Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell Zuschuss (AB), Pardee Stiftung (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY) und einer NSF Graduate Research unterstützt Fellowship (BL). Wir danken den Bordey lab Mitglieder für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Das vorliegende Material ist auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, Incorporated das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovationen.

Ein. Herstellung von Lösungen, Dissection und Vibratom <ol><li> Die Lösungen müssen in der richtigen Osmolarität und pH-Wert (Tabelle 1) hergestellt werden. Verglichen mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) wird Dissektion Lösung mit niedrigeren Konzentrationen von Natrium und Calcium, und höhere Konzentrationen an Magnesium hergestellt. Dies ist zu Exzitotoxizität Effekte während des Schneidens zu minimieren. </li><li> Beide Dissektion und ACSF Lösungen müssen mit 95% O 2/5% CO 2 durch Einblasen von mindestens 10 min, um den gewünschten pH-Wert von 7,3 zu erreichen. Gesättigt sein </li><li> Bereiten Sie ein Eisbad in einem Tablett. Legen Sie eine Dissektion Platte im Eisbad und füllen mit Dissektion Lösung. Blase die Dissektion Platte. </li><li> Bereiten Sie die Vibratom durch die Schaffung eines Eisbad. Legen Sie das Schneiden Gericht im Eisbad, füllen Sie die Schale mit Dissektion Lösung und Blase. </li><li> Füllen Sie das Slice-Aufnahmekammer mit ACSF und Blase, diese Lösung zu gewährleisten ausreichend belüftet unabhängigvon denen Scheiben angeordnet sind. </li></ol> 2. Removal of Brain Tissue Akute Hirnschnitten tendenziell gesünder mit jüngeren Mäusen. Die postnatale SVZ die zelluläre Architektur in Nagetieren ist reif rund postnatalen Tag (P) 20 1. Deshalb versuchen wir, unseren Experimenten zu Maus Alter von P20-P30 zu begrenzen, aber wir haben erfolgreiche Versuche bei Mäusen so alt wie die 3 Monate durchgeführt. Während der gesamten Handhabung des Gewebes, muss man darauf achten, die mechanischen Bewegungen und Druck auf das Gehirn zu minimieren, halten gekühlten Bedingungen, und setzen die SVZ zur Lösung so schnell wie möglich nach der Tötung. <ol><li> Nach Injektion von Pentobarbital wird die Maus schnell enthauptet. Das Fell wird entfernt und Einschnitte durch die Basis des Schädels hergestellt. Der Kopf wird dann in eine Schale mit Dissektion Lösung gefüllt war. </li><li> Während Stabilisierung des Kopfes mit einer Pinzette, kontinuierliche Schnitte um den Schädel gemacht und manchmal bis zur Mittellinie mit Microscissors. Seien Sie vorsichtig, um den Kontakt mit dem Gewebe zu minimieren. Da der Riechkolben ist das endgültige Ziel der neugeborenen Neuronen aus dem SVZ, muss man darauf achten, bewahren diese Region, vor allem während Knochenentfernung in dieser Gegend. Microscissor Schnitten um den Schädel sollten auf der dorsalen Seite zu sein, um für ein leichtes Entfernen des Schädels zu ermöglichen. </li><li> Entfernen des Schädels über dem Gehirn wird nun aus den Knochen unterhalb des Gehirns getrennt. Wenn Schnitte im vorherigen Schritt richtig gemacht sind, kann dies darüber liegenden Knochen leicht mit einer Pinzette oder einer Pinzette entfernt werden. </li><li> Halten Sie den Kopf mit einer Pinzette, kann man einem Skalpell sauber zu entfernen mehrere Stücke von Hirngewebe vor Slicing, wie die folgenden. Ein koronalen Schnitt kann auf der Ebene der Lambda erfolgen. Sagittalen Schnitte auf beiden Seiten des Gehirns lateral der SVZ erfolgen. Eine konservative Schätzung würde ~ 2,5 mm von der Mittellinie liegen. Falls gewünscht, kann das Gehirn auch hier hemisected werden. Diese Kürzungen werden sowohl facilitate Befestigung des Gewebes und damit die SVZ mehr schnell erreicht werden beim Gehirn schneiden. Es ist wichtig, sich zu erinnern, die minimale Menge von mechanischen Kräften auf das Gehirn (zB nicht Schieben oder Ziehen) auszuüben. </li></ol> 3. Akute Hirnschnitt Vorbereitung <ol><li> Um für die weiteren Schritte vorzubereiten, sicherzustellen, dass die Super-Klebstoff verwendet werden, um das Gewebe zu montieren frei von Verstopfungen und bereit für die Vibratom Platte anzuwenden. Es ist wichtig, möglichst schnell gehen, ohne Schädigung des Gehirns. </li><li> Das Hirngewebe kann dann von unten, die das Gewebe trennt sich von den darunter liegenden Knochen gleichzeitig trennt Nerven geschöpft werden. </li><li> Das Gewebe wird fertig verklebt auf einer Platte und auf dem Vibratom. Aufgrund der rostral-kaudale Anatomie des SVZ, haben wir uns darauf sagittale Schichten, wie es die wandernden Weg der Neuroblasten, die Gliazellen Scheide und das Gefäßsystem, die weitgehend in diese Richtung ausgerichtet sind konserviert konzentriert. Man kann entweder mount das Gewebe an der Mittellinie oder auf der flachen Oberfläche, indem sie sagittalen Schnitte quer zur SVZ erstellt. Ein optionaler Schritt ist, eine 3% Agarose Block hinter dem Gewebe zu platzieren, um als Anschlag zu der Klinge dienen als die Scheiben abgehen. Wir bevorzugt Cyanoacrylat-Basis Superkleber verwendet. </li><li> Spülen Sie die Klinge mit Ethanol zur Beseitigung von Ölen und spülen mit destilliertem Wasser. Zeigen die Klinge am Klingenhalter. Montieren Sie den Messerhalter der Vibratom. </li><li> Passen Vibratom Einstellungen, um Gewebe in einer Dicke von 250 bis 350 um pro Scheibe geschnitten. Es ist wichtig, um den Vorgang mit hochfrequenten Schwingungen und mit geringer Geschwindigkeit. </li><li> Abschnitt progressiv durch das Gewebe. Das Aussehen der Riechkolben ist ein guter Indikator dafür, dass ein in der Nähe des SVZ in sagittaler Scheiben als die meisten seitlichen Scheiben weder Region enthalten wird, ist. Weitere Sehenswürdigkeiten zu suchen sind die Herzkammer und die Verdickung des Corpus callosum, unter dem die SVZ befindet. Die SVZ erscheint in mehreren seitlichen Sagit erstental Scheiben schneiden. Das RMS wird im medialen sagittalen Schnitte zeigen. </li><li> Entfernen Sie Scheiben mit der SVZ mit einem Kunststoff-Pasteurpipette mit der Spitze abgeschnitten. Übertragen auf die Scheibe Aufnahmeraum. Wir erhalten oft mehr Scheiben als wir in einem Werk Tag nutzen können. Allerdings werden Scheiben von der Menge der Zellen, die das SVZ variieren. Es ist manchmal notwendig, um durch mehrere Scheiben schauen, um ein für die Bildgebung gewünschte zu finden. </li></ol> 4. Vorbereitung Mikroskop und Farbstoffe Die Scheiben müssen eine Stunde Inkubationszeit in ACSF von der Dissektion und Schneiden erholen. Mehrere Schritte können während dieser Scheibe Erholungsphase durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung von Pipetten für Calcium Farbstoff und / oder Drug Application <ol class="lalpha"><li> Glaspipetten benötigen, um eine Spitze von 2-3 um Durchmesser und einer Spitze Länge (~ 2 mm) und Winkel (~ 16 ° für den Pipettenhalter), die Kontakt mit dem verhindert Perfusionskammer haben und erlaubt eine Platzierungdas Ziel. </li><li> Man kann in der Regel bereiten 6-8 Druck Pipetten für jeden Tag der Experimente. </li></ol></li><li> Calcium Farbstoffzubereitung <ol class="lalpha"><li> Bei der Herstellung der Arbeitslösung (4-5 uM durch Bad, 250 uM durch Druck-Anwendung), ist es am besten, um die minimale Menge an DMSO, um Zellen aussetzen. Dies kann durch hochkonzentrierte Bestände erreicht werden kann. Zum Beispiel für Fluo-4, ist ein Rohr, enthaltend 50 g pro Tag verwendet wird. Man kann eine 10 mM Vorratslösung dieses Aliquot durch Zugabe von 4,6 ul Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO machen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Mikroskop-Setup (Abbildung 2). <ol class="lalpha"><li> Verwendung einer peristaltischen Pumpe für einen Lösungsfluß half Bilddrift minimieren. Führen Sie die Schlauchpumpe vor, damit ACSF durch die Perfusion verlaufen und sicherzustellen, dass es blasenfrei ist. </li><li> Röhren-Einlass auf der Perfusionskammer und sicherzustellen, dass keine Leckagen. </li><li> Positionieren Sie den Vakuum-Spitze ensure, dass die Lösung, die ausgewählt ist aus der Perfusionskammer abgesaugt. Sicherzustellen, dass er auf einem adäquaten Niveau ist so, dass das Ziel die richtige Arbeitshöhe Abstand eingetaucht wird, aber nicht so hoch, so daß Lösung kann über die Kammer gelangt. Ein niedriges Niveau der Lösung minimiert auch Flow Verzerrungen. Eine ständige Streben können auch durch das Hören für Stabilität überprüft werden. </li></ol></li></ol> 5. Dye Loading Dieses Verfahren ist im Detail in einer anderen Manuskript 2 beschrieben. Bitte siehe Abbildungen darin. <ol><li> Bath Ladefarbstoff <ol class="lalpha"><li> Machen Sie eine 1-2 ml Arbeitslösung des Farbstoffes. Für Fluo-4 AM, ist eine Konzentration von 4-5 uM ausreichend für die Kennzeichnung SVZ Neuroblasten. </li><li> Scheiben werden zunächst für eine 35 mm Kulturschale mit einem Siebeinsatz, das bereits mit ACSF gefüllt übertragen. Ersetzen Sie die Lösung unter Verwendung eines 3 ml Kunststoff-Pipette vorsichtig entfernen ACSF, während gleichzeitige Zugabe des calcium Farbstoff funktionierende Lösung. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 30-60 min in einer 5% CO 2-Gas-kontrollierten Umgebung. </li><li> Legen Sie die Scheibe wieder in den ACSF gefüllte Vorratskammer abzuwaschen Farbstoff, keine Zellen eingegeben hat. Alternativ kann man sie direkt auf den Mikroskop Perfusionskammer, auf dem ACSF wird. Diese Wäsche beträgt 30-45 min. </li><li> Übertragen Sie das Slice der Perfusionskammer. </li></ol></li><li> Druckbeaufschlagung von Farbstoff <ol class="lalpha"><li> Übertragen der Scheibe von der Haltekammer zum Perfusionskammer am Mikroskop Setup. </li><li> Füllen Sie ein Glas Pipette mit eine funktionierende Lösung, die 250 uM und auf den Mikromanipulator ist. </li><li> Senken Sie die Pipette in die Region von Interesse. Die Pipette kann derart platziert werden, dass die Spitze entweder mehrere Mikrometer über der Scheibenoberfläche oder vergraben mehrere Mikrometer unterhalb der Scheibenoberfläche, aber entfernt von der aufgenommenen Region. Der Winkel der Pipette nicht Affect das Laden Effizienz. Bei der Abbildung unterhalb der Scheibenoberfläche, finden wir, dass die Platzierung der Pipettenspitze unterhalb der Bildebene wird von uns gewünschten Bildbereich besser kennzeichnen. </li><li> Wenn der Druck der Farbstoff Anwendung, stellen Sie den Picospritzer so dass es &lt;3 psi ist. Wir haben nicht das Volumen der Farbstoffdiffusion geschätzt, weil diese unterliegt Schwankungen der Pipettenspitze Durchmesser, angelegten Druck, und der Dichte des Gewebes, wo der Farbstoff injiziert. Wir wenden einfach, bis wir unsere gewünschte Beladung zu erreichen, wie mit dem Auge beurteilt. Minimieren Beschädigung der Scheibe während der Applikation, insbesondere, wenn die Spitze unterhalb der Scheibenoberfläche angeordnet ist. Bewerben Sie sich für 1-2 min. Manchmal wiederholten Anwendungen notwendig sind je nach Kennzeichnung als mit dem Auge beurteilt. Aus diesem Konzentration und Anwendungsdauer, finden wir, dass Oberflächen Anwendung der Farbstoff bevorzugt beschriftet Neuroblasten, während unter der Oberfläche Anwendung bevorzugt beschriftet Astrozyten. Allerdings wird&gt; 3 min Anwendung bei 500 uM auch benennen Neuroblastenunabhängig davon, ob die Spitze oberhalb oder unterhalb der Scheibenoberfläche (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Lassen Sie für Wasch-und Slice-Recovery für 30-45 min. </li></ol></li></ol> 6. Konfokalen Imaging von Calcium Activity <ol><li> Finden Sie die Region von Interesse zunächst mit einer geringeren Leistung Ziel wie 4x oder 10x. Platz in der Mitte des Feldes vor dem Wechsel zu einer höheren Macht Ziel. An diesem Punkt kann ein allgemeiner slice Gesundheit mit der Feststellung, das Aussehen der SVZ-Zellen unter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) zu beurteilen. Gesunde Zellen erscheinen rund und plump. Darüber hinaus werden gesunde Zellen anzuzeigen schwachen Fluo-4 Belastung wie zu keiner Belastung bei allen oder helle Fluoreszenz (eine sterbende Zelle) angenommen. </li><li> Senken Sie das Wasser-Immersions-Objektiv auf die Region von Interesse, welche nun farbstoffbeladenen. Entweder ein 40x oder 60x Ziel war für unsere Bedürfnisse ausreichend, obwohl 40x bietet ein breiteres Sichtfeld und ermöglicht eine größere Pipette Zugang. Bei der Abbildung unterhalb derOberfläche, wir gehen oft mindestens 15 &amp;mgr; m unterhalb der Scheibe Oberfläche, wo die 3-dimensionale Architektur und Zell Gesundheit besser erhalten bleiben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Perfusion und Vakuum werden angemessen funktioniert. </li><li> Richten Sie das Mikroskop, so dass Zeitraffer-Auflösung und räumliche Auflösung gewünschten Raten eingestellt sind. Für die konfokale Mikroskopie, müssen diese Faktoren als Erhöhung Zeitauflösung ausgeglichen werden gewöhnlich zu einem Verlust an räumlicher Auflösung aufgrund der Scanbewegung Natur des Systems. Für Calcium Aktivität haben wir einen Rahmen etwa jede zweite mit einem 512x512 Bildpunkten abgebildet. Wenn mehrere Kanäle separat erworben notwendig sind, wird sich dies auch auf Abtastraten. Stellen Dauer der Film (2-10 min). </li><li> Initiieren laufen. Wenn die Durchführung pharmakologischer Studien, auf Antagonisten oder nicht-desensibilisierenden Agonisten waschen für mindestens 5-10 min, und dann noch einen Film von 5-10 min. Agonisten, die Rezeptoren desensibilisieren kann akut können angewendet werden, wie beispielsweise durch Verwendung einer prEssure Pipette durch einen Mikromanipulator gesteuert. </li></ol> 7. Calcium Analyse Analyse folgt Standardverfahren, dass wir in pervious Veröffentlichungen beschrieben 2-4. F 0 (dh Baseline) und F sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten über alle Regionen von Interesse (ROI) und in jedem ROI gemessen. Eine Änderung in der Fluoreszenz wurde als ein Ca 2 + Erhöhung sein, wenn es&gt; 15% war F / F 0 erhöhen. Intrazellulärer Ca 2 + Veränderungen wurden anhand Calsignal 5. 8. Repräsentative Ergebnisse Wir waren in der Lage, um eine selektive Beladung von SVZ Zellen in Abhängigkeit von den Farbstoff Belastungsprotokolle oben beschrieben und anderswo 2-4,6 erhalten. Bath Belastung oder Druck-Anwendung auf dem Scheibenoberfläche Fluo-4 AM (4-5 oder 250 uM, jeweils) Etiketten meist Neuroblasten. Während der Druck-Anwendung laden können neurobdauert schneller als Badbelastung in einer einzigen Scheibe, ermöglicht Badbelastung die gleichzeitige Laden von mehreren Scheiben. Wir bestätigen die Identität von markierten Zellen als Neuroblasten durch (1), ob sie Zugverhalten 4,7, (2) ihre Morphologie, (3) eine negative Färbung des Sulforhodamin 101, eine Astrozyten-spezifischen Farbstoff 3 oder (4) eine positive Färbung mit Display DCX-DsRed Ausdruck (JC Platel, unveröffentlichte Beobachtung). Neuroblasten schnell migrieren (durchschnittlich 60 um / h) bei physiologischen Temperaturen 4,7-9, aber ihre Bewegung kann leicht beobachtet werden, selbst bei Raumtemperatur. Die Bewegung der Neuroblasten nicht stellen ein Problem in Bezug auf Platzierung regions-of-interest (ROI) von Calcium-Aktivitäten zu verfolgen, da unsere Filme sind in der Regel von kurzer Dauer. Doch während lange Wartezeiten, wie zum Beispiel während Arzneimittellösung Austausch, müssen die Ermittler vorsichtig sein, um ROIs in Kontroll-und Behandlungsgruppen Zeiträume entsprechen. Es ist nicht ungewöhnlich für Neuroblasten in das oder aus dem i migrieren<html> Maging Feld oder Brennebene. Pressure Anwendung von Fluo-4 AM (250 uM) tief in die Scheibe und für begrenzte Dauer (&lt;2 min) bevorzugt beschriftet SVZ Astrozyten 2. Astrocyten Etikettierung durch positive Markierung mit Sulforhodamin 101 und ihre Morphologie verifiziert worden, insbesondere durch das Vorhandensein von Vorsprüngen und endfeet auf Blutgefäße, die neu 3 beschrieben haben. Mit diesen Methoden haben wir spontane Aktivität sowohl in der SVZ Neuroblast und Astrozyten Population (Abbildung 1) beobachtet. Die Aktivität in Astrozyten nimmt oft die Form von Wellen, die Blutgefäß 3 eingreifen. Darüber hinaus mit Calcium-Imaging als Assay wurde die Anwendung von pharmakologischen Agonisten offenbart oder bestätigt Expression von GABA A-Rezeptoren auf Neuroblasten und Astrozyten 6, Rezeptoren AMPA und NMDA auf Neuroblasten 4. Figures 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Propagierung von Calcium Aktivität in Astrozyten. (A) Repräsentative gemittelt Bild aus einer Zeitraffer-Aufnahme von Kalzium Aktivität. Astrozyten im SVZ wurden mit Druck Anwendung von Fluo-4 geladen Uhr in die Scheibe tief. Filme wurden bei 0,75 s Zeit-Schritten erworben. Regions of Interest (ROI) über Zellen, die eine Tätigkeit gelegt. (B) von Spuren platziert ROIs über Zellen, die aus dem Film in (A) dargestellt. Spuren wurden mit einem gleitenden Durchschnitt und normalisierte gefiltert. Die vertikale Skala repräsentiert 2 x &amp;Dgr; F / F 0, wobei F die Signalintensität und F 0 der mittlere Ausgangswert-Signal und AF = FF 0. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bild des Perfusionssystem. Ein Ende der Röhre wird in 95% O 2/5% CO 2-Gas-p untergetauchterfused Lösung. Die Lösung wird dann durch das Rohr und der Badkammer durch eine peristaltische Pumpe (nicht dargestellt) perfundiert. Das andere Ende ist in die Lösung Einlass der Badkammer montiert auf einer Plattform eingefügt. Die Absaugspitze wird dann zu der Lösung Auslass der Kammer angeschlossen und auf einer Ebene zur Lösung Höhe zu bestimmen. Aus der Steckdose, ist die Absaugspitze mit der Vakuumleitung, welche die Lösung ansaugt aus der Kammer in einen Abfallbehälter verbunden ist. Die Perfusion wird aus dem Mikroskoptisch für visuelle Klarheit dargestellt.

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	<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+calcium+waves+define+communication+networks+among+murine+postnatal+neural+progenitor+cells.">Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.</a> Eur. J. Neurosci. , (2011).</li><li>Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+of+spontaneous+calcium+activity+in+mouse+neocortex+before+synaptogenesis.">Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis.</a> Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).</li><li>Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+increases+calcium+in+subventricular+zone+astrocyte-like+cells+through+L-+and+T-type+voltage-gated+calcium+channels.">GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels.</a> Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).</li><li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+Release+and+Uptake+Regulate+Neuronal+Precursor+Migration+in+the+Postnatal+Subventricular+Zone.">GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li><li>Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+a+whole+mount+preparation+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone.</a> J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+controls+Ca2++activity-dependent+network+synchrony+in+the+adult+neurogenic+forebrain.">GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain.</a> , (2007).</li><li>Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP-expressing+cells+in+the+postnatal+subventricular+zone+display+a+unique+glial+phenotype+intermediate+between+radial+glia+and+astrocytes.">GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes.</a> Glia. 54, 394-410 (2006).</li><li>Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+and+ionic+signature+of+neuronal+progenitors+of+the+postnatal+subventricular+zone+in+situ.">Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ.</a> J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca(2)+indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators.</a> Science. 333, 1888-1891 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Calcium Bildgebung SVZ Zellen verwendet wurde, um Muster in spontaner Aktivität in Neuroblasten 10, Rezeptorkanals Expression in beiden Neuroblasten und Astrozyten und 4,6,8 astrozytären Calciumwellen 3 studieren. Da Zellen in der SVZ entweder unreif sind oder glialen Eigenschaften, sie nicht feuern Aktionspotentiale 11,12, was bedeutet, dass Millisekunde Veränderungen in Spannungspotential indikativ Aktivität in reifen Netzen nicht anwendbar ist in dieser Region. Daher erfassen die langsameren Calcium Ereignisse (in der Größenordnung von Sekunden) ist nicht nur biologisch sinnvoll, aber vielleicht die wichtigste Form der Aktivität in diesen Zellen. Die Ermittler müssen darauf achten, von vielen Schritten in diesem Verfahren, insbesondere im Hinblick auf slice Gesundheit. Unsachgemäße Herstellung von Lösungen, könnte schlechte Wasserqualität (verwendet, um Lösungen zu machen), langsam und ungenau Sezieren und die Verwendung von schmutzigen Rasierklingen um Gewebe zu schneiden alle nachteilige efkungen auf die Aktivität. Im Hinblick auf die Verwendung von Calcium-Indikatoren, während wir diskutiert nur die Verwendung von Fluo-4.00, haben wir weitere kommerzielle Farbstoffe, einschließlich Oregon Green BAPTA-AM, die einen höheren Pegel als Basislinie Beladung Fluo-4 hat versucht. Wir haben uns auf Fluo-4 konzentrieren, weil der größeren Dynamikbereich zu anderen gegenüber Farbstoffen, aber auch andere Ermittler können Sie verschiedene Farbstoffe vorteilhaft für ihre Zwecke. Jeder Farbstoff können unterschiedliche Affinität für bestimmte Zelltypen. Konzentration und Art der Verladung muss möglicherweise für jeden Farbstoff eingestellt werden. Wir bevorzugt verwendet Druckbelastung auf SVZ Astrozyten und gesünder, tiefer Zellen zu markieren. Ein finanzieller Faktor zu berücksichtigen ist, dass mit Druck-Anwendung ist teurer als Bad Anwendung, obwohl die Farbstofflösung im Druckpipette können eingefroren und wiederverwendet werden am nächsten Tag. Alternativ wurden genetisch codierte Calciumindikatoren (GeCIS) wie GCaMP3, immer beliebter zur Untersuchung anderer Systeme und BHin den Regionen 13,14. Diese GeCIS haben den Vorteil, dass unter zellspezifischen Promotoren gesteuert, aber ihre Kinetik und dynamischen Bereich in der Regel nicht besser als die organischen Farbstoffe 15. Ihre Verwendung bei der postnatalen SVZ erfordert auch virale Etikettierung oder Elektroporation des Konstrukts, letztere begrenzende Studie Neuroblasten der neonatalen Periode durch den Verlust des Plasmids während der Zellteilung. Scheibe Drift verhindert zuverlässig Signalerfassung während der Dauer des Films und ist eine der schwierigsten technischen Hürden mit Live-Imaging-Experimente an Hirnschnitten. Es wird von mehreren Faktoren ab, einschließlich Perfusionsrate, Vakuum Platzierung, objektiven Gewicht und, falls zutreffend, Temperaturgradienten betroffen. Falls Temperaturen von mehr als 25 ° C sind für Versuche, sollte man versuchen, Lösungen und Perfusionskammern bei der niedrigsten Temperatur zu erhitzen, wo sie ihre Fragen ansprechen kann, da erhebliche Temperaturen führen kann, undesired Fokusdrift. Ziel Heizungen und beheizten Gehäuse könnte auch helfen, zu minimieren diesen Effekt, obwohl wir den ehemaligen ohne viel Erfolg versucht haben. Vorbehaltlich dieser technischen Hürden, haben die Forscher die Möglichkeit, Assay eine große Anzahl von Zellen in einer postnatalen Entwicklung Region. Dies bietet die Gelegenheit, um die Aktivität auf einer Ebene der Bevölkerung anzusprechen, die könnten neue Einblicke in die Prozesse der Regulation der Neurogenese ergeben.

<table border="1"><tbody><tr><td> Solute </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Dissection (mM) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mM ACSF: 126 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2,5 mM ACSF: 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4,33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mM ACSF: 1,25 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Chemical Liste und Rezepte der Dissektion Lösung und ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Header] </td></tr><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold oder 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue oder 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Tools </td><td> Roboz oder Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-01.00 Calcium-sensitiven Farbstoffes </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 20% ige Lösung in DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV300 oder FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser-Immersions-Objektive </td><td> Olymp </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipulatoren </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Druckregler &lt;/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI während der Anwendung </td></tr><tr><td> Pipette puller </td><td> Sutter oder Narshige </td><td> Sutter P-97 oder Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Glaspipetten </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1,10, OD: 1,50 </td></tr><tr><td> Schlauchpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modell 720 </td><td> Fließgeschwindigkeit: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Chamber Bad </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> Low-Profil ermöglicht eine objektive Abstand </td></tr><tr><td> Rohr </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Materialien / Geräte Liste.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

Die subventrikulären Zone (SVZ) ist einer der beiden neurogenen Zonen in der postnatalen Gehirn. Die SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen mit astrozytären Funktionen (genannt SVZ Astrozyten), Neuroblasten und mittleren Vorläuferzellen. Neuroblasten in der SVZ geboren tangential migrieren eine große Entfernung zum Riechkolben, wo sie differenzieren sich in Interneuronen. Interzelluläre Signalisierung durch Adhäsionsmoleküle und diffusionsfähigen Signale spielen wichtige Rollen bei steuernden Neurogenese. Viele dieser Signale auslösen interzellulären Kalzium-Aktivität, die Informationen innerhalb und zwischen Zellen überträgt. Calcium-Aktivität ist deshalb reflektierenden der Aktivität von extrazellulären Signalen und ist eine optimale Möglichkeit, funktionelle interzellulären Signalisierung zwischen SVZ Zellen zu verstehen. Calcium-Aktivität wurde in vielen anderen Regionen und Zelltypen, einschließlich reife Astrozyten und Neuronen untersucht worden. Allerdings ist die traditionelle Methode, um load-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff (dh Badbelastung) war nicht beim Laden alle SVZ Zelltypen effizient. Tatsächlich schließt die Zelldichte in der SVZ Farbstoffdiffusion innerhalb des Gewebes. Darüber hinaus wird die Vorbereitung sagittalen Schnitten bessere Erhaltung der dreidimensionalen Anordnung SVZ Zellen, insbesondere der Strom der Neuroblast Migration auf dem rostralen-kaudalen Achse. Hier beschreiben wir Methoden, um Sagittalschnitten mit der SVZ, die Belastung der SVZ-Zellen mit Calcium-Indikator-Farbstoff und den Erwerb von Kalzium Aktivität mit Zeitraffer-Filme erstellen. Wir verwendeten Fluo-4 AM Farbstoff zum Laden SVZ Astrozyten unter Druck Anwendung innerhalb des Gewebes. Calcium-Aktivität wurde mit einem konfokalen Mikroskop ermöglicht eine genaue Auflösung zur Unterscheidung von einzelnen Zellen. Unser Ansatz ist auf andere Zonen einschließlich neurogener der erwachsenen hippocampalen subgranularen Zone und embryonalen neurogenen Zonen. Darüber hinaus können andere Arten von Farbstoffenunter Verwendung des beschriebenen Verfahrens werden.

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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Serie: Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...