optimal für Genexpressionsanalysen.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantitative Real Time PCR (qPCR): Hinweis: Verwenden Sie geeignete Rohre oder Platten, die mit der qPCR-Maschine kompatibel sind.<ol>
<li>CDNA mit nukleasefreiem Wasser auf 5x verdünnen.</li>
		<li>Fügen Sie auf 2 l verdünnte cDNA 8 l eines qPCR-Master-Mix hinzu, der 2 lH 2O, 5 l 2x SYBR Green Master-Mix und 1,0 l von 10 m (jeweils) vorwärts und rückwärts grundiert.</li>
		<li>Schließen Sie die Rohre und versiegeln Sie die Platte nach dem Pipetieren cDNA und Master-Mix. Mischen Sie den Inhalt durch sanftes Antippen und Abdrehen bei 1.500 U/min für 30 Sek.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Einrichtung des qPCR-Computers fort.</li>
	</ol></li>
</ol>

Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemenbeteiligt 30. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität konnte kontinuierlich überwacht werden. So könnte man die elektrophysiologischen Wirkungen einer kurzen Neurotransmitter-Exposition (lokal einem bestimmten Neuron oder dem Bad ausgesetzt) über einen längeren Zeitraum untersuchen. Darüber hinaus könnte man die Auswirkungen der Exposition gegenüber mehreren Neurotransmittern (gleichzeitig oder im Tandem) auf das gleiche Neuron auf die Feuereigenschaften von sich selbst oder dem Follower-Neuron oder beidem untersuchen.
Ein Beispiel für Genexpressionsmessungen durch qPCR ist in Abbildung 4dargestellt. Da der RNA-Gehalt eines einzelnen Neurons gering ist, ist eine In-vitro-Verstärkung notwendig, um eine ausreichende Menge an RNA für die Quantifizierung der Expression mehrerer Gene zu erhalten. Kommerzielle Kits sind für den In-vitro-Transkriptionsprozess verfügbar. Die Verstärkung des CREB1-Transkripts wurde direkt durch die Anzahl der Zyklen quantifiziert, die erforderlich sind, um ein standardisiertes Fluoreszenzsignal, die Ct-Methode31,zu erhalten. Die verstärkte RNA aus einem einzelnen Neuron reicht aus, um Genexpressionsänderungen in einer großen Anzahl von Genen mit Mikroarray32 und für das gesamte Transkriptom durch RNAseq-Analysen33zu bestimmen.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass diese Vorbereitung nicht alle synaptischen Verbindungen der Neuronen der Bauchganglien bewahren kann. Mehrere der Neuronen bilden Synapsen mit Neuronen in anderen Ganglien und in der Ganglienvorbereitung werden diese Fernverbindungen verpasst. Die hier beschriebene Methodik könnte jedoch leicht an das gesamte ZNS angepasst werden oder leicht in die halbintakte Zubereitung13,14,16 integriert werden, die beschrieben wurde, um zelluläre und elektrophysiologische Veränderungen des Kiemen- und Siphon-Entzugsreflexes zu untersuchen.
Jüngste Fortschritte in den Genomik-Techniken ermöglichen es uns nun, einen tiefen Einblick in die Dynamik der Expression von codierungs- und nicht kodierenden RNAs34zu erhalten. Die hier beschriebene reduzierte Präparation ist ideal für die Untersuchung zeitlicher Veränderungen der Genexpression in Verbindung mit elektrophysiologischen Messungen. Zum Beispiel könnte man pharmakologische Wirkstoffe anwenden und ihre Auswirkungen auf die elektrischen Eigenschaften einzelner Neuronen oder mehrerer Neuronen messen, die Teil derselben neuronalen Schaltkreise sind, und einzelne Neuronen zu unterschiedlichen Zeiten für die RNA-Isolierung isolieren. Die Wirkung der Manipulation eines einzelnen Neurons (z. B. elektrische Stimulation oder Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen) auf die gesamte identifizierte Schaltung könnte auf der Ebene von Veränderungen in der Expression bestimmter Gene in einzelnen Neuronen untersucht werden. So erleichtert diese Methode die erfolgreiche Integration elektrophysiologischer und genomischer Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise in Aplysien.
Dieser Ansatz könnte leicht auf die Untersuchung anderer wirbelloser Modelle wie Nacktschnecken-Tritonia, Teichschnecke Lymnaea und terrestrische Schnecke Helix ausgedehnt werden, deren Nervensystem mehrere identifizierte Neuronenenthält 35-57. Diese Modelle werden auch ausgiebig für die Untersuchung der neuronalen Steuerung von Verhaltensweisen wie Fluchtschwimmen, Magnetfeldorientierung, Synapsenbildung, Lernen und Speicherverwendet. Die von uns beschriebene Methodik ist eine einfache Integration der Genomanalyse mit physiologischen Messungen der neuronalen Aktivität auf Einzelzellebene. Aus solchen Studien konnte ein tieferer Einblick in die molekularen und physiologischen Grundlagen der neuronalen Verhaltenskontrolle gewonnen werden.

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der molekularen Verhaltensgrundlagen und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für neuropsychiatrische Störungen erheblich erleichtern.
Die Meeresschnecke Aplysia californica war ein Arbeitspferd zur Bestimmung neuronaler Schaltkreise, die spezifischen Verhaltensweisen zugrunde liegen1-14. Das Aplysia Nervensystem enthält etwa 20.000 Neuronen, die in 9 verschiedene Ganglien organisiert sind. Die Neuronen von Aplysia sind groß und können leicht anhand ihrer Größe, elektrischen Eigenschaften und Position in den Ganglien identifiziert werden. Aplysia hat ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen, die studiert werden können. Eines der gut untersuchten Verhaltensweisen ist der Kiemen-Entzugsreflex (GWR). Die zentralen Bestandteile dieses Reflexes befinden sich in Bauchganglien. Komponenten der GWR-Schaltung wurden kartiert und Beiträge verschiedener Komponenten ermittelt. Wichtig ist, dass GWR-Schaltungen assoziatives und nichtassoziatives Lernen durchlaufen5,6,15-19. Jahrzehntelange Studie über diesen Reflex haben auch mehrere Signalwege identifiziert, die eine Schlüsselrolle beim Lernen und Gedächtnis20-24haben.
Mehrere verschiedene Präparate von Aplysia wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Grundlagen der Speicherspeicherung zu studieren. Dazu gehören das intakte Tier2,3, halbintakte Zubereitung1,7,13,14,16 und Rekonstitution von Hauptkomponenten der neuronalen Schaltung25-29. Hier wird eine reduzierte Vorbereitung auf die Erforschung von Aplysia-Ganglien für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen identifizierter neuronaler Schaltkreise beschrieben. Die folgenden vier identifizierten Neuronen wurden untersucht. R15, ein platzendes Neuron, L7 und L11, zwei verschiedene motorische Neuronen und R2, ein cholinerge Neuron wurden untersucht. R2 ist das größte Neuron, das im wirbellosen Nervensystem beschrieben wird. Kurz gesagt, beinhaltet diese Methode protease Behandlung von Ganglien, elektrophysiologische Messungen vor und nach pharmakologischen Behandlungen, und Isolierung von einzelnen Neuronen für die quantitative Analyse der Genexpression. Diese Methode ermöglicht es uns, molekulare Analysen mit gleichzeitiger Aufzeichnung von mehreren Neuronen zu kombinieren. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Reaktionen von R15 und L7 Neuronen auf Acetylcholin (Ach) durch gepaarte intrazelluläre Aufnahmen zu studieren. Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15 und L7 und andere identifizierte Neuronen wie L11 und R2 für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Expression von CREB1 isoliert, einem Transkriptionsfaktor, der für die Speicherspeicherung wichtig ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden.
Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -dauern verwendet und platzende Wirkungspotentiale aus R15-Neuronen wurden26,31registriert. Diese Messungen wurden mit direkten (ohne Proteasebehandlung) Aufnahme von den intakten Ganglien verglichen. In den folgenden Experimenten wurden die Konzentration der Protease (0,1% Protease, siehe Schritt 1.3) verwendet, die Berstpotentiale erzeugte, die mit denen vergleichbar waren, die aus exponiertem Ganglion ohne Protease gewonnen wurden.
Mit dem beschriebenen Protokoll wurden Aktionspotentiale (AP) als Reaktion auf die Ach-Exposition gegenüber R15, einem cholinergen Neuron und L7, einem motorischen Neuron, das nicht auf Ach reagiert, aufgezeichnet. Wie erwartet zeigen simultane elektrophysiologische Aufnahmen, dass Ach eine Depolarisation in R15 induziert, während sich beim Brennen von L7 nichts änderte. Abbildung 2 zeigt die Anwendung von Acetylcholin (Ach) direkt in die Zellkammer. 1 M Ach (Volumen 0,3 l) wurde direkt mit Mikropipette in die Kammer aufgetragen, um eine endgültige Konzentration von 1 mM innerhalb der Kammer zu erhalten.
Ach wurde durch Perfusion aus dem Bad abgewaschen und von R15-Neuronen wieder aufgenommen. Abbildung 3 zeigt Wellenformen, die darauf hindeuten, dass der Ach-Effekt reversibel ist. Die Analyse der Parameter AP in der Steuerung, während der Depolarisation und nach dem Waschen wird gezeigt. Während der Depolarisation wird die Amplitude verringert und die Dauer des AP deutlich erhöht.
Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15- und L7-Neuronen isoliert und RNAs für qPCR-Analysen vorbereitet. Eine lineare T7-RNA-Polymerase-gesteuerte Transkription mit MessageAmp II aRNA Amplification Kit von Ambion wurde zur Verstärkung von RNAs aus einzelnen Neuronen verwendet. Zum Vergleich wurden auch die identifizierten Neuronen R2 und L11 sowie die gesamte Bauchganglien von Erwachsenen (6-9 Monate alt) und Jungtieren (1-2 Monate alt) untersucht. qPCR-Verstärkung wurde in einem 7900HT Fast Real-Time PCR System unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 15 Sek., 60 °C für 1 min. Es gab vier biologische Repliken in dem Experiment. Jede biologische Replikation hatte vier technische Replikationen im qPCR eingerichtet. Ct-Werte aus vier Replikationen wurden gemittelt und 1/Ct wurde berechnet, um den absoluten Ausdrucksgrad von CREB1 in jeder Stichprobe zu finden (Abbildung 4). Eine Schätzung der absoluten Expressionswerte des CREB1-Gens bei jungen und erwachsenen Aplysia-Ganglien und in vier identifizierten Einzelneuronen wurde durch den Ct-Wert überwacht, der aus qPCR-Messungen gewonnen wurde.
Die beginnende mRNA-Konzentration war bei jungen und erwachsenen Bauchganglien gleich. Das gleiche vorwärts und umgekehrte CREB1 Primer-Set wurden in allen qPCRs verwendet, sowohl in Studien mit Ganglien als auch in einzelnen Neuronen. Die Ct-Werte sind zwischen jungen und erwachsenen Bauchganglien sehr ähnlich. In ähnlicher Weise wurden Ct-Werte bei einzelnen Neuronen gemessen, bei denen die Anfangsgesamt-mRNA-Konzentrationen niedrig waren und zwei Verstärkerrunden eine gute Menge an RNAs für die cDNA-Synthese ergaben. Die Ct-Werte der CREB1-Verstärkung legten nahe, dass die CREB1-Expression in R15- und L7-Neuronen vergleichbar ist, während R2 und L11 signifikante Unterschiede in der Expression im Vergleich zu L7 oder R15 aufwiesen (Student es T test, p<0.05) (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig1.jpg"> Abbildung 1. Mikroskopstadium und Perfusionssystem für Ganglienelektrophysiologie. Perfusionssystem und -stufe wurden mit Plexiglas hergestellt und sind transparent. Dieses Setup ist auf einem Metallblock (nicht gezeigt) montiert, um Position zu halten. Der Metallblock ist so ausgelegt, dass Proben von unten beleuchtet werden können. Es wird ein elektrophysiologisches Berstmuster der Probe aus R15-Neuron gezeigt.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig2.jpg"> Abbildung 2. Gleichzeitige Aufnahme von L7 und R15 Neuron von Bauchganglien. (A) Karikatur von Bauchganglien, die die Position von L7- und R15-Neuronen zeigen (modifiziert von Kandel 2001, mit Genehmigung von AAAS nachgedruckt). Gezeigt werden auch die Positionen von R2 und L11 in den Bauchganglien. (B) Repräsentative intrazelluläre Aufzeichnungen aus L7 und R15. Pfeil gibt die Zeit der Ach-Anwendung an. Man könnte diese Messungen für 8-10 Stunden fortsetzen.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig3.jpg"> Abbildung 3. Ach induzierte Veränderungen des Aktionspotenzials (AP) von R15. AP-Wellenformen wurden vor, während und nach der Ach-Exposition analysiert. Repräsentative Wellenformen werden angezeigt. ms: Millisekunde, mV: Millivolt.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig4.jpg"> Abbildung 4. qPCR-Analyse der Expression von CREB1 in Abdominalganglien und einzelnen identifizierten Neuronen. (A) Absolute Quantifizierung der CREB1-Transkription in der jungen und erwachsenen Bauchganglien von Aplysia. Total RNA wurde mit dem Standard-Trizol-Protokoll isoliert, wie in den Methoden beschrieben. Zur Synthese von cDNA wurde 1 g der gesamten RNA verwendet, gefolgt von der Echtzeit-PCR-Verstärkung mit CREB1-Primern. (B) Absolute Quantifizierung der CREB1-Transkription in identifizierten Einzelneuronen der alten Aplysie. Die gesamte RNA wurde vor der cDNA-Synthese zwei Runden in vitro-Amplifikation unterzogen. Zur Synthese von cDNA wurde 1 g aRNA verwendet, gefolgt von der Echtzeit-PCR-Verstärkung mit CREB1-Primern.

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Aufrufe.  The Scripps Research Institute, Florida. Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Serie: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Einem mikrofluidischen-basierte Hydrodynamische Trap für einzelne Teilchen

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

Bewertung von Biomaterialien für Blasenvergrößerung mit Zystometrische Analysen in verschiedenen Tiermodellen

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Molekulare Verschränkung und Electrospinnability von Biopolymeren

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Herstellung von Silizium-Nanodraht-Feldeffekttransistor für chemische und Biosensorik Anwendungen

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Herstellung von extrazellulären Matrix Proteinfasern für Brillouin-Spektroskopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...