Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin und der Schweizerischen National Science Foundation (31003A-116624) gefördert.

Ein. Einrichten Organotypische Cerebellar Scheibe Kulturen Cerebellar Slice-Kulturen aus postnatalen Tag 8 P (8) mit der Maus Welpen mit der statischen Inkubation Verfahren 10 hergestellt. In unserem Labor verwenden wir B6CF1 Mäusen. In einigen Experimenten auch transgene Mäuse wurden verwendet, ausdrücken EGFP selektiv in Purkinje-Zellen. Die Aufstellung von Slice-Kulturen dauert etwa 30 Minuten pro Maus pup, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Maus Welpen. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumente durchgeführt. <ol><li> Das Kleinhirn der Maus P8 Jungtieren wird aus dem Gehirn in eiskaltem Herstellungsmedium (MEM (Gibco Katalog Nr. 11012) mit Glutamax 1:100, pH 7,3) mit einem Stereomikroskop seziert. </li><li> Das Kleinhirn ist in 350 um dicke Scheiben in der sagittalen Ausrichtung mit Hilfe eines McIlwain Gewebe Chopper geschnitten. </li><li> Die Scheiben werden auf Millipore Zellkultur-Inserts (ca.6 Slice platzierts pro Einsatz, Millipore PICM03050) und werden in 6-well Platten mit 0,75 ml pro Vertiefung der Inkubationsmedium (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml Pferdeserum, 1ml Glutamax I, 0,65 ml einer sterilen 10% Glucose inkubiert Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C. Alle Reagenzien Zellkultur wurden von Gibco, Invitrogen. </li><li> Pharmakologische Behandlungen sind in der Regel nach 3 Tagen in vitro (DIV3) durch Zugabe des Wirkstoffes in der gewünschten Konzentration zu dem Kulturmedium gestartet. Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) und (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) stammten von Tocris, UK. Da viele Arzneistoffe die Verwendung von DMSO oder Ethanol zur Herstellung einer Stammlösung (zB PMA) erfordern sollte darauf geachtet werden, daß die Gesamtmenge des Lösungsmittels zu dem Kulturmedium zugegeben nicht mehr als 1% (7,5 ul pro Vertiefung) werden. Die Wirkstoffe werden zusammen mit der Änderung des Kulturmediums alle 2. oder 3. Tag erneuert. </li></ol> 2. Fixierung und ImmunosTaining der Organotypische Cerebellar Scheibe Kulturen Ein wichtiger Vorteil ist, dass das Kleinhirn Antikörper verfügbar sind, die spezifisch und helle Verfärbung die prinzipiellen Kleinhirnneuronen, dh Purkinje-Zellen und Körnerzellen. Die dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen können durch Immunfärbung mit Anti-Calbindin D28K enthüllt werden. <ol><li> Zur Fixierung der Kulturen wird das Kulturmedium entfernt und 3 ml kaltem 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) pro Vertiefung werden sorgfältig mit dem Einsatz mit der Millicell zerebelläre Scheiben an der Membran aufgenommen. Die Kulturen werden über Nacht fixiert dann das Fixiermittel entfernt und die Kulturen werden mit Phosphatpuffer gespült. </li><li> Immunfärbung für folgende Antikörper verwendet: Kaninchen-anti-D-Calbindin 28K (Swant, Bellinzona, Schweiz) bei 1:1000 zum selektiven Visualisierung Purkinje-Zellen und monoklonalen Anti-NeuN (Chemicon, Millipore) bei 1:500 zum selektiven Visualisierung Granulatmenle Zellen 12. Rabbit anti-GFP war von Abcam, UK. Fluoreszierenden sekundären Alexa Antikörper wurden von Molecular Probes, Invitrogen. </li><li> Die Kulturen werden permeabilisiert und durch Zugabe von 3% normales Ziegenserum + 0,3% Triton X100 in 0,1 M Phosphatpuffer (Blockierungslösung) blockiert. Anti-Calbindin D28K und Anti-NeuN in Blockierungslösung verdünnt, und die Kulturen werden mit der Lösung, welche die blockierenden Antikörpern über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren inkubiert. Alle Verdünnungen in% (v / v) angegeben, erfolgt Triton X100 aus einer 10% Stammlösung genommen, um Pipettieren erleichtern. </li><li> Die Kulturen werden gespült 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer und werden dann mit entsprechenden zweiten Antikörper, z. B. Ziege anti-Kaninchen-Alexa 568 und Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488 inkubiert verdünnt 1:500 in 0,1 M Phosphat-Puffer + 0,1% Triton X100 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Kulturen werden dann gespült 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Die gefärbten Scheiben werden aus der Kultur entferntauch mit einem Pinsel und auf Superfrost Plus Objektträger montiert und eingedeckt mit einem geeigneten Eindeckmedium, z. B. Mowiol. Die Kulturen können nun auf einer regelmäßigen Epifluoreszenz-Mikroskop mit Geräten oder mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden. </li></ol> 3. Anzeigen einzelner Purkinje Zellen in organotypischen Kulturen <ol><li> Nach Immunfärbung mit Calbindin D28k die komplette Zytoplasma der Purkinje-Zellen ist hell einschließlich der Dendriten und dem Axon gefärbt. Aufgrund der dichten Ausrichtung Purkinje Zellen in der Purkinje-Zellschicht werden die dendritischen Dornen von höchstens Purkinjezellen überlappenden was es schwierig macht, das komplette Dorn einer Einzelzelle zu studieren. Aufgrund Zelltod einiger Purkinjezellen während des Herstellungsverfahrens, in vielen Kulturen einige Bereiche vorhanden sind, mit einer reduzierten Dichte von Purkinje-Zellen. In solchen Gebieten ist es möglich, Purkinje-Zellen mit einem vollständigen dendritischen Dorn, der nicht mit anderen c überlappt findenEllen. In diesen Zellen kann die dendritischen arbor betrachtet und analysiert werden in einer Qualität vergleichbar mit einem Golgi-Färbung. Da im Kleinhirn die Purkinje-Zellen der einzige Zelltyp Ausdruck Calbindin D28K sind die Zellen werden auch als Purkinje-Zellen identifiziert. </li><li> Ein alternatives Verfahren ist es, aus Kulturen B6 abgeleitet verwenden; FVB-Tg (pCP2-EGFP) 146.244Yuza / J-Mäusen (hier genannt pCP2-EGFP Mäusen, erhältlich von Jackson Laboratories), die unter dem Ausdruck EGFP Purkinje zellspezifischen Promotor L7 11. In solchen Slice-Kulturen leben Purkinje Zellen visualisiert werden durch die Expression von EGFP. Es ist auch möglich, die dendritische Morphologie einer einzelnen Zelle mit der Zeit folgen. Alternativ können nach Fixation kann EGFP-exprimierende Purkinje-Zellen mit einem Anti-GFP-Antikörper immungefärbt werden. Beide Verfahren eignen sich zur Färbung Dendriten, Zellkörper und Axone der Purkinje-Zellen in organotypischen Kulturen. Weil der L7-Promotor in den pCP2-EGFP Mäusen ist nicht in jedem Purkinje-Zelle exprimiert und es gibt variationen im Frequenzbereich auszudrücken Purkinjezellen zwischen Mäusen (Kapfhammer, Daten nicht gezeigt) schneiden Kulturen von diesen Mäusen abgeleitet erleichtern, zu visualisieren und zu messen Purkinje-Zellen, die dendritischen Bäumen, die mit anderen Purkinjezelle Dendritenbäume überlappen. Solche dendritischen Bäume können einzeln betrachtet werden, wenn die benachbarten Purkinje Zellen mit überlappenden Dendritenbäumen nicht exprimieren GFP (Abbildung 1A, B). </li></ol> 4. Messung der Purkinje Zelle Dendritische Baum Größe und Branch Punkte <ol><li> Dendritenbaum Größe. Mit der Fluoreszenzmarkierung Purkinjezellen die Größe des Dendritenbaum einer gegebenen Zelle kann leicht gemessen werden, wenn der Baum nicht überlappenden mit anderen Zellen werden. Da die Etiketten Calbindin Immunfärbung alle Purkinje-Zellen, kann es schwierig sein, um Zellen mit nicht überlappenden Dendritenbäume identifizieren. In diesem Fall ist die Verwendung des pCP2-EGFP ist empfehlenswert, um die Identifizierung von ausreichender Purkinjezelle vereinfachens bei nichtüberlappenden Dendritenbäume. Sobald ein Purkinje-Zelle mit einem nicht-überlappenden dendritischen Baumes identifiziert wird, wird es mit dem 20fach-Objektiv gesehen wird und ein Bild mit einer Digitalkamera aufgezeichnet. Dieses Bild kann dann mit einem Bildanalyse-Programms analysiert. Wir verwenden Image Pro Plus, das umreißt die Dendritenbaum der Zelle mit einem einzigen Mausklick mit dem Zauberstab-Werkzeug im Messbetrieb (2A) ermöglicht. Das Programm berechnet dann den durch die dendritischen Baumes abgedeckt und exportiert sie in MS Excel. Die statistische Analyse der Daten mit GraphPad Prism Software (siehe unten) erfolgen. </li><li> Anzahl der Verzweigungspunkte. Aufgrund der stark verzweigten und feine Morphologie der Purkinje-Zellen dendritische Ast Punkte müssen manuell gezählt werden. Die 20x-Image-Datei der Purkinjezellen ist so, dass es die meisten der Bildschirm mit Adobe Photoshop deckt erkennen. Dann wird jeder Verzweigungspunkt wird gezählt und mit einem hellen Punkt (Abbildung 2B). </li></ol> Überwachung der Entwicklung der Purkinje Zelle Dendritenbaum während der Anzucht Organotypischen Kulturen aus pCP2-EGFP-Mäusen, die EGFP exprimieren spezifisch in Purkinje-Zellen abgeleitet ermöglichen, um die Morphologie der einzelnen Zellen während mehrerer Tage in Kultur zu untersuchen. Auf diese Weise das Wachstum und die Entwicklung des Dendritenbaum während der Anzucht kann schön dokumentiert. Wohnzimmer identifiziert Purkinje Zellen wurden fotografiert jeden 2. oder 3. Tag während der Anzucht mit dem Objektiv 10x. Diese Low-Power-Ziel wurde gewählt, um zu vermeiden und phototoxische Schädigung der Zellen durch die Beleuchtung mit Leuchtstoffröhren. Abbildung 3 zeigt zwei Beispiele von Purkinje-Zellen im lebenden Kulturen fotografiert. Die erste Zelle wurde aus 2 Tagen in vitro bis zu 7 Tagen in vitro (Abb. 3, AC) gefolgt. Es ist offensichtlich, dass die dendritic Baum dieser Zelle während dieser Zeit wächst mehrere neue Filialen und expandiert in Größe. In dem zweiten Beispiel wurde ein Purkinje-Zelle 4 bis 11 Tagen in vitro (Abb. 3, DF) gefolgt. Der kleine Dendritenbaum anwesend DIV4 expandiert im Wesentlichen während dieser Zeit. Beide Beispiele zeigen, dass die meisten der dendritischen Struktur der Purkinje-Zellen am Ende der Kulturperiode präsentieren tatsächlich in der Kultur zu entwickeln. Entwicklung der Purkinje-Zellen dendritische Baum wird durch PKC oder mGluR1 Stimulation inhibiert Organotypischen zerebelläre Slice-Kulturen wurden für 11 Tage kultiviert. Ab dem 2. Tag in vitro, einige der Kulturen wurden mit entweder PMA (50 nM), einem Phorbolester Stimulieren PKC oder DHPG (10 uM), ein mGluR1 Agonist, behandelt, bis die Kulturen wurden fixiert. Beide Verbindungen wurden bereits zu hemmen und begrenzen Purkinjezelle dendritisches Wachstum 7, 8, 9, 5 dargestellt.In der unbehandelten Kontrolle Scheiben Purkinje Zellen entwickelten eine typische große und hochverzweigte dendritische Baum, visualisiert entweder durch anti-Calbindin Immunfärbung (4A) oder in Kulturen mit EGFP-exprimierende Purkinje-Zellen wurde durch Immunfärbung mit Anti-GFP (4D). In Kulturen mit PMA behandelt die Morphologie der dendritischen Baum wurde grundlegend verändert. Die Dendriten erschien verdickt und hatte nur wenige Seitenzweige. Viele Purkinje-Zellen, anders als in Kontrollkulturen, waren nicht mehr unipolar, mit einer primären Dendrit ausgehenden vom Zellkörper, sondern entwickelt zwei oder noch mehr primären Dendriten (4B, E). Das Gebiet der dendritischen Baumes abgedeckt wurde deutlich reduziert (siehe unten). Eine ähnliche Situation war in DHPG-behandelten Kulturen. Die Dendritenbaum der Purkinje-Zellen wurde stark verkleinert und die Verzweigung wurde deutlich reduziert (4C, F). Allerdings gibt es auch einige qualitative Unterschiede zu PMA-behandelten Kulturen verglichen. Es gab keine Verdickung der dendritischen Äste, und die primären Dendriten durchgeführt vielen sehr kurzen sekundären Dendriten (4C, F) darauf hindeutet, dass die Signalisierungsereignisse los in PMA-behandelten und DHPG Purkinjezellen kann ähnlich, aber nicht identisch. Quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum Größe und Branche Punkten Zur quantitativen Auswertung wird die Größe der Purkinje Zelle Dendritenbaum und die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Purkinje Zelle wie oben beschrieben gemessen. Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind zusammen gepoolt und ein Minimum von 20 Zellen analysiert werden müssen. Der Mittelwert des durch die dendritischen Bäume für den Kontrollexperimenten abgedeckt wird bestimmt und als 100% gesetzt und die Werte für die anderen Versuche werden als prozentuale Werte entsprechend ausgedrückt. Die statistische Analyse der Daten mit GraphPad Prism Software durchgeführt. Weil wir nichtangenommen, dass alle Werte bestimmt Teil einer Gaußverteilung sind, verwenden wir statistische Tests, die nicht davon ausgehen kann eine solche Verteilung der gemessenen Werte. Für den Vergleich mehrerer Bedingungen und Tests für die statistische Signifikanz, verwenden wir Kruskal-Wallis-Test nach einem geeigneten Verfahren für Post-Hoc-Tests für Rang-basierte Statistiken folgte, wie z. B. in der Dunns Post-Test in GraphPad Prism umgesetzt. Die Ergebnisse werden in der Regel als Balkendiagramme dargestellt. Ein Beispiel für eine solche statistische Auswertung ist in Abbildung 5 gegeben. Sowohl die Analyse der dendritischen Baumes Größe (5A) und die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Purkinje Zelle (5B) zeigen deutliche Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und DHPG oder PMA Behandlung. Beide Parameter waren unterschiedlich mit einer statistischen Signifikanz von p &lt;0,001 nach dem Kruskal-Wallis-Test. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> FiguRE 1. EGFP-markierten Purkinje Zelle. In pCP2-EGFP Mäusen nicht alle Purkinje-Zellen exprimieren EGFP. Daher kann Dendritenbäume einiger Purkinjezellen einzeln betrachtet werden, wenn sie ausdrücklich EGFP (EGFP Kanal in A) und die benachbarten Purkinjezellen mit überlappenden Dendritenbäume nicht (negativ in EGFP Kanal in A gezeigt, positiv in die Anti-Färbung gezeigt Calbindin im roten Kanal in B). Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Abbildung 2. Messung der Parameter des dendritischen Purkinjezellen. (A). Die Größe des dendritischen Baumes können durch Rückverfolgung der Umriss des Purkinje Zelle mit einem einzigen Mausklick in der Bildanalyse-Software Image Pro plus mit dem Zauberstab-Werkzeug gemessen werden. Der Zauberstab wird so verwendet, dass die gesamte Dendritenbaum einschließlich des Zellsoma und alle dendritischen Zweigen vollständig umgeben von der Linie. (B). Die Zahl der Verzweigungspunkte ist coumanuell in Bilder Purkinjezellen nted. Jeder Knotenpunkt ist mit einem gelben Punkt markiert. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Abbildung 3. Überwachung der Entwicklung der Purkinje Zelle dendritischen Baumes. Identifizierte Purkinje Zellen wurden wiederholt, um das Wachstum der Dendriten zu überwachen fotografiert. (AC): Dendritische Baum einer Purkinje Zelle wächst und entwickelt sich von Tag in vitro (DIV) 2 bis DIV7. Es gibt kontinuierliche Wachstum und Verzweigung der Dendriten während dieser Kulturperiode. (DF): Dendritische Baum einer Purkinje-Zelle wächst und entwickelt von DIV4 bis DIV11. Die dendritische Struktur erweitert Wesentlichen während dieser Kultur Zeitraum. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Abbildung 4. Entwicklung der Purkinje-Zellen dendritische Baum wird durch PKC oder mGluR1 stimulati gesperrtauf (A), (D):. Unbehandelte Kontrollzellen mit einem gut entwickelten Dendritenbaum. (B), (E): Nach 9 Tagen nach PMA-Behandlung Dendriten erscheinen verdickt und der Dendritenbaum ist stark in Größe verringert. Cells verlieren oft ihre Polarisation und werden bipolar (E). (C), (F): Nach 9 Tagen nach DHPG Behandlung das dendritische Baum stark verkleinert. Anders als in der PMA-Behandlung, sind viele sehr feinen und kurzen vorliegende Seitenäste an den primären und sekundären Dendriten. Cells verlieren oft ihre Polarisation und werden bipolar (F). Purkinje Zellen wurden durch Anti-Calbindin Immunfärbung visualisiert (A - C) und durch EGFP-Expression in Kulturen aus pCP2-EGFP Mäuse in (D - F) abgeleitet wird. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Abbildung 5. Quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum Größe und Verzweigung. Quantitative Messungen zeigen, dass sowohl Dendritenbaum Größe (obere Balken) und die number von Verzweigungspunkten (untere Balken) sind stark nach PMA oder DHPG Behandlung reduziert. Unterschiede zwischen Kontroll-Dendritenbäumen und dendritischen Bäume Purkinje Zellen von behandelten Kulturen waren signifikant mit p &lt;0,001.

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I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) durchgeführt und wurden überprüft und zugelassen durch die Schweizer Behörden. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen Purkinjezelle dendritische Entwicklung in organotypischen zerebelläre Schnittkulturen studieren und quantitativ auszuwerten Purkinjezelle dendritischen Expansion durch Messen Dendritenbaum Größe und die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte. Natürlich ist ein umfangreicher und ausgefeilte quantitative Analyse von Purkinje-Dendriten möglich, z. B. durch Bestimmung der gesamten dendritischen Länge, Durchführen einer Analyse oder Sholl Bestimmung der fraktalen Dimension des dendritischen Baumes. Für diese Art der Analyse ist in der Regel erforderlich, um manuell den gesamten Trace Purkinjezelle Dendritenbaum in ein Analyseprogramm beispielsweise Neuro-Lucida. Während diese verfeinerte Methoden sicherlich ergeben ein überlegenes Niveau der Analyse (siehe z. B. 1, 6), sind sie zeitaufwändig und erfordern mehr spezialisierte Ausrüstung und Analyse-Software im Vergleich zu den hier vorgestellten Methoden. Für die meisten Anwendungen, insbesondere in Situationen, wo die Änderungenin den Purkinje-Dendriten sind beträchtlich und qualitativ sichtbar, wurden die einfachen Methoden vorgestellt wird ausreichend sein. Es sollte beachtet werden, dass die organotypische zerebelläre Schnittkulturen aus P8 Mäusen abgeleitet wird nur die spätere Phase der Purkinje-Zelle dendritischen Entwicklung durch rasche Expansion gekennzeichnet dendritischen abzudecken. Für das Studium der früheren Stadien, muss der Kokultur Methode, um Scheiben von Neugeborenen oder embryonalen Tieren, die dann die früheren Phasen der dendritischen Entwicklung (z. B. 2) bestimmt werden angepasst. Die Anti-Calbindin Immunfärbung und die Verwendung von Mäusen mit EGFP exprimieren Purkinjezellen: für die Visualisierung von Purkinje-Zellen des Kleinhirns in organotypischen Kulturen Scheibe haben wir nur auf zwei Routineverfahren fokussiert. Natürlich mehr Methoden zur Verfügung, insbesondere biolistischen oder virale Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen, diolistic Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen und intrazellulären Farbstoff-Injektionen in einzelne Purkinjezellen. Je nach den Anforderungen der Studie und der verfügbaren Ausrüstung im Labor diese Verfahren erheblich verbessern kann das Niveau der Analyse der Purkinje-Zelle dendritische Morphologie, beispielsweise durch eine Analyse mit Hilfe einer konfokalen dendritischen Dornen oder zwei Photonen-Mikroskopie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Zellkultureinsätze </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Die PICMORG50 Einsätze haben einen niedrigen Rand und ermöglichen die Anzeige von Live-Kulturen an einem Mikroskop </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medum Adler </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-Dihydroxy-phenylglycin (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Calbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti NeuN, Klon A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Purkinje-Zellen sind ein attraktives Modell für die Untersuchung dendritischen Entwicklung, weil sie eine beeindruckende Dendritenbaum die streng ausgerichtet ist in der Sagittalebene und entwickelt vor allem in der postnatalen Phase bei kleinen Nagern 3 haben. Darüber hinaus sind mehrere Antikörper zur Verfügung, die gezielt und intensiv Label Purkinje Zellen, einschließlich aller Prozesse, mit anti-Calbindin D28K die am meisten verbreitet. Zum Betrachten von Dendriten in lebenden Zellen sind Mäuse, die EGFP selektiv in Purkinje-Zellen 11 bis Jackson Labs zur Verfügung. Organotypische Kleinhirn Slice-Kulturen Zellen ermöglichen eine einfache experimentelle Manipulation der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung, weil die meisten der dendritischen Ausbau der Purkinje Zelle Dendritenbaum tatsächlich stattfindet während der Anzucht 4. Wir stellen Ihnen hier eine kurze, zuverlässige und einfach Protokoll für Ansicht und Analyse der dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen im organotypi gewachsenc Kleinhirn Slice-Kulturen. Für viele Zwecke ist eine quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum wünschenswert. Wir konzentrieren uns hier auf zwei Parameter, Größe und Dendritenbaum Verzweigungspunkt Zahlen, die sich schnell und einfach von anti-Calbindin gebeizt zerebelläre Schnittkulturen bestimmt werden kann. Diese beiden Parameter ergeben eine zuverlässige und empfindliche Messung der Veränderungen des Purkinjezelle Dendritenbaum. Am Beispiel der Behandlungen mit der Proteinkinase C (PKC) und der Aktivator PMA metabotropen Glutamat-Rezeptor 1 (mGluR1) zeigen wir, wie Unterschiede in der dendritischen Entwicklung visualisiert und quantitativ bewertet werden. Die Kombination des Vorhandenseins eines umfangreichen Dendritenbaum, selektive und intensive Immunfärbung Methoden organotypischen Kulturen, die die Periode des dendritischen Wachstums und einem Mausmodell Deckel mit Purkinje zellspezifische Expression EGFP machen Purkinjezellen ein leistungsfähiges Modellsystem für enthüllt die Mechanismen der dendritischen Entwicklung.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.5K Aufrufe.  University of Basel. Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Serie: The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Neurowissenschaften

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early postnatal development, cerebellar Purkinje cells are known to go through a vulnerable period, during which they undergo programmed cell death. Here, we provide a detailed protocol to perform mouse organotypic cerebellar slice culture during this critical time. The slices are further labeled to assess Purkinje cell survival and the efficacy of neuroprotective treatments. This method can be extremely valuable to screen for new neuroactive molecules.

Organotypic slice cultures are a powerful tool to study neurodevelopmental or degenerative/regenerative processes. Here, we describe a protocol that models the neurodevelopmental death of Purkinje cells in mouse cerebellar slice cultures. This method may benefit research in neuroprotective drug discovery.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kleinhirn-Purkinje-Zellen: DNA-Schadensreaktion in organotypischen Kulturen

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional activity, making them particularly vulnerable to DNA damage. This necessitates an efficient DNA damage response (DDR) to prevent cerebellar degeneration, often initiated by PC dysfunction or loss. A notable example is the genome instability syndrome, ataxia-telangiectasia (A-T), marked by progressive PC depletion and cerebellar deterioration. Investigating DDR mechanisms in PCs is vital for elucidating the pathways leading to their degeneration in such disorders. However, the complexity of isolating and cultivating PCs in vitro has long hindered research efforts. Murine cerebellar organotypic (slice) cultures offer a feasible alternative, closely mimicking the in vivo tissue environment. Yet, this model is constrained to DDR indicators amenable to microscopic imaging. We have refined the organotypic culture protocol, demonstrating that fluorescent imaging of protein-bound poly(ADP-ribose) (PAR) chains, a rapid and early DDR indicator, effectively reveals DDR dynamics in PCs within these cultures, in response to genotoxic stress.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Rolle von ATM bei Ataxie-Teleangiektasie und der damit verbundenen Kleinhirndegeneration

Cerebellar Purkinje cells (PCs) are particularly sensitive to deficiencies in the DNA damage response. A protocol is presented for the visual evaluation of the dynamics of PC response to DNA damage, which involves staining protein-bound poly(ADP-ribose) chains within cerebellar organotypic cultures.