Wir danken Dr. T. Helleday und Dr. E. Petermann für die Hilfe bei der Faser-Technik sowie die Mitglieder des Labors für hilfreiche Diskussionen. WN wird von einem Senior International Research Fellowship von der Association for International Cancer Research und vom polnischen Staat Committee for Scientific Research Grant (N301 165935) unterstützt.

Die hier beschriebene Methode wurde in der folgenden Publikation verwendet: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 Zellkultur Materialien: fötales Rinderserum (FBS), Huhn Serum, Penicillin / Streptomycin, 2-Mercaptoethanol, RPMI <ol><li> Bereiten Zellkulturmedium: add 7% FBS, 3% Hühnerserum, 1x Penicillin / Streptomycin und 10 uM 2-Mercaptoethanol in RPMI Medium. </li><li> DT40 Zellen werden in sterile Zellkulturflaschen bei 38 ° C gezüchtet und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Split-Zellen jeden Tag bis zu einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen / ml 6. </li></ol> 2. In-vivo-Markierung Materialien: IdU, CldU <ol><li> Stammlösungen von Nukleotid-Analoga: Man löst IdU bis 5 mm und CldU bis 2,5 mM in Medium. Hitze beide Lösungen kurz auf 60 ° C und vortexen, bis die NukleotidanalogDie Werte sind völlig aufgelöst. </li><li> Add IdU bis zu einer Endkonzentration von 25 uM bis exponentiell wachsenden DT40 Zellen und mischen die Zellsuspension gut. Inkubieren Zellen für 20 Minuten bei 38 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation mit dem ersten Etikett, fügen CldU bis zu einer Endkonzentration von 250 uM und behandeln Zellen als in den vorherigen Schritt beschrieben. </li><li> Wash-Zellen mit eiskaltem PBS resuspendieren und sie in einer Konzentration von 7,5 x 10 5 Zellen / ml in kaltem PBS. Halten Sie die markierten Zellen auf Eis. </li></ol> Die Kennzeichnung beschriebene Verfahren ist nur ein Vorschlag und kann modifiziert werden, um spezifische Fragen zu beantworten sein. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Informationen auf experimentelles Design. 3. Zell-Lyse und DNA Verbreitung Material: Glas Dias, Faser-Lyse-Lösung <ol><li> Bereiten Sie die Faser Lyse-Lösung: 50 mM EDTA und 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li&gt; Spot 2 ul der Zellsuspension zu einem Ende der Glasplatte. Air-Dry für 5 Minuten oder bis das Volumen des Tropfens ist stark reduziert, aber nicht trocken. </li><li> Pipettieren 7 ul Lyse-Lösung auf der Zellsuspension und vorsichtig mit der Pipettenspitze auf die Lösungen zu mischen rühren. Inkubieren für 2 Minuten für die Zell-Lyse, um fortzufahren. </li><li> Tilt Dias bis 15 °, damit die Fasern entlang der Folie verteilen. </li><li> Sobald die Faser-Lösung der Unterseite der Folie erreicht hat, legen Sie sie horizontal an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen sollte eine dünne, opake Linie sichtbar entlang der Folie. An dieser Stelle sollte der Beginn der gestreckten Fasern mit einem Bleistift als nach dem Färben wird die Linie nicht mehr sichtbar gekennzeichnet sein. Dieses Zeichen wird später helfen, die Fasern unter dem Mikroskop zu finden. </li></ol> 4. Immunfluoreszenzfärbung Materialien: Methanol, Essigsäure, HCl, 5% BSA in PBS, Küvette, anti-BrdU (Maus)-Antikörper,anti-BrdU (Ratte)-Antikörper, Schaf-anti-Maus-Cy3 Antikörper, Ziege-anti-Ratte Alexa Fluor 488 Antikörper, Vectashield Eindeckmedium, Deckgläser, Nagellack <ol><li> Tauchen Sie gleitet in Methanol / Essigsäure (3:1) in einer Küvette und inkubieren für 10 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Objektträger in destilliertem H 2 O, dann tauchen in 2,5 M HCl für 80 Minuten. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten. </li><li> Die Objektträger aus der Küvette und sammeln überschüssige PBS mit einem Papiertuch. Setzen Sie die Dias horizontal und Pipette 5% BSA übereinander gleiten. Decken Sie die Folien vorsichtig mit einem Deckglas auf die BSA gleichmäßig über die Folie und inkubieren für 20 Minuten. </li><li> Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5% BSA in den folgenden Konzentrationen: 1:25 anti-BrdU (Maus) und 1:400 anti-BrdU (Ratte). </li><li> Bewegen Sie das Deckglas vorsichtig ins Glas Folie, um sie zu entfernen. Bitte keine Gewalt anwenden, wenn das Deckglas klebt an der Folie. Die Folie kann in PBS rehydriert werden, bis das Deckglas wird locker eind kann leicht entfernt werden. Sammeln Sie überschüssige BSA mit einem Papiertuch und Objektträger horizontal. Pipet 50 ul der Primärantikörper-Lösung auf jeder Folie. Deckel wieder mit einem Deckglas auf die Antikörper-Lösung gleichmäßig über die Folie und inkubieren in einer feuchten Kammer für 2 Stunden. </li><li> Nach dem Entfernen der Deckgläser, waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten </li><li> Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in 5% BSA in den folgenden Konzentrationen: 1:500 Schaf Anti-Maus-Cy3 und 1:400 Ziegen-anti-Ratte Alexa Fluor 488. </li><li> Übernehmen 50 ul der sekundären Antikörper-Lösung als für den primären Antikörper beschrieben. Schützen Sie die Folien aus Licht und Inkubation für 1 Stunde. </li><li> Nach dem Entfernen der Deckgläser, waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Vectashield Eindeckmedium auf jeder Folie auftragen und Deckglas. Drücken Sie vorsichtig die Deckgläser und die überschüssige Flüssigkeit entfernt um sie mit einem Papiertuch. Seal Deckgläser mit transparenten Nagel polish und trocknen lassen. Bewahren Sie die Objektträger bei -20 ° C. </li></ol> 5. Bildaufnahme Materialien: Fluoreszenz-Mikroskop, Kamera Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf eine Folie in der Nähe der Bleistift und starten Auffinden der Fasern. In der Regel gibt es eine Haupt-Faserbündel, aber diese Fasern sind zu verstrickt und kann später nicht mehr analysiert werden. Entfernen Sie sich von der Haupt-Bundle zu Bereichen, in denen Fasern deutlich voneinander (Abb. 2) sind getrennt zu finden. Wir würden uns wählen Bilder nur mit einem Farbkanal, um Verzerrungen zu vermeiden. Dann würden wir etwa 10 Bilder von jedem Zeitpunkt, Konzentrations-oder Zell-Linie. Allerdings hängt die Anzahl der Bilder auf, wie viele Fasern können auf jedes Bild gezählt werden. Bewegen Sie sich entlang der Folie, um die verschiedenen Bilder zu machen, wenn ein Bereich einer Folie nicht liefern können Vertreter Faserlängen oder Replikation Strukturen. 6. Datenanalyse Materialien: Picture-Analyse-Programm, z. B. ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importieren von Bildern in ein Bild-Analyse-Programm. Messen Sie die Länge der Nervenbahnen und / oder die Anzahl der verschiedenen Replikations-Strukturen (Abb. 3). Nur zählen Fasern, die deutlich sichtbar und welche nicht über den Rand des Bildes zu erweitern sind. Wir messen typischerweise die Länge von etwa 100 Fasern und zählen 150-200 Replikation Strukturen und wir würden wiederholen einzelnen Versuchen mindestens dreimal. 7. Repräsentative Ergebnisse: Neu replizierte DNA kann als Linien von Antikörper-markierten Nukleotid-Analoga visualisiert werden. In unseren Experimenten eine laufende Gabel ist neben roten und grünen Signale (Abb. 3) dargestellt. Die doppelte Kennzeichnung Protokoll erlaubt uns auch, vier große Klassen von Replikation Strukturen zu definieren: 1) neue Einleitung Ereignisse können divid werden<html> ed in Herkunft, die ausgelöst werden, während die Zellen mit dem ersten Label und Herkunft, die während der Inkubation mit dem zweiten Label gefeuert haben inkubiert haben. Erstere bestehen aus benachbarten Grün-Rot-Grün-Signale und die letztere von einer grünen Linie. 2) Kündigung Ereignisse manifestieren sich als angrenzende rot-grün-roten Signalen. 3) durchsetzt Ursprünge sind Stellen im Genom mit eng beieinander liegenden Ursprünge. Solche Seiten bestehen aus aufeinander Herkunft und Stopp-Signale. 4) je nach experimentellem Design, gekippt / zusammengebrochen Gabeln kann entweder als nur rot-Signal 7 oder eine rote Linie durch einen kurzen grünen Trakt 8,9 gefolgt definiert werden. Mit den hier beschriebenen Bedingungen, Wildtyp DT40 Zellen haben eine durchschnittliche Gabel Geschwindigkeit von 0,4 mu m / min. Wir können erkennen, etwa 63% laufenden Gabeln, 10% Herkunft, 16% ins Stocken geraten Gabeln (red nur Flächen), 8% Kündigungen und 3% durchsetzt Fasern. <html> Abbildung 1 &quot;/&gt; . Abbildung 1 (A) Die linke Seite der Karikatur zeigt den ersten Schritt der DNA-Markierung vor: Zugabe IdU exponentiell wachsenden DT40 Zellen führt das Nukleotid-Analogon zu leicht in die neu synthetisierten und nacheilenden DNA-Stränge eingebaut werden. Dies kann durch Verwendung eines spezifischen Antikörpers sichtbar gemacht werden, und wird als eine rote Linie angezeigt, wenn unter dem Mikroskop betrachtet. Anschließend wird die gleiche Prozedur mit CldU wiederholt auf der rechten Seite der Abbildung dargestellt. Nach der Inkubation mit dem zweiten Nukleotid-Analogon, wird eine aktive Gabel sichtbar sein als eine angrenzende Rot-Grün-Darm-Trakt. Die durchschnittliche Faserlänge ist proportional zur Inkubationszeit der Nukleotid-Analoga. (B) DNA aus lysierten DT40 Zellen wird durch die Schwerkraft auf einen Objektträger gestreckt und die inkorporierte Nukleotid-Analoga werden visualisiert durch die Verwendung von spezifischen Antikörpern und Fluoreszenzmikroskopie. BBILDUNG 2 &quot;/&gt; Abbildung 2. Ein Vertreter Fluoreszenzbild zeigt Fasern, die aus Wildtyp DT40 Zellen anschließend mit IdU und CldU für jeweils 20 Minuten markiert. Die meisten Fasern sind gut voneinander getrennt und können somit leicht analysiert werden. Der weiße Balken repräsentiert 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> . Abbildung 3 Die Doppel-Kennzeichnung Faser Technik erlaubt es, zwischen verschiedenen Replikation Strukturen zu unterscheiden; 1 - aktiv repliziert Gabeln, 2 - neue Standorte der DNA-Replikation (Abfeuern von neuen Wurzeln), 3 - Gabel Kündigungen (zwei konvergierenden Gabeln), 4 - durchsetzt Fasern (Seiten von eng beieinander liegenden Ursprünge) und 5 - ins Stocken geraten Gabeln (nur rot-Signal).

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir beschreiben eine Methode, die für die quantitative Analyse von Parametern, die DNA-Synthese während der Einfluss der S-Phase zu einem einzelnen Molekül ermöglicht. In den vergangenen zehn Jahren wurden verschiedene Versionen der DNA-Faser Fluorographie Technik entwickelt, um die Bewegung der einzelnen Replikationsgabeln in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Die kritischen Parameter in allen diesen Techniken ist das Verfahren verwendet werden, um den bestmöglichen Streckung der DNA auf Glasflächen bietet der Bereich getrennt DNA Fasern zu erreichen. Ein entscheidender Schritt, um dies zu erreichen, ist die Inkubationszeit der Zellsuspension auf dem Objektträger sowie Lyse Zeit. Diese Parameter sind abhängig von der Temperatur und der Luftstrom in einem bestimmten Labor und sollten empirisch ermittelt werden. Der praktische Teil eines DNA-Faser-Experiment ist in der Regel innerhalb eines Tages durchgeführt. Allerdings ist die nachträgliche Bild Erfassung und Analyse mehr Zeit in Anspruch und erfordert Übung. Die Kennzeichnung Protokoll kann ad werdenApted zu verschiedenen wissenschaftlichen Fragestellungen zu beantworten: mit Hilfe eines Agenten, der mit der Replikation stört während der zweite Puls Kennzeichnung überwacht Gabel Dehnung / Abwürgen in Reaktion auf replikativen Stress. In diesem Szenario wird das erste Etikett muss nicht als das zweite Nukleotid gewaschen werden im Überschuss zugegeben. Alternativ können Medikamente, die die Replikation behindern in Kombination oder auch nur nach der Zugabe des ersten Etiketts verwendet werden. Dies erfordert das erste Etikett und das Medikament vor dem zweiten Nukleotid-Analogon entfernt werden angewandt wird. Dieses Verfahren erlaubt es, die Bedeutung der verschiedenen DNA-Reparatur-Faktoren auf replikativen Gabel Stabilität / Recovery unter den Bedingungen der replikativen Stress (zB Gabel Abwürgen und / oder Kollaps) zu bestimmen. Bemerkenswert ist, könnte eine genauere Analyse der Angaben der DNA-Replikation Programm mit der Verwendung eines alternativen Ansätzen kombiniert DNA Kämmen und die Fluoreszenz in situ Hybridisierung durchgeführt werden. Dies ist jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert teuresive Anlagen. Die Fähigkeit, qualitativ und quantitativ zu analysieren Angaben der DNA-Replikation bietet ein wesentliches Instrument für die Untersuchung von Defekten in der DNA-Replikation selbst als auch die Wege, die genomische Instabilität mit Replikationsgabeln assoziiert zu unterdrücken. Zweifellos wird dieser Test weiter helfen, Licht auf die Mechanismen der Replikation-vermittelten DNA-Reparatur, die normalen Zellen zu reagieren / Anpassung an Veränderungen der Umwelt und wie Krebszellen nutzen diese Mechanismen, um die Toxizität von Medikamenten, die an Replikationsgabeln widerstehen können vergossen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Rinderfötenserum Gold (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Hühnerserum </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iod-2&#39;-desoxyuridin (IDU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Chlor-2&#39;-desoxy-Uridin (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser No1 </td><td> Scientific Labor suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield Eindeckmedium </td><td> H-1000 Vector Labor </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU-Antikörper (Maus) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-BrdU-Antikörper (Ratte) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> Schaf-anti-Maus-Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> Ziege-anti-Ratte Alexa Fluor 488 Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Wartung von Replikationsgabel Stabilität ist von größter Bedeutung für sich teilende Zellen lebensfähig zu erhalten und Krankheiten vorzubeugen. Die Prozesse sorgen nicht nur für Gläubige Genomduplikation in das Gesicht von endogenen und exogenen DNA-Schäden, sondern auch verhindern, dass genomische Instabilität, einem anerkannten ursächlicher Faktor bei der Tumorentstehung. Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode zur DNA-Replikation in den Vogelgrippe B-Zell-Linie DT40 zu visualisieren. Diese Zelllinie ist ein leistungsstarkes Tool, um Protein-Funktion in vivo durch reverse Genetik in Vertebraten-Zellen 1 zu untersuchen. DNA-Faser Fluorographie in DT40 Zellen fehlt ein bestimmtes Gen ermöglicht es, die Funktion dieses Genprodukt in der DNA-Replikation und Stabilität des Genoms aufzuklären. Traditionelle Methoden zur Replikationsgabel Dynamik in Zellen von Wirbeltieren zu analysieren verlassen sich auf die Messung der Gesamtrate der DNA-Synthese in einer Population von Puls-markierten Zellen. Dies ist ein quantitativer Ansatz und nicht für die qualitative Analyse der Parameter, die DNA-Synthese beeinflussen können. Im Gegensatz dazu kann die Geschwindigkeit der Bewegung des aktiven Gabel direkt verfolgt werden, wenn Sie die DNA-Faser-Technik 2-4. In diesem Ansatz wird entstehenden DNA in vivo durch den Einbau von Halogen-Nukleotiden (Abb. 1A) gekennzeichnet. Anschließend werden einzelne Fasern auf einen Objektträger gestreckt, und die markierte DNA-Replikation Verträge werden mit spezifischen Antikörpern angefärbt und im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 1B). Initiation der Replikation sowie Gabel Ausrichtung wird durch die fortgesetzte Verwendung von zwei unterschiedlich modifizierten Analoga bestimmt. Darüber hinaus die Dual-Label-Ansatz für die quantitative Analyse von Parametern, die DNA-Synthese Einfluss während der S-Phase ermöglicht, dh Replikation Strukturen wie laufende und installiert Gabeln, Replikationsursprung Dichte sowie Gabel Kündigungen. Schließlich können die experimentellen Verfahren werden erreichened innerhalb eines Tages, und erfordert nur allgemeiner Laborgeräte und einem Fluoreszenz-Mikroskop.

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, ein Modell Wirbeltieren genetische System bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Funktion von Proteinen zu analysieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die qualitative Analyse der Parameter, die DNA-Synthese Einfluss während der S-Phase in DT40 Zellen bei der Ebene einzelner Moleküle erlaubt.

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

visualization-dna-replication-vertebrate-model-system-dt40-using-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

39.7K Aufrufe.  University of Oxford. DT40, ein Modell Wirbeltieren genetische System bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Funktion von Proteinen zu analysieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die qualitative Analyse der Parameter, die DNA-Synthese Einfluss während der S-Phase in DT40 Zellen bei der Ebene einzelner Moleküle erlaubt.

Serie: Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Forschung

Biologie

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...