Diese Arbeit wurde vom US National Science Foundation Zuschüsse # MCB-0741914 und MCB-0843627 unterstützt; weitere infrastrukturelle Unterstützung wurde am City College von New York vom National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 aus dem National Center for Research Resources zur Verfügung gestellt. Wir bedanken uns für das JKC Rose Gruppe in der Cornell University Pflanzenbiologie Abteilung für die Bereitstellung von M82 (Wildtyp) und CM15 (Mutante) Tomate Nagelhaut. Wir danken Dr. Spyros Monastiriotis aus dem CCNY Chemical Engineering Gruppe von Prof. Alexander Couzis für seine großzügige Hilfe bei den AFM-Experimente. Wir danken Frau Lauren Gohara für grafische Gestaltung unterstützt.

1. Enzymatische Isolierung von Tomato Schuppenschicht 5 <ol><li> Setzen Sie mehrere kommerzielle oder kultivierten Tomaten in eine Schüssel geben. Ziehen Sie die Haut von den Früchten in großen Teilen; entsorgen Sie den inneren Fruchtwand Gewebe. Waschen Sie die Tomaten-Skins mit VE-Wasser und bewahren sie unter Wasser in einem Becher. </li><li> Herstellen einer 50 mM pH 4,0 Natriumacetatpuffer (bei ​​31 ° C), indem 1,22 g Natriumacetat-Trihydrat (M r. 136,08 g / mol) und 2,34 ml Eisessig (17,485 M) in einem Becherglas, Zugabe von 200 ml VE-Wasser, und dann den pH-Wert bis 4,0 bei 31 ° C Vorbereiten einer Mischung, die 4 ml Pektinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1 TCI America), 0,2 g Cellulase (EC 232.734.4; 1,3 Einheiten / mg Feststoff, Sigma Aldrich) und 13 mg NaN 3, und fügen Sie dann 196 ml Natriumacetat-Puffer auf die Enzym-Mischung zu 200 ml des fertigen Enzym-Cocktail zu erhalten. 5 vollständig einzutauchen den geschälten Tomaten Haut in der Enzym-Cocktail und inkubierenbei 31 ° C für 24 Stunden unter ständigem Schütteln (G24 Environmental Incubator Shaker, New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Sammeln Sie die Tomatenhäuten mit einem Küchensieb oder Büchner-Trichter und waschen Sie sie mit VE-Wasser. Danach legen Sie sie in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schützen wir die getrockneten Tomaten Skins in einer verschlossenen Flasche etikettiert und für die anschließende Entparaffinierung Verfahren. </li></ol> 2. Ausgiebige Entwachsen durch Soxhlet-Extraktion 6 <ol><li> Die Ausrüstung für die abschließende Entparaffinierung verwendet besteht aus einer Wärmequelle (Heizmantel und Variac Controller), Rundkolben für eine Lösungsmittel-Reservoir, Soxhlet, Sinter-oder Einweg-Glas Fingerhut Extraktionshülse, Antiprellvorrichtung Chips und einem Kondensator (siehe Abb. 1). Beachten Sie, dass der schmale Siphon Arm (Teile 6 und 7 in Abb. 1) sehr empfindlich und anfällig für Brüche ist, der vorsichtig behandelt werden. </li><li> Setzen 0,5-1 g Tomate Haut (erhalten inSchritt 1.) in einem Mörser und mahlen die Probe zu einem groben Pulver mit einem Stößel, es sei denn die Proben für AFM-Messungen (Abschnitt 5) verwendet werden sollen. Füllen Sie ein Sinterglas-oder Einweg-Fingerhut etwa auf halber Strecke mit der Probe und mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig Platz an der Basis der Extraktionskolonne. </li><li> Dann wird der Kühler und wickeln ihn in Alufolie. Erhitzen Methanol-Lösungsmittel (ACS-Qualität) in Gegenwart von einigen Antiprellsensor Chips bis zum Kochen unter Rückfluss gekocht und leicht an den Wänden des Kolbens. Decken Sie die Lösungsmittel-Reservoir sowohl mit Glaswolle und Alufolie. Überprüfen Sie den Prozess für eine Stunde, tritt Einstellung der Variac Spannung, so dass das Reservoir sammelt etwa einem Tropfen pro Sekunde und Absaugen im Soxhlet-Apparat, wenn der Fingerhut voll ist. </li><li> Fahren Sie mit der Extraktion für 12 h, dann senken Sie den Heizmantel und lassen Sie das Gerät abkühlen. Entfernen der Haube und dem Reservoir als eine einzige Einheit, um das Lösungsmittel zu entsorgen. Verwenden Sie tweezeRS zu erhöhen Fingerhut bis knapp unter den Hals der Extraktionskolonne, abtropfen überschüssige Lösemittel aus, und platzieren Sie den Fingerhut auf einer sauberen Fläche. Kippen Sie die Extraktionskolonne zu ermöglichen Siphon in den Kolben unten. Ziehen Sie den Kolben und gießen Sie den Abfall in einen beschrifteten Abfallbehälter Lösungsmittel Behälter. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für aufeinanderfolgende Lösungsmittel von immer mehr abnahm Polarität, zB Chloroform und Hexan für 12 h in jedem Fall. </li><li> Lassen Sie die Tomaten Cutin Probe im Inneren der Fingerhut, entweder durch Blasen eines Stickstoffgasstrom darüber oder indem man ihn in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur trocknen. Schließlich messen die Masse der trockenen Probe und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur in einem Schraubdeckel-Glas mit Parafilm verschlossen. </li></ol> 3. Selektive Isolierung von epikutikulären und Intracuticular Wachse 3,4 <ol><li> Zuerst waschen ganze Tomaten (eine separate Charge von Tomaten von den in 1 beschrieben.) Mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie sie mit papER Handtücher und Kimwipes und legen sie stammen nach unten auf ein Stück Alufolie. </li><li> Malen Sie die ganze Tomaten mit 120% (w / w, Massenverhältnis) Gummiarabikum wässrigen Lösung in einer Top-Down-Mode und damit etwa eine Stunde für die Gummi Arabicum, um auf den Früchten die Haut trocknen, so dass ein dünner Film. Ziehen Sie diese Folie mit einer Pinzette vorsichtig ab, ohne Durchstechen der Haut Tomate. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. </li><li> Fügen Sie die Filme auf Fläschchen mit 1:1 (v / v) Chloroform-Wasser zugeben und 3 Minuten. Nach kräftigem Schütteln und Phasentrennung Pipette aus der Chloroform-Fraktionen und verdunsten sie in separaten Fläschchen aufgedeckt, so dass epikutikulären Wachs. Die Tomaten bleiben körperlich unversehrt. Man taucht sie in Chloroform für zwei Minuten bei Raumtemperatur und sammelt das intracuticular Wachs nach Verdampfen des Lösungsmittels. Nun, schälen Sie die Tomaten und behandeln sie enzymatisch (mit Cellulase und Pektinase in Natriumacetatpuffer) zu Cellulose und Pektin zu entfernen, bzw. (wie beschrieben in <strong&gt; 1). </li><li> Wenn gewünscht, führen erschöpfend Entparaffinierung auf diesen enzymatisch isolierte Kutikeln durch Soxhlet-Extraktion (siehe Schritt 2), mit drei Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität (Methanol, Chloroform, bzw. Hexan). </li></ol> 4. Molekulare Charakterisierung von Tomatenfrucht Cutin durch Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning Solid-State Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS Festkörper-NMR) 6 <ol><li> Platz 4-6 mg voll entwachste Tomate Nagelhaut (Zuschaltungen) in einem 1,6 mm Zirkonoxid fastMAS Rotor mit der vom Anbieter gelieferten Verpackung Werkzeug. (Entweder Boden entwachste Tomate Nagelhaut oder sehr kleine Stücke von teilweise entwachst Nagelhaut geeignet sind.) Stellen Sie sicher, dass die Probe gleichmäßig ist gepackt, aber nicht zu fest, im Rotor. Nach dem Anlegen der oberen Kappe, malen die Hälfte der Kappe mit einem schwarzen Filzstift-Tinten auf Messungen der Spin-Rate zu erleichtern. </li><li> Passen Sie die Shim des NMR-Spektrometers für minimale spektrale Linienbreite auf halber Höhe einRunde Kalibrierung des Protons (1 H) und Kohlenstoff (13 C) 90 ° Impulsbreiten mit einem Standard-Verbindung, wie Adamantan. </li><li> Mit Glycin oder Glutamin als Modell-Verbindungen, erhalten maximale Signalintensität durch die Optimierung aller Parameter (Hartmann-Hahn-Matching Leistungsstufen, 1 H - 13 C Kontaktzeit, heteronuklearen 1 H-Entkopplung Stärke) der Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) Experiment. Für Spektren bei einer 1 H-Frequenz von 600 MHz erworben empfohlenen Bedingungen sind 10 kHz oder 15 kHz dreht Frequenz, eine 3-Sekunden Verzögerung zwischen den Aufnahmen und SPINAL heteronuklearen Protonenentkopplung 7 bei einer magnetischen Feldstärke entspricht einer Frequenz von 185 kHz. </li><li> Legen Sie die Cutin gepackten Rotor in die Sonde. Legen Sie dann die Sonde in den Magneten. Erhöhen Sie die Schleuderdrehzahl bis zu 10 kHz allmählich auf Probe für eine gute Verpackung und Rotor Stabilität zu überprüfen. Überprüfen Sie die Endspinnverfahren Stabilität des Rotors innerhalb± 20 Hz. </li><li> Passen Sie den Tuning-und Matching-Kapazitäten der Sonde iterativ zu minimalen Leistung Reflexion sowohl 1 H und 13 C-NMR-Frequenzen zu erreichen. Stellen Sie den experimentellen Temperatur auf 25 ° C (oder Raumtemperatur). </li><li> Starten Sie den voroptimierte CPMAS Experiment entsprechend der Hartmann-Hahn-Matching Zustand am 10 kHz Spinnen Frequenz bestimmt. </li><li> Erwerben 4096 Transienten, Bedingung ist das Spektrum mit exponentiellen (Lorentz) Linienverbreiterung von 50-100 Hz, und führen Sie eine Fourier-Transformation, eine NMR-Spektrum von Signalintensität vs chemischen Abschirmung (ppm) zu generieren. </li><li> Verweis der 13 C-chemischen Verschiebungen von außen mit Adamantan Satz bei 38,4 ppm (-CH 2 - Gruppe) 8 als Standard. </li><li> Erhöhen der Rotorspinnmaschine Frequenz 15 kHz und wiederholen Sie die CPMAS (Schritte von 4,6 bis 4,8) entsprechend der Hartmann-Hahn-Anpassungsbedingung an diesem letzteren dreht Frequenz bestimmt. </li><li> Repebei den Experimenten CPMAS (Schritte von 4,1 bis 4,9) mit natürlichen (wachsartige) und teilweise entwachste Obst Nagelhaut Proben. </li></ol> 5. Probing the Tomato Cuticle Oberfläche mit einem Rasterkraftmikroskop (Digital Instruments Nanoscope IIIa; Verfahren variiert leicht unter den Mikroskopen) 6 <ol><li> Schalten Sie den Rastersondenmikroskop (SPM) (Abb. 2) und stellen Sie sicher, dass das Mikroskop-Modus-Schalter, um den Kontakt Atomic Force Microscopy (AFM)-Modus eingestellt ist. </li><li> Manuelles erhöhen SPM Kopf durch Drehen seiner zwei frei einstellbaren vorderen Knöpfe. Nehmen Sie das AFM tipholder aus dem SPM Kopf durch Drehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die vorhandene AFM-Cantilever von der tipholder zu entfernen, dann schnappen Sie sich einen neuen sorgfältig Siliziumnitrid Cantilever (AFM) aus der Verpackung, und installieren Sie sie in die Stelle der alten Ausleger. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die neu installierte AFM-Cantilever nicht zerbrochen ist. </li><li> Bringen the Tomaten Cuticula Probe (ein Abschnitt teilweise entwachst Tomaten Cuticula ~ 10 mm × 10 mm) auf eine Scheibe aus Edelstahl (Probe Puck) mit doppelseitigem Klebeband. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die Cuticula Oberfläche eben und glatt nach der Platzierung der Probe auf den Puck bleibt. </li><li> Setzen Sie den Puck mit der Tomate Nagelhaut Probe auf die magnetische Region an der Spitze des SPM-Scanner. </li><li> Stellen Sie die beiden vorderen Schrauben manuelle Einstellung des Scanners hohen indem Sie die Knöpfe, stellen Sie den Motor wieder Stellschraube auf etwa dem gleichen Niveau wie die anderen beiden vorderen Schrauben. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben gesetzt sind hoch genug, um nicht zu unterbrechen die AFM-Spitze beim Aufsetzen des tipholder in das SPM Kopf. </li><li> Setzen Sie die tipholder in das SPM Kopf und befestigen Sie ihn durch Anziehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes. </li><li> Nach dem Einschalten des Lasers, richten Sie den Laserpunkt auf der AFM-Cantilever über die zentrale (y) und rechts (x) Laser-Einstellknöpfe auf der Oberseite des Kopfes.Überwachen des reflektierten Laserstrahls auf ein Blatt Papier, um den Laserpunkt genau am Ende des Kraftsensors positionieren. </li><li> Die Position des beweglichen Spiegels iterativ unter Verwendung der Photodetektor Einstellknöpfe auf den maximalen Signalpegel (SUM-Signal) zu erreichen, damit sichergestellt wird, dass der reflektierte Laserstrahl wird gleichmäßig durch die vier Quadranten der Photodetektor empfangen. </li><li> Senken Sie die AFM-Spitze durch Zurückziehen der manuellen Einstellung vorderen Schrauben und den motorisierten zurück Stellschraube des SPM Scanner, optisch überwacht das Vorgehen der AFM-Spitze in Richtung der Probenoberfläche mit einem inversen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben auf dem gleichen Niveau sind, um Artefakte aus Abbildung eines gekippten Probe zu vermeiden. Bringen Sie die Spitze an die Probe, aber nicht so nahe, dass die Spitze berührt oder durchbricht der Probenoberfläche. </li><li> An dieser Stelle reflektiert das Laserlicht aus der AFM-Cantilever wird abprallen den beweglichen Spiegel auf den Photodetektor. Für die Kontakt-AFM-Modus mit einem Silikoncon-Nitrid-AFM-Spitze, Stellen Sie das Ausgangssignal (Vertical Deflection) Spannung bis -2 V für eine 0 V Sollwert und der DIFF-Signal (vertikal / horizontal Unterschied) auf 0 V durch Einstellen der Position des Spiegels. </li><li> Mit dem Nanoscope Software, auf dem Mikroskop-Symbol klicken und wählen Sie das entsprechende Profil (Kontakt Modus AFM). </li><li> Mit der &quot;Scan-Steuerungen-Einstellungen&quot;, stellen Sie die Abtastrate und die Scan-Format z. B. 10 Mikron Scan-Format und 2 Hz Abtastrate. </li><li> Lassen Sie die AFM-Spitze zur Probenoberfläche durch Klicken auf die Spitze eingreifen-Symbol zu engagieren. Durch die Steuerung der motorisierten hintere Schraube der SPM-Basis, wird das Programm jetzt zu senken, bis sie die Spitze der Probenoberfläche einrastet. Der Scan-Vorgang beginnt automatisch, sobald die Spitze erfolgreich engagiert hat. </li><li> Überwachen Sie den Scan-Vorgang mit den beiden Bild-Modi und Umfang der Software, Anpassung der Parameter wie Sollwert, integralen Verstärkung, Proportionalverstärkung, Scan-Format, Abtastrate, Linien und Muster / Linie iterativ, um die höchste zu erreichenauflösende Bilder. Starten Sie den Scanvorgang mit einem großen Sortiment z-Achse (Daten-Skala); dann vorsichtig reduzieren die Daten Skalenwert zu den besten Kontrast von Oberflächenstrukturen auf das Bild zu beobachten. Minimieren des Auftretens von weißen Bereichen in dem gescannten Bild, so dass die Höhe der Oberflächenmerkmale die verfügbare Z-Achse Bereich überschreitet anzuzeigen. </li><li> Nehmen Sie das Bild, um die Daten-Datei zu speichern, dann bearbeiten Sie die Daten mit Abflachung Funktionen zur Bild-Artefakte aufgrund der vertikalen (Z)-Scanner Drift-, Bild-Bögen und vertikalen Versatz zwischen Scan-Linien zu entfernen; 9 Schließlich berechnen die durchschnittliche Rauheit. Nach dem Speichern der Daten, schieben Sie der AFM-Spitze durch die Umkehr der Wirkung des Computer-gesteuerten Motor Schraube, die verwendet werden, um ihm aufzunehmen. Die Bildverarbeitung kann im Offline-Modus Bildanalyse und / oder durchgeführt werden, über einen anderen Computer. </li><li> Verwenden Sie die vorderen Unterseite grau Metall-Knöpfe des Düsenstock um die x-und y-Positionen der Scan-Bereich zu ändern, dann wiederholen Sie die Messung an fünf Standorten Probegen zu prüfen, Reproduzierbarkeit und ersetzt den AFM-Cantilever, wenn die Bildqualität verschlechtert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Chemische Verschiebung Analyse der CPMAS 13 C-NMR-Spektren (Abb. 3) identifiziert die wichtigsten funktionellen Gruppen in der erschöpfend entwachste Tomate Kutikula (Cutin). Die wichtigsten Kohlenstoff-Einheiten in der Cutin Biopolyester wurde festgestellt, dass langkettige Aliphaten (0-45 ppm), mit Sauerstoff angereichert Aliphaten (45 bis 110 ppm), mehrfach verklebt und Aromaten (110-160 ppm) und Carbonyle (160 bis 220 sein ppm). Die mit Sauerstoff angereicherten Alkylgruppen (CHO + CH 2 O) spielen eine wichtige Rolle bei der Festlegung kovalente Verbindungen zwischen den monomeren Einheiten der Cutin Biopolymer, wodurch die molekulare Architektur des Cutin Matrix. Unterschiede in der relativen Peak-Flächen im spektralen Bereich zwischen 45 und 100 ppm beobachtet nahe, dass die Mutante Cutin eine relativ große Menge der Querverbindung bildenden CHO structura hat<html> l-Einheiten im Vergleich zu den Wildtyp-Cutin; sorgfältige quantitative Messungen durch direkte Polarisation (DPMAS) NMR-Methoden 5 unterstützen diese Folgerung (Daten nicht gezeigt). CPMAS 13 C-NMR-Spektren zeigten auch eine schrittweise abnehmenden Wachs-Peak bei 31 ppm (Abb. 4), welche die sequenzielle Entfernung von epi-und intracuticular Wachse aus der Cutin-Wachs-Verbund unter Beibehaltung der wichtigsten chemischen Architektur der Cutin Biopolymer. Parallel AFM-Bild-Analyse (Abb. 5) ergab, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche durch die schrittweise Gewinnung von epi-und intracuticular Wachse aus der Frucht Nagelhaut, was bedeutet, Veränderungen in der Organisation der Kutikula der Montage. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Abbildung 1 Soxhlet-Apparat (Bild Quelle: Wikipedia). &quot;/&gt; Abbildung 2. A) Rastersondenmikroskop. B) SPM Kopf (in Anlehnung an die AFM-Trainingshandbuch von Digital Instruments zur Verfügung gestellt). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Abbildung 3. 150 MHz CPMAS 13 C-NMR-Spektren von erschöpfend entwachst roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut (Zuschaltungen) von Wildtyp-(M82) und Mutante (CM15) zeigen Resonanzen mit chemischen Verschiebungen entsprechend den funktionellen Gruppen eines vernetzten Hydroxyfettsäure Polyestermasse und auch einige mehrfach gebundenen Einheiten. Alle Spektren wurden mit einer 10 kHz-Frequenz Spinnen erworben. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Abbildung 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-Spektren von kommerziellen roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut zeigen Veränderungen der Zusammensetzung auf sequenzielle Entfernung epikutikulären intracuticular und Wachse von Gummi Arabicum mechanische Extraktion und einer two-Minuten-Chloroform-Dip, beziehungsweise. Alle Spektren wurden mit einer 15 kHz-Frequenz Spinnen erworben. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Abbildung 5. AFM-Aufnahmen und Rauheit Schätzungen für die teilweise entwachst kommerzielle Tomate Schuppenschicht in Abbildung 4 nach der stufenweise Abbau der epikutikulären (links) und intracuticular (rechts) Wachse beschrieben.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hierin beschriebenen Protokollen für detaillierte molekulare und mikroskaligen Charakterisierung eines komplexen hartnäckigen Pflanzenmaterial zu ermöglichen, ohne dass destruktive chemischen Abbau. Um die Vermischung der Cutin Biopolyester mit verschiedenen Lipide (Wachse), die die Organisationsstruktur der Kutikula der Montage, 10 haben wir durchgeführt und überwacht werden Verfahren zur selektiven Entfernung von epikutikulären intracuticular und Wachse aus der heterogenen Mischung kutikularen kontrollieren zu untersuchen. Solid-State-13 C-NMR wurde zur Gewinnung von Wachs molekularen Komponenten zu messen, und Rasterkraftmikroskopie diente dazu, die gleichzeitige Veränderungen in der Oberflächenrauheit zu untersuchen. 6,11 Um die Vernetzung der Fähigkeiten Zuschaltungen aus kultivierten Wildtyp-und Single-Gen vergleichen Mutant Tomatenfrüchten wurde Solid-State-13 C-NMR auch genutzt, um die relativen Zahlen von CHO und CH 2 O chemischen Einheiten zu schätzen. Eine Reihe von Design-Merkmals dieses Protokoll zeichnen. Als das Wachs Materialien umfassen eine Vielzahl von Lipiden, die Frucht Behandlung Kutikula mit einer Reihe von Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Polaritäten ist wichtig, abschließend Entparaffinieren zu erreichen. Darüber hinaus können Entwachsen von 8 Stunden bis 24 Stunden, je nach der Art der Cuticula Proben variieren. Um epikutikulärer Wachse konsequent Auszug aus dem intakten Frucht Kutikula, ist es zwingend notwendig, um die Klebstoffbeschichtung gleichmäßig auf der Oberfläche. Solid-State-CPMAS 13 C NMR-12 ist eine schnelle qualitative Methode zur Identifizierung verschiedener struktureller Komponenten des sehr heterogenen und unlöslichen pflanzlichen Biopolymeren unter Wahrung ihrer Muttersprache physikalischen Eigenschaften; 13 traditionelle Lösungs-NMR können auch verwendet werden, um die extrahierten Wachsmischungen zu charakterisieren. Wenn quantitative Abschätzung der funktionellen Gruppen ist für den intakten Pflanze Polymere, 5 High-Fidelity-Direkt-Polarisation Rotation im magischen Winkel (D gewünschtenPMAS) 13 C-NMR 5,14 ist als ergänzendes Verfahren verwendet werden. Genaue Quantifizierung der funktionellen Gruppen erfordert eine sorgfältige Optimierung der recycle mal, Anregungspuls Längen, und die Stärke der heteronuklearen Entkopplung. Der 15 heteronucleare Entkopplung für ein 1 H Feldstärke im Bereich von 50 kHz bis 185 kHz kann mit Hilfe des TPPM 16 oder eingestellt werden SPINAL 7 Methoden. Zusätzlich zu diesen Parametern, hängt die Empfindlichkeit der Messungen CPMAS auf dem Spin-Lock-Zeit und Hartmann-Hahn-Anpassungszustand. 15 In anstelle von herkömmlichen CPMAS, kann eine abgeschrägte Amplitude CP (RAMP-CP)-Technik implementiert werden, um das Kreuz zu maximieren -Polarisationseffizienz durch Variieren der Amplitude linear 1 H (~ 20-50%) oder tangential, während die Amplitude der Feldstärke 13 C konstant während der Spin-Lock-Periode (oder umgekehrt). 17,18 Durchführung der Messungen an CPMAS mindestens zwei verschiedene Rotor-Spinnerei Frequenzen ist zwingend notwendig, um Rotationsseitenbanden von den wichtigsten spektralen Spitzen zu unterscheiden. Concurrent AFM-Messungen im Kontakt-Modus durchgeführt, ermöglichen die direkte Bildgebung der Kutikula Oberflächenbeschaffenheit mit hohen Scan-Geschwindigkeiten und eine hohe Auflösung, 19 zum Beispiel während der sequentiellen Entfernung der wachsartigen Bestandteile. Betriebssystem AFM im Tapping (berührungslos)-Modus kann als Alternative zur Charakterisierung von Oberflächen von empfindlichen &quot;weichen&quot; pflanzlichen Materialien verwendet werden, vermeiden mögliche Schäden durch seitliche (Scher-) Kräfte und Kratzen der Probenoberfläche. 5,20 In beiden Fällen , der Aufnahme von mehreren Bildern von der gleichen Stelle auf der Oberfläche dient dazu, jede Oberfläche Schäden durch &quot;Probe-Oberflächen-Wechselwirkungen&quot; im AFM-Messungen identifizieren. 6,21 Für eine optimale Reproduzierbarkeit, sollte AFM-Sonden mit Federkonstanten für weiche Oberflächen kutikularen sein verwendet, und die Konstanz der Temperatur und Luftfeuchtigkeit sollten beibehalten werden. 6,15,20 </sbis&gt; Während der Festkörper-NMR ein molekulares Profil Ensemble-Mittelwert (bulk) Eigenschaften in Tomaten-Frucht Nagelhaut bietet, bietet atomic force Bildgebung eine ergänzende nicht-invasive Sonde 22,23 für die Verfolgung der Oberflächentopographie dieser exquisit komplexen makromolekularen Anordnungen. 1,2

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

Die Nagelhaut, eine hydrophobe Schutzschicht auf den oberirdischen Teilen von Landpflanzen, Funktionen als vielseitiger Schutzwall um verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren und regelt auch die Wassermenge aus der äußeren Umgebung. 1 A Biopolyester (Cutin) und langkettigen Fettsäuren ( Wachse) bilden den wichtigsten strukturellen Rahmen der Kutikula, die funktionelle Integrität der Kutikula ist abhängig von der äußeren &#39;epikutikulären&#39; Schicht als auch die Mischung, bestehend aus dem Biopolymer und Cutin &#39;intracuticular&#39; Wachse 2 Im Folgenden stellen wir ein umfassendes Protokoll zu beschreiben. Wachse erschöpfend Auszug aus kommerziellen Tomate (Solanum lycopersicum) Obst oder Nagelhaut zu epikutikulären und intracuticular Wachse sequenziell und selektiv zu entfernen, aus der Kutikula Composite. Verfahren nach Jetter und Schäffer (2001) wurde zum schrittweisen Extraktion epikutikulärer und intracuticular Wachse aus der Frucht Cuticula ausgebildet. 3,4 Bei dieser AnwendungProzess der sequentiellen Wachs entfernen, Solid-State-Kreuz-Polarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) 13 C-NMR-Spektroskopie wurde parallel mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet und bietet auf molekularer Ebene strukturelle Profile der Schüttgüter durch Informationen über die ergänzt die mikro-Topographie und Rauheit der Oberflächen Kutikula. Um die Vernetzung der Fähigkeiten entwachste Nagelhaut aus kultivierten Wildtyp-und Single-Gen-Mutante Tomatenfrüchten auszuwerten, wurde MAS 13 C-NMR verwendet, um die relativen Anteile von Sauerstoff aliphatische (CHO und CH 2 O) chemischen Einheiten zu vergleichen. Ausführliche Entparaffinieren durch schrittweise Soxhlet-Extraktion mit einer Reihe von Lösungsmitteln von unterschiedlicher Polarität bietet ein wirksames Mittel zur Wachs-Einheiten auf der hydrophoben Eigenschaften der aliphatischen und aromatischen Bestandteilen-Isolat, unter Beibehaltung der chemischen Struktur des Cutin Biopolyester. Die mechanische Gewinnung von epikutikulärer Wachse und Selective Entfernung von intracuticular Wachse, wenn sie von komplementären physikalischen Methoden überwacht, bietet eine beispiellose Mittel, um die Kutikula Anordnung zu untersuchen: Dieser Ansatz zeigt die supramolekulare Organisation und strukturelle Integration verschiedener Arten von Wachsen, die Architektur des Cutin-Wachsmatrix, und die chemische Zusammensetzung der einzelnen Bestandteile. Darüber hinaus enthüllt Solid-State-13 C-NMR Unterschiede in den relativen Zahlen von CHO und CH 2 O chemischen Einheiten für Wildtyp und Mutante roten reifen Tomaten Früchte. Die NMR-Techniken bieten außergewöhnliche Werkzeuge zur Fingerabdruck die molekulare Struktur der Kutikula Materialien, die unlöslichen, amorphen und chemisch heterogen sind. Als nicht-invasive-selektive Oberfläche bildgebendes Verfahren, AFM liefert ein effektives und direktes Mittel, um die strukturelle Organisation der Kutikula der Montage auf der nm-Längenskala um zu sondieren.

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Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Oberirdischen Pflanzenteile werden durch die Kutikula, einem supramolekularen Biopolyester-Wachs Montage geschützt. Wir präsentieren Protokolle, um die selektive Entfernung von epi-und intracuticular Wachsen aus Tomatenfrucht Nagelhaut auf molekularer und Micro-Bereich durch Festkörper-NMR-und Rasterkraftmikroskopie, bzw. zu überwachen und die Vernetzung von technischen Kapazität kutikularen Biopolyester beurteilen.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. Oberirdischen Pflanzenteile werden durch die Kutikula, einem supramolekularen Biopolyester-Wachs Montage geschützt. Wir präsentieren Protokolle, um die selektive Entfernung von epi-und intracuticular Wachsen aus Tomatenfrucht Nagelhaut auf molekularer und Micro-Bereich durch Festkörper-NMR-und Rasterkraftmikroskopie, bzw. zu überwachen und die Vernetzung von technischen Kapazität kutikularen Biopolyester beurteilen.

Serie: Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studieren Aggression in Drosophila (Taufliege)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

Obst-Volatile-Analyse mit einem elektronische Nase

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.