Dieses Protokoll wurde im Rahmen eines Wellcome Trust Zuschuss entwickelt. Wir danken Frau Maureen Sinclair für die Pflege der Bestände und der Vorbereitung Fliege die Fliege Nahrung im Laufe der Jahre. Wir möchten auch an Herrn Michael Aitchison für seine Hilfe und technische Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls zu danken.

1. Transgenen Fliegen und Wartung <ol><li> Transgene Fliegen in diesem Beispiel verwendet: UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-Rfpschablonen His2B (X *); UBQ-GFP-Cdc20 (II *), UBQ-GFP-Cdc20 (II *); MAD2 EY ( III *) und UBQ Cdc20-GFP-transgenen Fliegen wurden zuvor im Labor über einen Standard-P-Element-vermittelten transgenen Ansatz 10,11 und UBQ-RFP-His2B ist eine Art Geschenk von Yohanns Belaïche an UMR 144 CNRS / Institut Curie erzeugt, Paris, Frankreich. Sie wurden in eine Mad2 mutierten Hintergrund über Standard-Drosophila-Genetik eingeführt. Die MAD2 EY ursprünglichen mutanten Linie wurde aus dem Bloomington Stock Center gekauft. Wir diskutieren nicht das Verfahren zum Anheben der Transformanten in diesem Protokoll verwendet. Hinweis: * steht für die Chromosomenzahl. </li><li> Wartung: Transgene Fliegen wurden bei 25 ° C gehalten, in Plastikröhrchen containing fliegen Nahrung und mit zusätzlichen Trockenhefe Pulver auf der Oberseite. Das Fläschchen wurde routinemäßig ersetzt alle 3-4 Wochen, je nach Anbaubedingungen (Abbildung 1). </li></ol> 2. Fly Food Preparation (Lab-Skala) <ol><li> Eine geeignete Menge der Fliege Futtermischung wurde unter konstantem Rühren erhitzt, um die Komponenten zu lösen. </li><li> Etwa 8-10 ml dieses Mediums als Aufschlämmung in jedes Kunststoffphiole (2,5 cm Durchmesser und 8 cm Länge) unter Verwendung eines Jencons Scientific Ltd Schlauchpumpe verteilt. </li><li> Als das Essen Gülle gesetzt wurde und auf Raumtemperatur abgekühlt, wird die Flasche gesteckt dann mit einem Baumwoll-Schaum-Stecker. Diese Nahrungsmittel Fläschchen werden in einem Fach, das dann in einem Plastikbeutel wird verschlossen und bei 4 ° C für die spätere Verwendung gebracht. </li></ol> 3. Small-scale Egg Collection <ol><li> Über 50 Paare von 2-3 Tage alten erwachsenen Fliegen wurden in ein frisches Röhrchen essen fliegen mit zusätzlichen Trockenhefe Pulver auf seiner Oberfläche bei 25 ° C zugeführt für Laien übertragenÝng Embryonen. </li><li> Die Fliegen werden dann in ein frisches Gefäß überführt und jede Stunde verlassen die Embryonen in der Ampulle für 30 Minuten, um sicherzustellen, einige der gesammelten Embryonen um Kernteilung Zyklus 8-10 Jahre alt sind, wenn die Kerne allmählich werden die Migration auf der Rinde und organisiert als einzelnen Monolage. Die erste Stunde Sammlung wird in der Regel verworfen, da es enthält häufig im Alter von Embryonen, die in den weiblichen Körper zurückgehalten wurden, wenn die Bedingungen waren nicht geeignet für die Verlegung. </li></ol> 4. Vorbereiten Deckgläser und Objektträger <ol><li> Nehmen Sie ein 50 x 22 mm Deckglas und leicht feucht seinen vier Ecken auf einer Seite mit einer sehr geringen Menge von Wasser mit einem feuchten Pinsel feinen Stift und setzte sie auf einen Objektträger, so dass das Deckglas nicht, weil der Kapillare Oberflächenspannung bewegen die durch die dünnen Flüssigkeitsfilm. </li><li> Eine dünne Streifen aus Heptan Klebstoff, der die Mitte des Deckglases, sollte die Heptan in Sekunden verdampfen, um den Klebstoff auf das Deckglas zu verlassen. </li><li>Schneiden Sie einen anderen Deckglas mit einer Diamant-Stift in kleine Quadrate (~ 1,5 mm 2), nehmen Sie ein und legen Sie es auf ein Ende der Klebestreifen (wird verwendet, um die Nadelspitze zu öffnen, wenn Mikroinjektion wird benötigt) und speichern Sie die andere für die Zukunft verwenden. </li><li> Nehmen wir ein anderes Mikroskop-Objektträger und kleben Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband etwa 2 cm lang, um es und ziehen Sie die Deckblätter. (Siehe Abbildung 2 A &amp; B). </li></ol> 5. Dechorionate Embryonen <ol><li> Übertragen Sie die Fliegen auf einen frischen Lebensmitteln Fläschchen und verwenden Sie einen befeuchteten feinen Pinsel Stift auf etwa 50 Eier auf dem doppelseitigen Klebeband auf die Folie übertragen mit einer entsprechenden Menge an Flüssigkeit, damit die Eier ausgebreitet werden. Wenn die Flüssigkeit verdampft die Eier auf dem Band kleben. </li><li> Unter einem Binokular Touch die Eier mehrmals entlang ihrer Längsachse mit der Außenseite der einen Hälfte einer Pinzette vorsichtig bis zum Chorion ist gebrochen und offen, aber lassen Sie das Embryo im ChorIonen-Schale zu schnelle Austrocknung zu verhindern. Diesen Prozess fort, bis die Eier 10-20 behandelt worden ist (abhängig von der Anzahl der Eier für einen einzigen Experiment erforderlich). </li><li> Die Embryonen können dann abgeholt werden und aus dem Chorion-Shell und sanft auf den Klebestreifen einer nach dem anderen gelegt. Die Eier können angeordnet werden und entweder mit der langen Seite des Embryos parallel oder anti-parallel zu der langen Seite des Klebestreifens davon abhängen, ob sie mikroinjiziert werden ausgerichtet. </li><li> Die Embryonen können sofort mit einer geeigneten Menge der Voltalef 10S Öl (ein 5:1-Gemisch von Öl Holocarbon 700 und 27 Öl, Sigma) bis zu weiteren Austrocknung telbaren verhindern abgedeckt werden, oder in einer Austrocknung Kammer für 3-8 Minuten dehydrieren sie weiter in Abhängigkeit von der Luftfeuchtigkeit des Raumes und der Zweck des Versuches. Die entwässerten Embryonen sollten mit 10S Öl bedeckt sein, wenn entsprechende over-Dehydrierung zu verhindern, wenn die Mikroinjektion ist nicht erforderlich. (Siehe Abbildung. 2C, D&amp; E). </li></ol> 6. Imaging Embryonen <ol><li> Zeitraffer oder einzelne Bilder von lebenden Embryonen werden mittels eines Leica TCS SP2 invertierten konfokalen Mikroskopie-System mit einem HCX PL APO CS 40X 1,25 Ölimmersionsobjektiv (60 oder 100x Objektive können verwendet werden zu je nach Zweck des Experiments ist, desto höher werden die Vergrößerung verwendet die mehr Photobleichung auftreten werden). </li><li> Bei der Darstellung mehrere Fluorophore, die überlappende Spektren wurden und in der gleichen Embryos co-exprimiert, wurde jede fluoreszierende Protein Emissionswellenlänge gesammelt sequentiell. Die Anregungs-und Emissionswellenlänge auf dem Leica TCS SP2-Systems sind: GFP, λ Ex: 488 nm und λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm und λ Em: 555-700 nm auf. </li><li> Ein einzelnes Bild allgemein als durchschnittlich 2 Abtastlinien mit einem Durchschnitt von 2 Frame-Scans erhalten. Dies dauert mindestens 6,3 Sekunden, um eine 512x512 p scannenIxel Bild in einem gleichzeitigen Scan-Modus und 15,44 Sekunden für eine sequentielle Abtastung ausgeführt und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Zeiten müssen berücksichtigt werden, wenn die Einrichtung der Zeitrahmen für Zeitraffer-Bild Sammeln. </li><li> Die Lochkamera wurde in der Regel auf 1-2 AU (Airy Einheit) gesetzt, und die Laserleistung wurde auf der niedrigst möglichen Ebene, um eine erhebliche Ausbleichen zu vermeiden angepasst. </li></ol> 7. Provozieren die SAC durch Mikroinjektion des Embryos mit geeigneten Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie die Nadel vor dem Experiment. Wir bevorzugen es, die Nadel aus silikonisierte Glaskapillaren (GC-100-10, Harvard) ziehen mit dem flammenden / braun Feinpipettenziehvorrichtung (Sutter, Modell: P-97) mit den Parametern: Wärme = 600, ziehen = 90, vel = 70 , del = 150. </li><li> Verfüllen Sie die Nadel mit 1-2 ml eines geeigneten Konzentration des Reagenzes in Injektionspuffer mit einem feinen Laden Spitze (20 ul Eppendorf Menge: W215818J). </li><li> Montieren Sie die Nadel in der Nadel holder am Mikroskop mit dem Druckrohr verbunden mit dem Eppendorf-Steuersystem. </li><li> Finden Sie einen Embryo unter dem 40X-Objektiv und finden Sie die Nadel Schatten ohne Änderung der Fokalebene durch Verschieben der Nadel in der Mitte des Sichtfeldes und allmählich senken Sie ihn nach rechts Brennebene. </li><li> Bewegen Sie den Embryo entfernt sanft auf den kleinen Platz des gebrochenen Deckglas an einem Ende des Klebestreifens vormontiert zu finden. Sehr sanft bewegen die Nadelspitze bis er den Rand des kleinen quadratischen Deckglas trifft und sanft bricht sie zu öffnen. </li><li> Verschieben Sie die Embryonen wieder in Sicht, und wählen Sie den Embryo im richtigen Alter für die Injektion. Ich normalerweise spritzen sie den Embryo in Kernteilung Zyklus bei 5-7, da dies, bevor die Kerne wandern nach außen zur Rinde. Die Kernteilung Zyklus Phasen kann durch einen schnellen Scan der Fluoreszenzsignale der GFP-Cdc20 oder die nukleare Signal des RFP-Histon-2B vor der Injektion 9 bestimmt werden. </li><li> Bringen Sie den Embryo in der Nähe der Nadel und stellen dann eine Brennebene sowohl für den Embryo und die Nadel. Bewegen Sie den Embryo in die Nadel zu injizieren und einen Tropfen des Reagens in die gewünschte Position und bewegen Sie den Embryo weg (oder folgen Sie den Anweisungen für die Mikroinjektion-System). Der Embryo kann von der hinteren oder von der Seite abhängig von dem Zweck des Experiments injiziert werden. </li><li> Nach der Injektion wird der Embryo abgebildet zu gegebener Zeit abgebildet werden. (Siehe Abbildung 2F &amp; G) </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> Abbildung 1. Benötigte Materialien: ein. feinen Pinsel Stift, b. kleinen Platz gebrochenen Gläsern Container, c. 22 x 50 mm Deckglas, d. Objektträger, E. Doppel-Klebeband, f. Trockenhefe Pulver in Teströhrchen mit Löchern auf dem Deckel, g. HefeGranulat für Fliegenfischer Wartung, h verwendet. fliegen Lebensmittel Fläschchen, i. eine Hälfte einer Pinzette für dechorionate Embryonen verwendet, j. ein Paar Pinzette, k. Heptan Leim Flüssigkeitsbehälter (Messkolben). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Diagramme zeigen die Vorbereitung der Deckgläser und Objektträger in Schritt 4, Embryo dechorionation in Schritt 5 und Nadel Vorbereitungen für die Mikroinjektion in Schritt 7. Ein. Das obere Bild zeigt ein Deckglas mit einem Streifen aus Heptan Kleber in der Mitte durch und einem kleinen Platz an einem gebrochenen Deckglas geklebt zu einem Ende. Das untere Bild zeigt einen Mikroskop-Objektträger mit einer dünnen Schicht von Wasser an seinen vier Ecken, um ein Deckglas zu halten. Der Grund für die Verwendung einer Folie auf das Deckglas zu halten ist, um etwa die gleiche Brennweite wie die gefunden wird, wenn Sie doppelseitiges Klebeband auf den Folien haben und somit die Vermeidung der Neuausrichtung des Mikroskops während Sie are Sezieren und die Übertragung der Embryonen zwischen Band und Deckglas. B. Eine Folie mit einer kurzen Länge von doppelseitigen Klebeband vor Abziehen seine Deckblätter für dechorionating den Embryo. C angewandt. Das Bild links zeigt Embryonen mit intakter Chorion Schalen mit gekennzeichneten vorderen und hinteren Ende, das Bild rechts zeigt die Embryonen in den zerbrochenen Schalen Chorion, bevor sie auf das Deckglas mit dem Klebestreifen übertragen D &amp; E-Diagramme zeigen zwei.. Möglichkeiten für die Übertragung, Platzieren und Ausrichten der dechorionated Embryonen auf Klebestreifen. Die Embryonen wurden von 10S-Öl nach einer angemessenen Frist Austrocknung abgedeckt. F &amp; G-Diagramme zeigen, wie man die Spitze der Nadel und positionieren Sie es so wie zu injizieren zu öffnen. Einzel-oder Zeitraffer-Aufnahmen aus den oben beschriebenen Experimenten können direkt analysiert werden mit Leica-Software gespeichert oder in. TIF-Dateien als offenes FOrmat zur weiteren Bearbeitung oder Quantifizierung Analysen mit anderen gängigen Bild-Analyse-Programme wie Image J, Photoshop und MetaMorph usw. Zwei Beispiele zur Illustration werden im Folgenden erörtert: Beispiel 1: Ein Zeitraffer-Film (Abbildung 3) zeigt die dynamische Kinetochor Rekrutierung von GFP-Cdc20-und Chromosomen-Bewegung in lebenden Drosophila-Syncytial-Embryonen. Die Region of Interest aus original Zeitraffer-Sequenz Bildern war bestimmt / herausgegeben und automatisierte Batch-Software konvertiert mit Hilfe von Photoshop. Der Film wurde mithilfe von QuickTime-Software. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein Zeitraffer-Film zeigt die dynamische Kinetochor Rekrutierung von GFP-Cdc20-und Chromosomen-Bewegung in lebenden Drosophila-Syncytial-Embryonen. (A) Zeitraffer-Bilder wurden von einer transgenen Syncytial Embryo entnommen, die GFP-Cdc20 (in grün)und RFP-Histon-2B (in rot) und Fusionsproteine ​​wurden mit einem Leica TCS SP2 konfokalen System bei 18 ° C während der Kernteilung Zyklen 7-8. Frames waren alle 10 Sekunden aufgenommen. Der Rahmen mit den Zellen bereits in Prophase wird als Zeitpunkt Null 10 behandelt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um den Film für 3A ansehen</a> . (B) GFP-Cdc20 kann ohne weiteres auf Prophase und Prometaphase Kinetochoren (B3 &amp; 4, weiße Pfeile) zu beobachten und weiterhin besteht auf Metaphase und Anaphase Kinetochoren (B5 &amp; 6, weiße Pfeile). GFP-Cdc20 wird von Interphasekern (Weißer Pfeil) ausgeschlossen, Eintritt in den Zellkern von der frühen Prophase. Chromatin Morphologien wurden unter Verwendung koexprimierter His2BmRFP als Marker (B8-14). Balken = 5 mm. Beispiel 2: SAC-Funktionen lassen sich durch die Manipulation der Embryonen durch Mikroinjektion Antikörper, fluoreszenzmarkierten Proteine ​​oder chemica studiert werdenl Verbindungen von Interesse, dass potenziell auslösen SAC. Zum Beispiel Einspritzen Colchicin, um die Mikrotubuli depolymerisieren, so provoziert die SAC wie in 4 10 bezeichnet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> Abbildung 4. Mad2 ist essentiell für Colchicin-SAC aufgerufene Funktion 10. GFP-Cdc20; MAD2 + / +, GFP-Cdc20; MAD2 EY (MAD2 - / - Null-Mutante) und GFP-MAD2; MAD2 EY Embryonen wurden mit Colchicin durch Mikroinjektion behandelt. Zeitraffer-konfokalen Bilder wurden vor (01, 07 &amp; 13) oder nach der Injektion genommen (02-06, Abdeckplatten, 08-12, Mitte Platten; 14-18, Bodenplatten). GFP-Cdc20 (obere und mittlere Panels) oder GFP-Mad2 (unten) Kinetochor Signale wurden als Zellzyklus-Marker verwendet. Top Panel zeigen die Pfeile die verhafteten Kinetochoren in 6.2. Der durch einen Pfeil in 01 gekennzeichnet darauf hinweisen, dass vor Colchizinbehandlung, GFP-CDC20 wird aus dem späten Interphasekern ausgeschlossen. Das mittlere Feld, in Abwesenheit von endogener Mad2, weiterhin GFP-Cdc20-Signale zum Schwingen in und aus dem Kern, und auf und abseits der Kinetochoren, obwohl Zytokinese scheint defekt sind, würde in Mäusen ohne Mikrotubuli zu erwarten, in Gegenwart von Colchicin (durch Pfeile in 07 bis 12) was auf eine nicht SAC-Funktion bei der Verhaftung Zellen als Reaktion auf Colchicin Behandlung. Die Trennung von Tochterkern scheiterte in Bild 10. Unteres Feld, zeigen Pfeilspitzen in 14-18 verhaftet Kinetochoren mit den kumulierten GFP-Fusionsproteine ​​Mad2, um die funktionelle GFP-Mad2 in die Rettung SAC Defekt Phänotyp in Mad2 mutierten Embryo vorschlagen. Arrowhead in 13 zeigt GFP-Mad2 Anreicherung in einem späten Interphasekern. Bar = 5mm. Die Embryonen wurden mit ~ 1% Ei Volumen eines 100mg/ml Colchicin Stammlösung in 1 x PBS mikroinjiziert.

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	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+a+spindle+checkpoint.">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li><li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC/C+inhibition+by+the+spindle+checkpoint.">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li><li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells.">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li><li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+binding+of+p31(comet)+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint.">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li><li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC/cyclosome+in+Xenopus+egg+extracts.">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li><li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein/dynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation.">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li><li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster.">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li><li>Karess, R. E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Das hier beschriebene Protokoll ist ein generisches Verfahren zur Abbildung von fliegen-Syncytial-Embryonen mit einem Leica TCS SP2 konfokalen Laser Scanning Mikroskop und kann modifiziert werden, um anderen Mikroskop-Systeme angepasst werden und kann auch so angepasst, andere Genfunktionen mit Drosophila-Syncytial-Embryonen zu untersuchen. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um viele Aspekte der Spindel Checkpoint-, Protein-und Protein-Dynamik Proteolyse unter Verwendung von transgenen Fliegen oder polyklonale Antikörper, das Protein-Lokalisierung in lebenden oder fixierten Proben 4,6,12-14 visualisieren zu studieren. Am einfachsten ist es, um die Fliegen in frisch essen fliegen Fläschchen halten bei der Erhebung kleinen Zahlen (~ 10 - 100) von Eiern. Dies reduziert den Aufwand zu machen und die Vorbereitung zusätzlicher Apfelsaft Agarplatten und Eiersammlung Kammern wie auch in anderen Publikationen 15,16 beschrieben. Die Zugabe von einem kleinen Stück Defekten Deckglas Glas an einem Ende des Klebestreifens auf dem Deckglas macht es viel leichter, um die Nadel zu öffnen und bestimmt die Einspritzmenge durch Einstellen der Mikroinjektion Systemeinstellungen, während die Nadel in der 10S Öl eingetaucht ist. Der Grad der Austrocknung des Embryos ist für den Erfolg der Injektion in der Vermeidung von Leckagen und die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit Embryonen besonders für jene Experimente, die einen langen Zeitraum erfordern oder beim Anheben Transformanten nach der Injektion wichtig. Jedoch gibt es keine goldene Regel für wie lange Austrocknung erforderlich ist. Dies variiert von Versuch zu Versuch und hängt von der Menge der Lösung injiziert und der Feuchtigkeit der Arbeitsumgebung. Die Funktionen eines bestimmten Protein von Interesse kann durch Mikroinjektion spezifischen Protein-Hemmer, mono-oder poly-klonale Antikörper gegen ein bestimmtes Protein, Boten-RNA oder fluoreszenzmarkierte Peptide unter Wildtyp oder genetische Mutation Hintergründe manipuliert werden. Viele dieser Mutante Linien oder GFP-markierten transgenen Linien sind öffentlich avht verfügbar ab Lager Drosophila-Zentren und die meisten von ihnen basieren auf FlyBase (aufgelistet <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) und kann für Online durchsucht werden.

Wesentliche Geräte und Reagenzien: Konfokale Abbildungssystem: Abbildungssystem nach diesem Protokoll beschrieben ist ein Leica TCS SP2 konfokaler invertierten Mikroskop-System. Das beschriebene Verfahren ist auch geeignet vielleicht mit leichten Modifikationen für andere bildgebende Systeme. Seziermikroskop: Wir verwenden eine Olympus SZX7 mit DF PLAPO 1X-4-Objektiv. Needle Puller: Flaming / braun Feinpipettenziehvorrichtung (von Sutter, Modell: P-97). Mikroinjektion System: Eine Mikroinjektion Eppendorf-System beschrieben, aber jede andere geeignete System verwendet werden kann. Fly Lebensmittel Distributor: Jencons Scientific Ltd Schlauchpumpe. Reagenzien: <table border="1"><tbody><tr><td> Zutaten </td><td> Gewichts </td><td> Ressourcen </td><td> Los Nr. </td></tr><tr><td> Maismehl </td><td> 100,0 g </td><td> SUMA, UK </td><td></td></tr><tr><td> Brauner Zucker </td><td> 50,0 g </td><td> Billingtons, UK </td><td></td></tr><tr><td> Trockenhefe </td><td> 25,0 g </td><td> DCL HEFE Ltd UK </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 12.5g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> Sorbinsäure </td><td> 0,4 g </td><td> BDH, VWR International Ltd UK </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> Benzoesäure </td><td> 2.9g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (Methyl-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0,9 g </td><td> BDH, VWR International Ltd UK </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O bis zu 1 l </td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabelle 1. Fly Lebensmittelzutaten. Holocarbon 700 und 27 Ölen von Sigma bezogen. Trockenhefe: Thomas Allison, UK. Vorbereiten des Heptan Leim: Nehmen Sie etwa 1,5 Meter von doppelseitigen Klebeband, steckte es in einen 15ml Falcon-Röhrchen mit 5 ml Heptan und drehen für 3-5 Stunden oder über Nacht. Nach dieser Zeit in 4 gleiche Aliquots in 1,5 ml Eppendorf-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und Spin für 5 min bei hoher Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge, um die Verunreinigungen zu entfernen. Lagern Sie den Leim Heptan-Lösung in einem 10 ml-Messkolben und halten für den Einsatz. Der Klebstoff Stärke wird je nach der Konzentration und die Mengen des verwendeten Klebers variieren. Normalerweise produziert der dünneren Leim weniger verrauschten Hintergrund, wenn sie von konfokalen Mikroskop gescannt. <ul><li> Deckglas: BDH, VWR International Ltd UK </li><li> Objektträger: BDH, VWR International Ltd UK &lt;/ Li&gt; <li> Silikonisierte Glaskapillaren: GC-100-10, Harvard </li><li> Feine Ladetipp: 20 &amp;mgr; Eppendorf Menge: W215818J </li><li> Pinzette </li><li> Feine Pinsel Stift </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

Die Spindelanordnung Prüfpunkt (SAC) Mechanismus ist ein aktives Signal, das die Interaktion zwischen Chromosom Kinetochoren und der Spindel-Mikrotubuli überwacht, um Anaphase Einsetzen verhindern, bis die Chromosomen korrekt angeschlossen sind. Zellen nutzen diesen Mechanismus, um Aneuploidie oder genomische Instabilität und damit Krebs und andere Krankheiten des Menschen wie Geburtsfehler und Alzheimer-1 zu verhindern. Eine Reihe der SAC-Komponenten wie Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, haben Rod und Aurora B-Kinase identifiziert worden und sie sind alle Kinetochor dynamische Proteine ​​2. Hinweise darauf, dass das Kinetochor, wo der SAC-Signal wird ausgelöst ist. Der SAC Prime regulatorische Ziel ist Cdc20. Cdc20 ist eines der wesentlichen APC / C (A naphase P ÖRDERUNG C omplex oder C yclosome) Aktivatoren 3 und ist auch eine dynamische Protein Kinetochor 4-6. Wenn aktiviert, verhindert die SAC die Aktivität der APC / C zu verhindern, dass die Zerstörung der beiden wichtigsten Substrate, Cyclin B und Securin, wodurch die Metaphase, um den Übergang 7,8 Anaphase. Genau wie die SAC-Signal ausgelöst wird und auf den Kinetochoren montiert und weitergeleitet auf den APC / C zu hemmen, seine Funktion noch in weiter Ferne. Drosophila ist ein extrem gefügig experimentelles System, eine viel einfachere und besser verstandenen Organismus für das menschliche, sondern ein Vergleich, dass die Aktien grundlegenden Prozesse gemeinsam. Es ist vielleicht eine der besten Organismen für Bio-Imaging-Studien in lebenden Zellen zu verwenden, besonders für die Visualisierung der mitotische Ereignisse in Raum und Zeit, wie der frühe Embryo geht durch 13 schnelle Kernteilung Zyklen synchron (8-10 Minuten für jeden Zyklus bei 25 ° C) nach und nach organisiert die Kerne in einer einzelnen Monoschicht nur unter dem Kortex 9. Hier präsentiere ich eine Bio-Imaging-Methode unter Verwendung von transgenen Drosophila expressingen GFP (Green Fluorescent Protein) oder dessen Variante gezielte Proteine ​​von Interesse und einem Leica TCS SP2 konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop-System, um die SAC-Funktion im Fliegen zu studieren, indem sie zeigt Bilder von GFP-Fusionsproteinen von einigen der SAC-Komponenten, Cdc20 und Mad2 , als Beispiel.

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Das Kinetochor ist, wo der SAC initiiert sein Signal Überwachung der mitotischen Segregation der Schwesterchromatiden. Es wird eine Methode beschrieben, um die Rekrutierung und den Umsatz von einer der Kinetochorproteine ​​und ihre Abstimmung mit dem Chromosom Bewegung visualisieren, in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen mit einem Leica Laser-Scanning-konfokalen System.

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

studying-mitotic-checkpoint-illustrating-dynamic-kinetochore-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K Aufrufe.  University of Newcastle, United Kingdom. Das Kinetochor ist, wo der SAC initiiert sein Signal Überwachung der mitotischen Segregation der Schwesterchromatiden. Es wird eine Methode beschrieben, um die Rekrutierung und den Umsatz von einer der Kinetochorproteine ​​und ihre Abstimmung mit dem Chromosom Bewegung visualisieren, in Drosophila Embryonen mit einem Leica Laser-Scanning-konfokalen System.

Serie: Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Forschung

Biologie

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi-Interferenz durch dsRNA Injektion in Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-

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