Diese Arbeit wurde von der US National Institutes of Health NIH Zuschusses / NICHD # HD051998 (zum CAM) unterstützt.

1. Collagen Bead Vorbereitung <ol><li> Vor dem Laden EVTs für 3-D Zellkultur, muss man die Cytodex-3 Mikroträger Perlen vorzubereiten: <ol><li> Wiegen Sie die entsprechende Menge an Cytodex-3 Perlen für das Experiment erforderlich. Dieses Protokoll wird für die 10ml RCCS Schiffes angepasst, in dem 0,05 g Perlen benötigt werden. Für eine 50ml RCCS Schiff, entsprechend skalieren. In einem 50 mL autoklavierbar konischen Rohr, Mix 250 mg Cytodex-3 Perlen mit 12ml Dulbecco phosphatgepufferte Lösung (DPBS). Diese Menge reicht für 5 RCCS Schiffe. </li></ol></li><li> Für ausreichende Menge vorhanden ist, in dem konischen Rohr, das Autoklav-Verfahren in Verdunstung führt. Lose Kappe der Röhre und Autoklaven für 10 min bei 110 ° C. </li><li> Nehmen Sie die konische Rohr an der Fertigstellung des Autoklaven-Zyklus und damit die Cytodex-3 Bead-Lösung, um abzukühlen. </li><li> Nach dem konischen Rohr auf Raumtemperatur abgekühlt wurde, verwenden Sie sterile Technik, um das Gesamtvolumen auf 12,5 ml zu bringen mit 1X DPBS. </li><li> Cap und speichern Sie die vorbereiteten Cytodex-3 Kügelchen bei Raumtemperatur. Lassen Sie die vorbereiteten Perlen zu quellen und auf Raumtemperatur abkühlen vor zu bedienen. Die oben genannten Vorbereitung Cytodex-3 Perlen wird für fünf 10ml RCCS Schiffe bieten. Wir haben beobachtet, dass längere Lagerung von Cytodex-3 Kügelchen bei Raumtemperatur wird in verminderter Leistung führen, da das Kollagen nach etwa einem Monat zu destabilisieren wird. Cytodex-3 Perlen liegen in der Größenordnung von 133 bis 215 um. </li></ol> 2. Nährmedienzubereitung <ol><li> Bereiten Sie 1L RCCS optimiert GTSF-2-Medien (in Anlehnung an 22), die von 40% MEM alpha besteht, plus Beilagen und 60% L-15 Leibovitz Medien (in Anlehnung an 22). Zuerst bereiten in einem Gesamtvolumen von MEM alpha ergänzt mit 400 ml: 21,2 mm Natriumbicarbonat 0,06% Pepton 0,7 Fructose 1.4mm Galactose 5.6mm Glucose 1% HEPES 1% L-Glutamin 0,5% ITS 10% FBS </li><li> Zur Vorbereitung einer Stammlösung von ITS, in 5 ml sterile angesäuert H 2 O durch Zugabe von Eisessig (ca. 0,05 ml) vorbereitet auflösen. Swirl zu lösen, mit 45ml sterilem Wasser zu folgen. </li><li> Abwiegen genug L-15 Leibovitz Pulver für 600 ml Medium durch Lösen in Gewebe-culture grade H 2 O. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen der Zellkulturmedium auf 1L mit L-15 Leibovitz-Medium. Filter-sterilisiert und bei 4 ° C im Dunkeln. Add 1% Penicillin-Streptomycin individuell auf jedes Aliquot des verwendeten Mediums. </li><li> Viele Medien Formulierungen außer GTSF-2-Medien wurden erfolgreich in die RCCS getestet. Einzelne Laboratorien müssen für sich selbst entscheiden, welches Medium eignet sich optimal für das Experiment durchgeführt wird. </li></ol> 3. Cells und Bead Incubation <ol><li> Propagieren der EVTs um ~ 80% Konfluenz, trypsinize und zählen nach anerkannten Zellkultur Praktiken. </li><li> Suspend 1x10 6 EVTs in 4 ml warmemed Medien. </li><li> Vorsichtig mischen vorbereitet Cytodex-3 Perlen. Mit sterile Techniken, entfernen Sie 2,5 ml der vorbereiteten Beads mit einer breiten Spitze, 10 ml serologische Pipette und Transfer zu einem nicht verwendeten 15 ml konische Röhrchen. Beachten Sie, dass es möglicherweise einen kleinen Verlust von Beads werden, da sie Wert auf die Pipette. </li><li> Lassen Sie die Cytodex-3 Perlen auf dem Boden des Röhrchens zu begleichen. Nach der Sedimentation, verwenden Sie eine Pipette, um die oberste Schicht der DPBS ohne die Cytodex-3 Perlen zu entfernen. </li><li> Mischen Sie die 1x10 6 hergestellt EVTs in Medien mit dem vorbereiteten Cytodex-3 Perlen. </li><li> Inkubieren Sie die Zell-Bead-Mischung bei Raumtemperatur für 30 min. Von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. Inkubieren für weitere 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Von Zeit zu Zeit vorsichtig mischen. </li></ol> 4. Das Laden der RWV <ol><li> In einer laminaren Strömung Schrank, entfernen Sie einen 10 mL RCCS aus der Verpackung und legen Sie sie in einem sterilen, 6-well Mikrotiterplatte für Stabilität. Siehe Abbildung 1 für eine markierte Diagramm des RC AbbildungCS. </li><li> Entfernen Sie den großen Stopfen aus dem Hafen. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen der Inkubation Zell-Bead-Mischung auf 10 ml mit erwärmten Medien. </li><li> Laden Sie die Zelle / Bead-Mischung in die RCCS durch den großen Hafen. Die RCCS sollte gekippt werden im 45 ° Winkel (großer Hafen up) beim Laden um die Entfernung des möglichen Luftblasen zu unterstützen. Prevent Aufbau von Überdruck durch Befüllen des Behälters langsam und stetig. </li><li> Ersetzen Sie den Stopfen in den großen Hafen. </li><li> Entfernen Sie den Kolben aus dem 3-ml-Spritzen und Ort der leeren Spritzen auf die kleinen Häfen. Add 1-3 ml Medium zu jeder Spritze. Langsam öffnen sich die beiden Ventile. Ersetzen Sie die Spritze Kolben auf die Spritzen sanft. Fügen Sie Medien aus einer Spritze, bis alle Luft aus dem Innenraum entfernt werden. </li><li> Nehmen Sie den RCCS und klopfen Sie leicht die Seite beim Drehen sie vor Ihnen, um Luftblasen zu überprüfen. Wenn es irgendwelche Blasen sind, müssen Sie sie aus der Kammer, wie Luftblasen unter Bildung o störenf Zellaggregate und stellen Scherkräfte. Entfernen Sie Luftblasen durch Drehen des RCCS bis die Blasen unter dem kleinen Hafen sind. Dann vorsichtig nach unten auf die Spritze auf der gegenüberliegenden Seite, um die Luftblasen in den Hafen und aus der Kammer zu erzwingen. </li><li> Schließen einer Seite Port. Drücken Sie vorsichtig auf die andere Spritze Kolben eine kleine Menge von positivem Druck in den Behälter, die Blasen verhindert die Bildung von einzuführen. Close zweite Ventil. </li><li> Laden Sie die RCCS auf den Rotor. Starten Sie die Rotation bei 19rpm in einem 37 ° C CO 2-Inkubator. </li></ol> 5. Ändern der Medien <ol><li> Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag für die ersten drei Tage, dann jeden Tag danach. </li><li> Schalten Sie den Rotor und entfernen Sie die RCCS. Ziehen Sie den Kolben bis zu einigen Sog erzeugen, entfernen Sie die Spritze aus jedem kleinen Hafen und Ort der RCCS auf einem Winkel, so dass die Perlen Gegenteil von dem großen Hafen zu begleichen. </li><li> Nachdem die Perlen alle niedergelassen haben, öffnen Sie eine der kleinen Ventile undermöglichen die Medien fließen aus dem RCCS und in einen Abfallbehälter. Nehmen Sie 2 / 3 der Medien auf diese Weise. Achten Sie darauf, nicht stören die Perlen und nicht verwerfen Aggregate. </li><li> Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Hafen. Add Medien wieder in die RCCS durch den großen Hafen. Ersetzen Sie den Stopfen in den großen Hafen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 4,6 bis 4,9. </li><li> Da die Aggregate an Größe zunehmen, müssen Sie die Drehzahl erhöhen, um sie in der Schwebe zu halten jederzeit, idealerweise in einem kleinen Kreislauf Muster mit optimaler Geschwindigkeit. Generell erhöht die Geschwindigkeit zwischen 0,3 bis 0,7 min nach jeder Fütterung, wenn die Aggregate zusehends beginnen. </li></ol> 6. Sammeln propagierten Cells <ol><li> Entfernen Sie die RCCS aus dem Rotor. Entfernen Sie die Spritze aus jedem kleinen Hafen und Ort der RCCS auf einem Winkel, so dass die Perlen Gegenteil von dem großen Hafen niederlassen kann. </li><li> Nachdem die Perlen alle niedergelassen haben, öffnen Sie eine der kleinen Ventile und lassen Sie die Medien heraus zu fließender RCCS und in einen Abfallbehälter. Nehmen Sie 1 / 3 der Medien auf diese Weise. </li><li> Schließen Sie das kleine Ventil und öffnen Sie den großen Hafen. Vorsichtig schwenken das Schiff, um die Aggregate wieder in Lösung zu zerstreuen. Leere flüssige Mischung in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die gesammelten Aggregate in den konischen Rohr, bevor Sie Überstand gründlich waschen Kulturgefäß zur Wiederaufnahme der Aggregate zu maximieren begleichen. Die Aggregate können für nachfolgende Tests sofort verwendet werden, z. B. Durchflusszytometrie, Invasionsassays, Immunfluoreszenz und andere. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für EVT-ähnlichen Zellen (SGHPL-4 Trophoblasten-Zelllinie) in der RCCS auf Cytodex-3 Perlen gewachsen ist in Abbildung 2 dargestellt. Das EVT-like-Zelllinie zeigt Vorsprünge entfernt von den wichtigsten Cluster und verbundenen benachbarten Clustern. Viele der Beads sind vollständig mit Zellen bedeckt propagieren. Einmal aus dem RCCS und pla entferntTed auf einer extrazellulären Matrix, die EVT-like 3-D gewachsenen Zellen aggressiv in und / oder zu migrieren (Abbildung 3). RT-PCR Daten bestätigen die erhöhte Expression von MMPs in 3-D-Aggregate gesehen zu traditionellen Zellkultur Monoschichten (Abbildung 4) entgegen. Interessanterweise sind Gene nicht mit Invasion assoziiert auch in der RCCS hochreguliert (Tabelle 1) und kann bei der Abgrenzung dieser Gebiete als immun Interaktionen mit eindringenden Trophoblasten-Zellen zu unterstützen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig1.jpg" /> Abbildung 1. Cartoon Darstellung der Rotating Cell Culture System (RCCS). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig2.jpg" /> Abbildung 2. Phasenkontrast-Aufnahme von einem Vertreter Aggregat nach 5 Tagen Wachstum in einem RCCS. Die Pfeile zeigen die eindringenden Zellen und * bezeichnet das Cytodex-3 Mikroträger Perlen. <imgalt = &quot;Bild 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3367/3367fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. RCCS Grown Aggregate wurden in Fibringele eingebettet. Invasion durch die Fibrin-Gel wurde so früh wie (A) 24 Stunden nach der Fibrin Einbettung beobachtet und (B) über 48 Stunden fortgesetzt. Die Pfeile zeigen die eindringenden Zellen und * bezeichnet das Cytodex-3 Mikroträger-Beads (Adaptiert mit Erlaubnis aus Lit.. 7). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3367/3367fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vergleichende Gelatine Zymogramm von Mono-und RCCS propagiert SGHPL-4 EVT-ähnliche Zellen. Pro-und aktiven Formen von MMP-2 und MMP-9 wurden von den RCCS gewachsen Trophoblastzellen (Übernommen mit freundlicher Genehmigung aus Lit.. 7) ausgeschieden. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3367/3367table1.jpg" /> Tabelle 1. Zusammenfassung der Microarray-Ergebnisse aus SGHPL-4-Zellen in einem RCCS gewachsen (Übernommen mit freundlicher Genehmigung aus Lit.. 7). <ol class="lalpha"><liNormierte 3-D-Gen-Wert / normalisierend monlayer Gen-Wert:&gt; fache Induktion in der 3-D-Aggregate wurde wie folgt berechnet. </li><li> Zeigt an, Gene, die unterhalb der Nachweisgrenze in Monoschichten wurden. </li></ol>

<ol>
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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Kultur hier vorgestellte Technik bietet den Ermittlern sehr invasiv EVT-ähnliche Zellen. Es wurde nun erkannt, dass ein Verlust der Differenzierung in Monoschichten durch die Hemmung der zellulären Reaktionen auf chemische und molekulare Signale in drei Dimensionen (apikalen, basalen und lateralen Zelloberflächen) 10,13 auftritt. Diese Technik spiegelt Eigenschaften in utero auf eindringende EVT-Zellen festgestellt. Da das Verfahren ahmt konventionelle Monolayer Zellkultur Zeitkinetik, bietet aber Zellen mit unterschiedlichen Expression kann vergleichende Tests eingesetzt werden. Zellhaufen kann für die Verwendung in Experimenten jederzeit geerntet werden. Sie kann verwendet werden als Cluster oder Kollagen Abbau eingesetzt werden, um Zellen als einzigen Zellsuspension isolieren werden. Die Cytodex-3 Mikroträger Kügelchen können mit Gerüsten oder Mikroträger Perlen mit anderen extrazellulären Matrix (ECM), die bessere Rahmenbedingungen für die einzelnen Laboratorien spezifischen Interessen können beschichtet ersetzt werden. Alternatively, es gibt viele andere 3-D Kultur-Plattformen, die stärker auf eine bestimmte Zellart Kulturbedingungen, wie Zellkultur-Inserts und Spinnerflaschen 10,23 kann. Es wird darauf hingewiesen, dass die Kultur Kinetik anders sein könnte unter diesen Umständen und sollte individuell festgelegt werden. Kultur Kinetik kann leicht durch Entnahme von Proben aus dem RCCS in regelmäßigen Abständen und Analyse zur Expression von charakteristischen Differenzierungsmarker, Proliferation und Lebensfähigkeit 15 geprüft. Optimal Proliferation und Differenzierung Kinetik ermittelt werden kann durch den Vergleich Ergebnisse über die Zeit und gegen konventionelle Monolayer Zellkultur-Techniken. Mit dem SGHPL-4-Zellen als ein Beispiel, Aggregate entfernt wurden täglich und gefärbt mit Ki67 (um die Proliferation zu bestimmen) und Caspase-3 (die Apoptose zu bestimmen), Marker spezifisch für die einzelnen Labors Interessen können leicht ausgetauscht werden. Die beschriebene Technik kann hier auf das Studium der Spirale Arterie eingesetzt werdenUmbau, flache Implantation und mütterliche Immunantwort auf eindringende Trophoblasten-Zellen. Wie zuvor veröffentlicht worden sind, können Sie dieses 3-D Zellkultur-Modell auch für eine Vielzahl von anderen Zelllinien 17,14-21 verwendet werden. In jedem Fall ist der Nutzen des Modells durch eine Vielzahl von bekannten Differenzierung Marker getestet werden. Wie bei jeder In-vitro-Zellkultur-Modell sind 3-D-Zellkulturen von Natur reduktionistisch. Keine einzige Kultur-Modell wird alle der mechanistischen Details, aber wenn mit publizierten Ergebnissen aus anderen Modellen, 3-D Kulturen zu einem weiteren wertvollen alternatives Modell zur Verbesserung des Verständnisses von Krankheiten im Zusammenhang mit Mechanismen, die ein enormes Potenzial für die Entwicklung halten können kombiniert neuartiger Produkte und Verfahren in der Diagnostik, Prävention und Behandlung von Infektionskrankheiten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Cytodex Mikroträger Perlen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3275 </td><td></td></tr><tr><td> Rotierende Cell Culture System (RCCS) </td><td> Synthecon </td><td> RCCS-D </td><td> Inklusive Rotorgrundkörper, Stromversorgung, 4 Einweg RCCS Einheiten </td></tr><tr><td> RCCS Einweg-Units </td><td> Synthecon </td><td> Kontakt Synthecon </td><td></td></tr><tr><td> 3ml Luer-Lock Spritze </td><td> BD </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml breit Spitze serologischen Pipetten </td><td> BD </td><td> 357504 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 12561-072 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium, Pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 41300-039 </td><td></td></tr><tr><td> H 2 O, Endotoxin frei </td><td> Fischer </td><td> MT-25 bis 055-CM </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-7795 </td><td></td></tr><tr><td> Pepton </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1420-100 </td><td></td></tr><tr><td> Fructose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3510-100 </td><td></td></tr><tr><td> Galactose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5388-100 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-Transferrin-Natriumselenit (ITS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model

Das Feld der menschlichen Trophoblasten Forschung erleichtert das Verständnis der komplexen Umgebung während Plazentation gegründet. Aufgrund der Natur dieser Studien ist die menschliche In-vivo-Experimente unmöglich. Eine Kombination aus primären Kulturen, Explantation Kulturen und Trophoblasten Zelllinien 1-Unterstützung unser Verständnis der Invasion der Gebärmutterwand 2 und Umbau des Uterus Spiralarterien 3,4 von extravillösen Trophoblastzellen (EVTs), die für die erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft erforderlich ist. Trotz der Fülle an Wissen aus solchen Modellen entnommen, ist es akzeptiert, dass in vitro Zellkultur-Modellen mit EVT-like-Zelllinien Display zellulären Eigenschaften verändert, wenn ihre in vivo Pendants 5,6 verglichen. Cells in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) kultiviert Display morphologische, phänotypische und funktionelle Eigenschaften von EVT-like-Zelllinien, die mehr genau imitieren Differenzierung in utero EVTs mit einer erhöhten Expression von Genen vermitteln Invasion (zB Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)) und Trophoblast Differenzierung 7,8,9. The Saint Georges Hospital Plazenta-Zelllinie-4 (SGHPL-4) (freundlicherweise von Dr. Guy Whitley und Dr. Judith Cartwright gespendet) ist ein EVT-like-Zelllinie, die für die Prüfung in der RCCS verwendet wurde. Das Design des RCCS Kulturgefäß basiert auf dem Prinzip, dass Organe und Gewebe in einer dreidimensionalen (3-D-Umgebung) Funktion. Aufgrund der dynamischen Kulturbedingungen in dem Behälter, einschließlich der Bedingungen der physiologisch relevanten Scher-, Zellen in drei Dimensionen gewachsen bilden Aggregate auf Basis natürlicher zellulärer Affinitäten und differenzieren sich in organotypischen Gewebe-like Baugruppen 10,11,12. Die Wartung einer Flüssigkeit Bahn bietet eine Low-Shear, turbulenzarme Umgebung ähnlich Bedingungen in vivo gefunden. Sedimentation der kultivierten Zellen durch Anpassung der Drehung entgegenGeschwindigkeit des RCCS, um eine konstante freien Fall der Zellen zu gewährleisten. Der Gasaustausch erfolgt durch eine durchlässige hydrophobe Membran auf der Rückseite des Bioreaktors befinden. Wie ihre Eltern Gewebe in vivo sind RCCS-gewachsenen Zellen in der Lage, chemische und molekulare Gradienten in drei Dimensionen (dh an ihrem apikalen, basalen und seitlichen Flächen) zu reagieren, weil sie auf der Oberfläche des porösen Mikroträger Perlen gezüchtet werden. Wenn als zweidimensionale Monolagen auf versiegelten Oberflächen wie Kunststoff gewachsen sind die Zellen dieser wichtigen Kommunikationsmittel, über die basale Fläche entzogen. Folglich ist die räumliche Beschränkungen durch die Umwelt stark beeinflussen, wie Zellen Sinn und decodieren Signale aus dem umgebenden Mikroumgebung, was darauf schließen lässt eine wichtige Rolle für die 3-D Milieu 13. Wir haben die RCCS verwendet werden, um biologisch sinnvolle 3-D Modelle der verschiedenen menschlichen epithelialen Geweben 7,14,15,16 Ingenieur. Tatsächlich haben viele frühere Berichte DMonstrated, dass Zellen in der RCCS kultiviert werden können physiologisch relevanten Phänotypen, die nicht mit anderen Modellen 10,17-21 möglich zu übernehmen. Zusammenfassend stellt Kultur in der RCCS eine einfache, reproduzierbare, High-Throughput-Plattform, die eine große Anzahl von differenzierten Zellen, die zugänglich für eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen bietet. In dem folgenden Protokoll, mit EVTs als ein Beispiel, wir eine klare Beschreibung der erforderlichen Schritte, um dreidimensional Kultur adhärenter Zellen in der RCCS.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.4K Aufrufe.  Tulane University Medical School. Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Serie: Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

Ein Hormon ansprechenden 3D-Kultur Modell des menschlichen Brustdrüse Epithel

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...