Die Autoren danken der Wake Forest Institut für Regenerative Medizin für ihre Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken für die Unterstützung durch Zuschüsse aus dem Great Ormond Street Hospital Nächstenliebe, die Stiftung Eugenio Litta (Genf, Schweiz), das Medical Research Council, dem Royal College of Surgeons of England, die Funken für Kinderheilnächstenliebe, des britischen Außenministeriums für die UK / USA Stammzell Collaboration Award und dem Forschungsfonds Mittal. Wir möchten auch, um die Royal Society / Wolfson-Stiftung für die für die Kinderchirurgie-Abteilung im Institut der Kind-Gesundheit erhalten Tissue Engineering Labor Sanierung Zuschuss danken. PDC und SE werden von der Great Ormond Street Hospital Kinderhilfswerk unterstützt.

1. Isolierung von Ratten-Darm <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus 1 L Phosphate Buffered Saline (Sigma, UK) mit 1% Antibiotikum / Antimykotikum (Sigma, UK) (PBS / AA). Setzen Sie die Schlauchpumpe (Masterflex L / S mit variabler Geschwindigkeit) mit zwei Röhren. Laufen 70% Ethanol (EtOH) durch die Rohre der peristaltischen Pumpe für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit, gefolgt von PBS / AA für weitere 15 min. </li><li> Euthanize erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ca. 250 bis 350 g CO 2 durch Einatmen und Genickbruch in Übereinstimmung mit den örtlichen Tier Richtlinien und Zulassungen (in Großbritannien, Home Office Leitlinien unter den Animals (Scientific Procedures) Act 1986). </li><li> Autoklaven werden die chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch. Spray und wischen Sie den Bauch des Tieres mit 70% EtOH. </li><li> Führen Sie eine xifo-Scham laparotomic Einschnitt auf dem Bauch, um eine klare OP-Feld zu gewährleisten. </li><li> Ausweiden des Dünndarms auf der rechten Seite des Tieres auf ein Papiertuch mit 70% EtOH besprüht. Take darauf, den Darm mit PBS / AA kontinuierlich zu benetzen, so daß die Dehydratisierung des Gewebes und Denaturierung der extrazellulären Matrix (ECM) zu vermeiden. </li><li> Finde die Arteria mesenterica superior (SMA), die sich in einem Winkel von 90 ° von der Aorta zu den Darm. Verwenden Sie eine 27 G Kanüle, um die SMA aus der Aorta geben und schnell die Nadel zurückziehen, um nicht zu zerreißen die Wand des Gefäßes. Schieben Sie die Kunststoffrohr der Kanüle in der SMA und sichern mit Nähten (Vicryl 5/0). </li><li> Kanülierung bestätigen durch die Injektion von 1 ml PBS / AA. Verwenden Feder Schere, um die Aorta proximal und distal zu dem SMA einzuschneiden, so daß die Kanüle freizugeben. </li><li> Leckage von Fäkalien zu verhindern, wenn die Zerlegung Dickdarm auftreten, legen (Seide 5/0) Nahtknoten auf dem proximalen Ende des ileocaecal-Übergang und einer an dem distalen Ende des Sigmas. Dann schneiden Sie die terminalen Ileum und Dickdarm zwischen den beiden Knoten und entfernen den Dickdarm. </li><li> Schneiden Sie den Darm an der jejuno-Zwölffingerdarm-Kreuzung einnd befreien den Darm von allen Bindegewebe es Verbindungen mit dem Bauch haben könnte. </li><li> Übertragen Sie den Dünndarm in einer Petrischale mit PBS / AA. Kanülieren den proximalen Darmabschnitt mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette (LSL Laborverbrauchsmaterialien) und befestigen Sie sie mit Nähten. Schneiden Sie die Pipette, damit es die Luer-Lok einer 60-ml-Spritze (BD Plastikpak) passen. Spülen Sie das Darmlumen 2x mit 60 ml PBS / AA Kot und Schmutz zu entfernen. </li></ol> 2. Dezellularisierung Methodik <ol><li> Verbinden des Gefäßkanüle nach einem Drei-Wege-Hahn. Dies wird Handhabung zu erleichtern, Spannung auf dem Gefäßbaum zu minimieren und Entfernung von Luftblasen aus dem Schlauch. </li><li> Start läuft VE-Wasser (Widerstand 18,2 MOhm / cm) durch die Masterflex L / S mit variabler Geschwindigkeit Rollenpumpe bei 0,6 ml / h. Achten Sie darauf, keine Blasen im Schlauch vor dem Verbinden mit dem Darmlumen Hahn vorhanden sind. Einige Blasen können im Lumen von Schritt vorhanden sein1.9, die die Dezellularisierung Prozess beeinträchtigen können. Variieren der Geschwindigkeit der Pumpe und der Griff des Gewebes mit einer Pinzette vorsichtig, um die Blasen Ausgang von dem distalen Ende zu gewährleisten. Den Kreislauf-Kanüle an, solange dieser Prozess abgeschlossen ist, da hohe Drehzahlen können die Gefäßbaum zu beschädigen. </li><li> Übertragungsvorrichtung in den Kühlraum, da der nachfolgende Schritt der Dezellularisierung wird bei 4 ° C durchgeführt wird Die niedrige Temperatur erlaubt die Entfernung von Zellen, Gewebe, während Zersetzung zu minimieren. Legen Sie die Petrischale in einem Container, der die überquell Lösung sammeln. Perfusion sowohl das Darmlumen und Gefäßbaumes mit entionisiertem Wasser (spezifischer Widerstand 18,2 M &amp;OHgr; / cm) für 24 Stunden bei 0,6 ml / Std. Für die erste Stunde überprüfen das Gerät regelmäßig, um sicherzustellen, dass alle Verbindungen sicher sind, ist Leckage minimal und keine Luftblasen im Darm vorhanden sind. </li><li> Nach 24 Stunden der Behandlung mit VE-Wasser, bewegen Dezellularisierung Gerät außerhalb des Kühlraums wie der Rest der die Schritte sindin Raumtemperatur (RT) durchgeführt. </li><li> Wiegen Natriumdeoxycholat (Sigma, UK) zu 300 ml einer 4% igen Lösung in VE-Wasser vorzubereiten. Wiegen Natriumdeoxycholat unter einer Abzugshaube, da es eine mündliche und Augenreizstoff. Mischen Sie mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Die Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 Monat aufrechterhalten werden. </li><li> Ändern Sie den VE-Lösung Natriumdeoxycholat, überprüfen Sie die Verbindungen, entfernen Sie alle Blasen und Perfusion bei 0,6 ml / h für 4 Stunden. </li><li> Nach dem Natriumdesoxycholat Waschschritt mit PBS / AA für 30 min, um die Interaktion zwischen dem Natriumdesoxycholat und DNase-I zu vermeiden. </li><li> Wiegen Sie Desoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) und bereiten 250 ml einer 2.000 kU Lösung in 1 M Natriumchlorid, pH 7,4. Mischen Sie mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Diese Lösung ist unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden und können nicht gespeichert werden. </li><li> Perfusion mit DNase-I für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml / Std. </li><li> Nach der DNase-I-Stufe, die übertragenGerüst in einer Gewebekultur Kapuze und ändern Platten und Instrumente. Es wird vorgeschlagen, aseptisch. </li><li> Waschen mit PBS / AA 30 min zu gewährleisten, dass alle Reste der Dezellularisierung Lösungen entfernt werden. Legen Sie das Gerüst in eine neue Petrischale übertragen und mit einer UV-Crosslinker (Spectroline, US). Führen Sie zwei Sterilisationszyklen. Bewahren Sie in 5% PBS / AA und ändern Sie die Lösung alle 3 Tage. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die schwierigsten Schritte bei der Einrichtung dieses Experiment beinhalten die Kanülierung der SMA und die Errichtung und Wartung von Sterilität. Kanülierung des SMA bei Nagern ohne Zerreißen der Wand kann ziemlich schwierig aufgrund der Größe und Position des Schiffes sein. Alternativ kann ein Nahtmaterial um den proximalen Aorta vor der SMA Herkunft angeordnet werden, gefolgt durch Kanülierung der Aorta selbst distal Leiten des Kunststoffkanüle in die SMA. Während Dezellularisierung eine Kombination von schlechter Kanüle Platzierung und hohe Durchflussraten in den Gefäßzugang zu verlieren, führen. Sterilität ist ein großes Problem wegen der Menge der im Dünndarm vorhanden Bakterienflora. Waschen mit PBS / AA nach der Ernte ist sehr wichtig, und jedes Zeichen von Fäkalien oder Verunreinigungen müssen aus dem Hohlraum entfernt werden. Anordnen eines Teils des Gerüstes in ein Falcon-Röhrchen mit DMEM in den Inkubator nach UV-Sterilisation sollte ein Indikator sein, wenn Sterilität erreicht. Im Falleder bakteriellen Besiedlung, wird die Medien den pH-Wert mit seiner Farbe Drehen von rot nach gelb ändern. Um damit umzugehen, sind weitere UV-Zyklen, wie gut beraten wie Waschen mit PBS, das eine hohe Konzentration an Antibiotikum / Antimykotikum. Eine mögliche Änderung an ein Gerüst sowohl mit Gefäß-und Venenzugang zu erhalten, wäre es, die untere Hohlvene (IVC) sowie die SMA kanülieren. Dezellularisierung aus den Venen-und Gefäß Seiten sollten intermittierend für alle drei Lösungen versucht. Kontinuierliche Dezellularisierung können die Kapillaren mit positiven Druck auf beiden Seiten platzen. Im Laufe der Jahre gab es zahlreiche Versuche im Darm TE unter Verwendung verschiedener Zellgerüst-Kombinationen in vitro und in vivo 6,9,12. Der Großteil der Arbeit wurde durchgeführt unter Verwendung von rohrförmigen Vliesstoff 95% PGA-5% PLGA Gerüste mit Kollagen Typ I beschichteten 6,7,13,22. Nach der Aussaat mit DarmEpithelzellen organoiden Einheiten (OU) und eine Periode der Implantation in das Netz von Mäusen, Zysten bilden sie mit Muskel auf der Außenseite und Epithel auf der Innenseite der dann tubularized werden können. Allerdings ist die Porosität und die Einfachheit in der Konstruktion dieser Gerüste ermöglicht nicht für die Erzeugung von großen Stücken von Kunstdarm in einem in vitro-Umgebung wie der eines Bioreaktors. Zusätzlich kann das Fehlen einer angeborenen Gefäßnetz, die an den Empfänger weiter verbunden werden können, begrenzt die Verwendung dieses Gerüst für klinische Übersetzung. Neben den Versuchen mit den PGA-PLGA Gerüste haben andere Gruppen SIS Kollagen oder Gerüste, die beide nicht die Komplexität des Darmtrakts verwendet replizieren. SIS ist vor allem der bisher einzigen veröffentlichten Methodik der Darmgewebetechnik und hat in mehr als 150 medizinischen Einrichtungen eingesetzt worden, was die Fähigkeit der dezellularisiertes Gerüste auf mechanische Stabilität und fördern das Zellwachstum, während Bleiten zu keiner Immunreaktion. Doch der Mangel an passenden Makro-und Mikro-Architektur, hat schlechte Ergebnisse in ihrem &quot;Einsatz für die Darm TE Zwecke 9-11,23 geführt. Die Vorteile der Dezellularisierung Methodik, die wir beschrieben haben, gehören die Erhaltung der mikroskopischen Eigenschaften wie der Lumen Krypta-Zotten-Architektur, die ein geeignetes Umfeld für die Wiederbevölkerung repräsentieren durch die Darmstammzellnische. Im makroskopischen Aspekt wird das Vorhandensein eines hierarchischen Gefäßnetz ermöglichen die Befestigung an den Empfänger, so dass Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff zu allen Schicht des TE 21-Darm. Darüber hinaus hat die Aufrechterhaltung der ECM-Komponenten wie Kollagen, Elastin und glyocosaminoglycans eine wichtige Rolle nicht nur mechanische Eigenschaften, sondern auch die zelluläre Proliferation und Differenzierung lenken. Am wichtigsten ist, die Fähigkeit der Dezellularisierung Methodik in große skaliertr Gewebe unter Beibehaltung der gleichen Eigenschaften ist ein wichtiges Merkmal für die klinische Umsetzung von TE. Die Entwicklung eines natürlichen Darmmatrix mit einer Gefäßnetz ermöglicht die Erstellung von größeren Segmente der künstlichen Darm, die mit dem Host verbunden werden.

Tissue Engineering (TE) bietet eine therapeutische Alternative zur Organtransplantation, unter Umgehung Fragen der Immunsuppression und Organknappheit. TE hat vor kurzem erfolgreiche Anwendungen in der Klinik, mit dem Austausch von Organen wie der Blase 1, 2 Harnröhre und der Luftröhre, sowohl bei Erwachsenen und Kindern 5 3,4. Aufbau einer Tissue-Engineering Organ erfordert die Kombination aus einem Gerüst mit den entsprechenden Zellen. Ein Gerüst kann unter Verwendung von natürlich-abgeleiteten (z. B. Kollagen) hergestellt werden, und synthetische (z. B. Poly-L-Glykolsäure; PLGA)-Materialien oder durch die Dezellularisierung von nativem Gewebe und Organen erhalten werden. Gerüste, die bisher für die Darm TE verwendet wurden, waren hauptsächlich entweder dezellularisierte (Dünndarm-Submukosa) oder synthetischen (Poly-L-Glykolsäure und Poly-Milchsäure) 6-13. Diese Biomaterialien sind sehr einfach sowohl in der Makro-und Mikro-Architektur, diemöglicherweise nicht ideal sein, wenn Gewebezüchtung Darm ist klinisch übersetzt werden. Eine optimale Biomaterial für den Darm sollte eine angeborene Gefäßbaum, die der Host-Blutversorgung, einer abgestuften Rohrwand mit unterschiedlichen Eigenschaften, die Schichten der Darmwand zu reflektieren und einer Zotten-crypt-Achse auf der luminalen Seite verbunden werden können, um mit Hilfe haben Wiederbesiedlung von epithelialen Stammzellen. Dezellularisierung ist eine neuartige Methode, die Gerüste produziert, indem sie Zellen aus Voll Organe unter Wahrung ihrer ursprünglichen Architektur 14. Dies ist bevorzugt, um bereits bestehende Gerüste, da sie nicht nur die Struktur des Organs zu replizieren, sondern auch enthalten chemische Signale in der extrazellulären Matrix (ECM), dass die Hilfe zelluläre Proliferation und Differenzierung eingebettet. Im Jahr 2008 wurde ein Leichenluftröhre dezellularisiert 14, mit patienteneigenen Zellen besiedelt und transplantiert werden, um die wichtigsten linken Bronchus bei einem jungen Mann zu ersetzen <sup&gt; 3. Seitdem haben eine Reihe von Gruppen die Produktion von dezellularisiertes Gerüste für das Herz 15, Leber 16,17 und Lunge 18-20 in kleinen und großen Tieren berichtet. Wir haben auch die gleiche Methode, um eine kleine Darm dezellularisiertes Gerüst 21 produzieren angepasst. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist die dezellularisierte Darm Matrizen, die die makroskopischen Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, wie die Blutzufuhr als auch die mikroskopische Architektur der Zotten-Kryptenachse im Darmlumen aufrechtzuerhalten erzeugen. Wir glauben, dass diese Methode könnte letztlich für andere Organe angenommen, um die Effizienz der Dezellularisierung verbessern.

<table><tbody><tr><td>Ethanol solution, 70% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Oral and eye irritant; use protection</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

Erfolgreicher Gewebetechnik beinhaltet die Kombination von Gerüsten mit den entsprechenden Zellen in vitro oder in vivo. Gerüste können synthetisch, natürlich gewonnenen oder aus Geweben / Organen abgeleitet ist. Letztere werden unter Verwendung einer Technik, die Dezellularisierung erhalten. Dezellularisierung kann es sich um eine Kombination von physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden. Das Ziel dieser Technik ist es, alle zellulären Spuren unter Beibehaltung der Makro-und Mikroarchitektur des ursprünglichen Gewebes zu entfernen. Darmgewebetechnik bisher verwendeten relativ einfache Gerüste, die die komplexe Architektur der nativen Organ nicht replizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist es, eine effiziente Technik zur Dezellularisierung Rattendünndarms zu beschreiben. Die Isolierung des Dünndarms, um die Aufrechterhaltung einer Gefäßverbindung sicherzustellen beschrieben. Die Kombination von chemischen und enzymatischen Lösungen, um die Zellen zu entfernen whilst Erhaltung der Zotten-crypt-Achse in der luminalen Aspekt des Gerüsts wird auch eingestellt. Schließlich Beurteilung der hergestellten Gerüste für entsprechende Eigenschaften wird diskutiert.

Nach erfolgreicher Dezellularisierung (Fig. 1) ist das Gerüst eine makroskopische Aussehen ähnlich dem des nativen Darm, aber mit durchlässige Wände (2A). Die Erhaltung der Makro-Architektur sollte auch klar sein, von der Durchgängigkeit der Gefäßbaum. Wenn Farbstoff wird durch die Kanüle injiziert SMA sollte gleichmäßig im Gerüst verteilt und erreichen die kapillare Struktur (2B). Das Gerüst sollte frei von Kern-und Zytoplasma-Material, etwas, das mit Hilfe eines DNA-Quantifizierung Kit und einfache histologische Analyse beurteilt werden kann. Hämatoxylin und Eosin-Färbung (H &amp; E) sollte die Abwesenheit von Kern-und Zytoplasma-Material unter Wahrung der Dünndarmschichten (3A) zu demonstrieren. Insbesondere sollte die Wartung der Zotten und Krypten auf der luminalen Seite ersichtlich ist folgende Rasterelektronenmikroskopie (Abbildung 4). AErhaltung der extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen, Elastin und Glycosaminoglycane auch erwartet werden. Zum Beispiel Masson Trichrom-Färbung zeigt intakte Bindegewebe im Gerüst (Abbildung 3B). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. . Versuchsplan Timeline der Dezellularisierung Verfahrens; PBS / AA: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Antibiotika-Antimykotikum, NaDeoxy: Natriumdeoxycholat, RT: Raumtemperatur, DNAse-I: Desoxyribonuclease-I. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> 2. Gerüst makroskopischmakroskopische Aussehen des Rattendünndarms nach erfolgreicher Dezellularisierung (A) c Eigenschaften.. Die Injektion von Farbstoff Ponceau Rosso durch die SMA zeigt eine intakte Gefäßnetz (B); SMA: A. mesenterica superior <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> 3. . Histologie H &amp; E (A) und MT (B) Färbung zeigen die Abwesenheit von Zellmaterial mit der Erhaltung des Bindegewebes Architektur, H &amp; E: Hämatoxylin und Eosin, MT: Masson Trichrom. Maßstab:. 100 um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . </p&gt; <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> 4. . Elektronenmikroskopie Rasterelektronenmikroskopie zeigt die erhaltenen Zotten-crypt Architektur in den Gerüst Lumen; Maßstabsbalken:. 100 um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests.

Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K Aufrufe.  University College London.  Der Artikel beschreibt eine Methode für die Herstellung einer azellulären Matrix aus Rattendarm. Die Ableitung von Darm Gerüste ist wichtig für zukünftige Anwendungen im Tissue Engineering, Stammzellbiologie und Drogentests. 

Serie: A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and composition. It is based on a microsurgical procedure designed to catheterize the trachea and aorta of a euthanized mouse to perfuse the heart and lungs with decellularizing agents. The decellularized cardiopulmonary complex can subsequently be immunostained to reveal the location of structural ECM proteins. The whole procedure can be completed in 4 days.
The ECM scaffolds resulting from this protocol are free of dimensional distortions. The absence of cells enables structural examination of ECM structures down to submicron resolution in 3D. This protocol can be applied to healthy and diseased tissue from mice as young as 4-weeks old, including mouse models of fibrosis and cancer, opening the way to determine ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

This protocol aims to decellularize the heart and lungs of mice. The resulting extracellular matrix (ECM) scaffolds can be immunostained and imaged to map the location and topology of their components.

Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Krebsforschung

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Biotechnik

Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various cellular processes. Two-dimensional (2D) cell culture models oversimplify the complex interactions between cells and the ECM, as the lack of a complete three-dimensional (3D) support can alter cell behavior, making them inadequate for understanding in vivo processes. Deficiencies in ECM composition and cell-ECM interactions are important contributors to a variety of different diseases. 
One example is LAMA2-congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD), where the absence or reduction of functional laminin 211 and 221 can lead to severe hypotony, detectable at or soon after birth. Previous work using a mouse model of the disease suggests that its onset occurs during fetal myogenesis. The present study aimed to develop a 3D in vitro model permitting the study of the interactions between muscle cells and the fetal muscle ECM, mimicking the native microenvironment. This protocol uses deep back muscles dissected from E18.5 mouse fetuses, treated with a hypotonic buffer, an anionic detergent, and DNase. The resultant decellularized matrices (dECMs) retained all ECM proteins tested (laminin &#945;2, total laminins, fibronectin, collagen I, and collagen IV) compared to the native tissue. 
When C2C12 myoblasts were seeded on top of these dECMs, they penetrated and colonized the dECMs, which supported their proliferation and differentiation. Furthermore, the C2C12 cells produced ECM proteins, contributing to the remodeling of their niche within the dECMs. The establishment of this in vitro platform provides a new promising approach to unravel the processes involved in the onset of LAMA2-CMD, and has the potential to be adapted to other skeletal muscle diseases where deficiencies in communication between the ECM and skeletal muscle cells contribute to disease progression.

In this work, a decellularization protocol was optimized to obtain decellularized matrices of fetal mouse skeletal muscle. C2C12 myoblasts can colonize these matrices, proliferate, and differentiate. This in vitro model can be used to study cell behavior in the context of skeletal muscle diseases such as muscular dystrophies.

Herstellung von 3D-dezellularisierten Matrizen aus fetalen Mausskelettmuskeln für die Zellkultur

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

Decellularization for the Preparation of Highly Preserved Human Acellular Skin Matrix for Regenerative Medicine

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of surrounding cells due to its content of diverse bioactive molecules. Due to these characteristics, the ECM has been recently considered a promising candidate for the creation of biological scaffolds to boost tissue regeneration. Emerging studies have demonstrated that decellularized human tissues could resemble the native ECM in their structural and biochemical profiles, preserving the three-dimensional (3D) architecture and the content of fundamental biological molecules. Hence, decellularized ECM can be employed to promote tissue remodeling, repair, and functional reconstruction of many organs. Selecting the appropriate decellularization procedure is crucial to obtain acellular tissues that retain the characteristics of the ideal microenvironment for cells. 
The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the decellularization method to obtain a reproducible and effective cell-free biological ECM. Skin fragments from patients undergoing plastic surgery were scaled down and decellularized using a combination of sodium dodecylsulfate (SDS), Triton X-100, and antibiotics. To promote the regular and homogeneous transport of the solution through the samples, they were enclosed in embedding cassettes to ensure protection from mechanical insults. After the decellularization procedure, the snow-white color of skin fragments indicated complete and successful decellularization. Additionally, decellularized samples showed an intact and well-preserved architecture. The results suggest that the proposed decellularization method was effective, fast, and reproducible and protected samples from architectural damages.

Decellularized human skin is suitable for tissue regeneration. A major issue of decellularization is the preservation of the native architecture, along with the appropriate content of structural proteins, glycosaminoglycans (GAGs), and growth factors. The method proposed allows fast and effective decellularization, producing decellularized skin with well-preserved native features.

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of ...

Epithelale Auswirkungen von Darmentzündungen auf etablierte murine Kolonoide

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der epithelialen Auswirkungen von Darmentzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...