Wir danken A. Tager und B. Shea für ihre kontinuierliche Zusammenarbeit und für die Bereitstellung des Lungengewebes zu Demonstrationszwecken verwendet hier. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren HL-092961 gefördert. Diese Arbeit wurde teilweise am Center for Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network, das von der National Science Foundation NSF unter Auszeichnung ECS-0335765 wird unterstützt durchgeführt. CNS ist Teil der Faculty of Arts and Sciences der Harvard University.

1. Lungengewebe Bandvorbereitung <ol><li> Lungengewebe ist sehr kompatibel und schwer in Streifen für AFM Charakterisierung geschnitten. Um vorübergehend stabilisieren die Lunge Struktur für das Schneiden, aufblasen isoliert Mauslungen intratracheal mit 50 ml / kg Körpergewicht von 2% niedriger Gelpunkt Agarose (hergestellt in PBS) erwärmt auf 37 ° C. Vernähen der Luftröhre und kühlen aufgeblasenen Lungen in ein Bad von PBS bei 4 ° C für 60 Minuten. Die Agarose wird Gel und in den Lufträumen versteifen, sanft zur Stabilisierung der Lunge Struktur während dieses Intervalls 5. Höhere Agarose Konzentrationen, dh 3-4%, kann zur weiteren Verbesserung Gewebe Stabilisierung zum Schneiden sein. </li><li> Schneiden Sie die Agarose-stabilisierten Maus Lungengewebe mit einer Rasierklinge oder Skalpell in Streifen von 5 x 5 mm in Länge und Breite und 400 um Dicke, dann waschen Sie die Streifen in einem PBS-Bad bis 37 vorgewärmten ° C mit je 100 ml Becherglas auf einer Bank-top beheizten Rührplatte für 5 Minuten, um restliche Agarose zu entfernen. Um auszuschließen großen Atemwege und Gefäße, geschnittenen Streifen von subpleural entfernteren Regionen Hauptstamm Bronchien. Wenn Atemwege und der großen Gefäße werden abgebildet sind, schneiden Streifen aus Lungengewebe mehr proximal Hauptstamm Bronchien. </li></ol> 2. AFM Mikroindentation und Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Zur Isolierung Bereiche von Interesse für die AFM Mikroindentation, können Gewebe durch Phasenkontrast-Mikroskopie sichtbar gemacht werden, oder immungefärbt und visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie. Für Immunfärbung Block Gewebe Streifen mit 5% Serum aus der Quelle des gewünschten sekundären Antikörper (in PBS) für 2 Stunden ohne Fixierung oder Permeabilisierung bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren des Gewebes Streifen mit den entsprechenden Primär-Antikörper (z. B. Kaninchen anti-Kollagen I interstitielle Kollagen (1:250 Verdünnung), Kaninchen-anti-Laminin (1:250 Verdünnung) zu visualisieren, um Basalmembran sichtbar) in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte auf einer Wippe unter leichtem Schütteln für 1 Stunde, waschen Probe 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit PBS, gefolgt von entsprechenden Sekundär-Antikörper, konjugiert mit fluoreszierenden Marker (zB Alexa Fluor 546 Ziege anti-Kaninchen Zweitantikörper (1:250 Verdünnung)) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Wash Gewebestreifen ausgiebig mit PBS und speichert in PBS bei 4 ° C </li><li> Unmittelbar vor dem AFM Charakterisierung, schließen Sie das Gewebe Streifen zu einem Poly-L-Lysin-beschichtete 15-mm Deckglas durch Anheben des Deckglas von unten die schwimmende Gewebe, so dass das Gewebe Streifen verteilt sich gleichmäßig auf dem Deckglas Oberfläche, ggf. Sandwich-Bandes mit einem zweiten sauberen, Deckglas unbeschichteten und gelten leichten Druck mit Gewebe Bindung an die Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläschen zu unterstützen. </li><li> Kalibrieren Sie das AFM-System nach der Herstellung der Anweisung unmittelbar vor jeder Runde Mikroindentation Experimente. Bestimmen Sie zwei kritische Parameter: 1) der Cantilever Federkonstante mit der Temperaturschwankungen Methode in Luft 6, und 2) die Federauslen Empfindlichkeit, die einen Parameter verwendet, um die Fotodiode Ausgangssignal auf den tatsächlichen Federauslen Entfernungsskala ist, Dd. Kalibrieren Ablenkempfindlichkeit durch den Erwerb einer Standard-Kraft-Weg-Kurve in PBS auf einen sauberen Glasobjektträger berechnen dann die Steigung der Kraft-Weg-Kurve (Abb. 1b). In der Kraft-Weg-Kurve der Messung wird die AFM-Spitze in Richtung Ein-und Ausfahren von der Probenoberfläche an einem einzigen Standort (ohne Rasterung in XY-Richtung), mit der Auslenkung des Cantilevers, Ad, als eine Funktion der Spitze Verschiebung, Az überwacht . </li></ol> Wir empfehlen die Verwendung einer Siliziumnitrid-Dreieck Cantilever mit einer 5-Mikrometer Durchmesser Borosilikat kugelförmigen Spitze (Novascan). Mit AFM-Sonden mit einer Federkonstante von 0,06 N / m haben wir mechanisch weichen Materialien mit Schubmodule überspannt 100 bis 50.000 Pa aus. <ol start="6"><li> Wischen Sie die Unterseite der Probe Deckglas mit Seidenpapier, befestigen Sie es an einem Standard-Objektträger aus Glas mit Vakuum-Fett, montieren Sie die Glasplatte auf dem AFM Probenbühne und decken das Gewebe mit 500 ul PBS (Raumtemperatur). </li><li> Set dem Mikroskop Okular betrachten, die AFM-Spitze in der Mitte des Sichtfeldes durch eine Anpassung des Mikroskops Probenbühne auszurichten. Wählen Sie einen Bereich von Zinsen auf das Gewebe, indem Sie die AFM Probe Bühne, dann auf CCD-Kamera-Schalter-Anzeige zur Phasenkontrast-Bild und / oder Fluoreszenz-Aufnahmen des Gewebes erfassen, wie gewünscht. </li><li> Führen Sie Standard-AFM Engagement Betrieb, indem die AFM-Spitze langsam nach unten, bis sie in Kontakt mit der Probe ist. </li><li> Genaue AFM Mikroindentation Charakterisierung von weichen Proben erfordert kleine Eindringtiefen zu großen lokalen Stämme, die den Hertz-Modell für Elastizitätsmodul Berechnung ungültig zu vermeiden. Zur Vermeidung von großen Belastungen führen Einzug in Trigger-Modus, indem Sie die Cantilever maximalen Auslenkung (Triggerpunkt) bis 500 nm. Diese Auslenkung Grenze wird begrenze diemaximale Eindrückkraft auf weniger als 30 nN (F = Cantilever Federkonstante * Verschiebung oder F max = 0,06 nN / nm * 500 nm = 30 nN). </li></ol> Die Vertiefung Geschwindigkeit sollte so gewählt, dass ausreichend langsam, um elastische eher viskoelastischen Eigenschaften der weichen Probe 7 zu erkunden. Ein Geschwindigkeitsbereich von 2-20 um pro Sekunde eignet sich für das Lungengewebe. <ol start="10"><li> Für eine einzelne Messung aus einem Gebiet von Interesse, bewegen Sie die AFM-Sonde, um den Standort von Interesse und führen Sie einen einzigen Einbuchtung auf einem Standard-Kraft-Weg-Kurve (die Sonde bewegt sich nur in Z-Richtung, ohne XY-Scanning) zu sammeln. </li><li> Für die automatisierte Zuordnung einer Region von Interesse, um Force-Karte zu wechseln, wählen Sie die Scan-Format und Sample Points in den ausgewählten Bereich. In Force-Map-Modus speichert der AFM-Spitze Rastern über die Probe Fläche zwischen Vertiefung Bewegungen und individuelle Kraft-Weg-Kurven an jedem Punkt innerhalb einer definierten Probe Netz. Weitere Messstellen wird eine höhere räumliche Auflösung, sondern verlängern die Zeit für das Mapping erforderlich. Wir fanden es sinnvoll, eine 16 x 16 Probe Raster verwenden, um ein 80 x 80-um-Bereich auf eine Vertiefung Geschwindigkeit von 20 mu m pro Sekunde, die in ca. 10 Minuten durchgeführt werden kann map. </li></ol> 3. AFM Datenextraktion <ol><li> Zur Berechnung der E-Modul, passen die Kraft-Weg-Kurve, um die Hertz Kalotte Modell mit der kleinsten Quadrate nichtlineare geschwungene Armatur 8 (Abb. 1 A, C): <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> wo F = k c * Δ d, wird die Kraft auf den Cantilever verbiegen, k c der Biegefeder konstant ist, R Sphäre Spitzenradius ist, δ = Δ z - Δ d ist Einzug und υ ist die Probe Poissonzahl (υ = 0,4 für Lungengewebe 9). </li><li> Zur Beurteilung der Qualität der Anpassung, die Berechnung der SSR-Wert oder die Summe der Quadrate der Differenz zwischen den Daten und die Passform Werte, während die nicht-lineare Kurvenanpassung. Beseitigen unzuverlässig oder un-interpretierbare Messungen durch Verwerfen von Daten aus &quot;schlechten&quot; Kurven mit großen SSR Werte. </li><li> Wenn gewünscht, konvertieren Elastizitätsmodul (E) zu Schubmodul (G), unter Verwendung der Beziehung E = 2 x (1 + υ) x G. Zur Visualisierung räumlicher Muster der Steifigkeit in Force-Map-Modus gesammelt, Plot-Modul Daten in Höhenlinien (z. B. in 16 x 16 Probe Raster für ein 80 x 80-um-Bereich). </li><li> Für die Verarbeitung einer großen Menge von Kraftkurve Daten kann eine benutzerdefinierte Algorithmus geschrieben, um automatisch fit Kraft-Weg-Kurven, extrahieren Moduli und / oder Grundstück elastographs mit dem gleichen Verfahren und Parameter wie in 3.2 und 3.3 (zB Matlab) skizziert werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 (A) Schematische Darstellung des AFM Mikroindentation einer weichen Probe auf einem starren Substrat mit einem kugelförmigen Sonde (mit freundlicher Genehmigung aus Dimitriadis E., et al. 2002 Biophys J 8). (B) Repräsentative Kraft-Weg-Kurve von einem sauberen Objektträger in PBS zu Federauslen Empfindlichkeit bestimmen gesammelt. (C) Repräsentative Kraft-Weg-Kurven von weich (blau) und steif (rot) Proben, die die entsprechenden Parameter aus (A) gesammelt. 4. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 2A zeigt eine Lungenparenchym Streifen auf Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen in PBS befestigt mit einem AFM-Sonde in direkt oberhalb des Bereichs von Interesse und bereit für Mikroindentation Mapping. Abbildung 2B zeigt, dass in gut geschnitten und gefärbt Gewebe, die alveoläre Mikroarchitektur des Lungenparenchyms gut erhalten, wie durch Immunfluoreszenzfärbung für Basalmembran Komponente Laminin ohne Fixierung oder Permeabilisierung beobachtet. Abbildung 2 CD zeigen Immunfluoreszenzfärbung für Kollagen I in frischen unfixierten Lungen von Mäusen, die zuvor mit PBS (Abb. 2C) behandelt geerntet, behandelt oder mit Bleomycin (Abb. 2D) zur Fibrose 10 zu induzieren. Abbildung 3A zeigt ein Beispiel für Kraft-Weg-Diagramme aus AFM Mikroindentation erhalten. Mit der gleichen Krafteinwirkung erzeugt AFM-Spitze eine große Einbuchtung auf einem weichen Bereich (blaue Linie), was zu einer relativ &quot;flachen&quot; Kraft-Weg-Kurve im Vergleich zu einer kleinen Einbuchtung und eine &quot;steile&quot; Kraft-Weg-Kurve für eine steifere Region ( rote Linie). Um eine saubere Kraft Kurven zu erhalten, nach jeder Vertiefung der AFM-Spitze muss vollständig von der Probenoberfläche und frei von Kontakt, bevor die nächste Vertiefung eingefahren werden. Dieser Kontakt freien Zustand entspricht dem flachen Bereich der Kurve in Abbildung 3A, wo die Spitze übersetzt, ohne Federauslen. 3B zeigt eine typische falsche Kurve ohne eine flache Region, die, wenn die Spitze nicht vollständig von der Probenoberfläche eingefahren auftritt (z. B. Soft Probe einttaches bis zur Spitze) macht es unmöglich, den Kontakt zu bestimmen. Wenn die Spitze ist komplett in weiche Probe gefangen ist, kann die Kurve aussehen wie in Abbildung 3C gezeigt, ohne klare Ablenkung, aber kleine Geräusch. Abbildung 4 zeigt Schubmodul Daten aus Kraft-Weg-Kurven räumlich wie Steifigkeit Karten (elastographs), wo Farbskalen mit Schubmodul angezeigt extrahiert. Elastographs zeigen auffallende Unterschiede in der Reichweite und Verteilung von Gewebe Schubmodul in normalen (Abb. 4A) und fibrotische (Abb. 4B) Lungenparenchym und große räumliche Variationen in Schubmodul, insbesondere innerhalb der Lungenverletzung Probe. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. (A) Phasenkontrast-Aufnahme zeigt eine AFM-Sonde über eine Maus Lungenparenchym Streifen. Scale-bar, 50 pm. (B) Immunfärbung von Laminin in normalen Maus Lungengewebe zeigt die alveoläre Mikroarchitektur des normalen Lungenparenchyms. White-Box zeigt typische 80-by-80 um Elastizität Mapping-Bereich. Maßstab: 20 um. (C und D) Immunfärbung von Kollagen I in Kochsalzlösung (C) und Bleomycin (D) behandelten Maus Lungenparenchym. Scale-Bars, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. (A) Repräsentative interpretierbar Kraft-Weg-Kurven aus Kochsalzlösung (blau) und Bleomycin behandelt (rot) Maus Lungenparenchym gesammelt, bzw.. Schwarze Linien sind am besten geeignet, die sich aus der sphärischen Hertz-Modell und sind mit ihren entsprechenden berechneten Elastizitätsmoduln gekennzeichnet. (B, C) Vertreter un-interpretierbaren Kraft-Weg-Kurven. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Representative elastographs von Kochsalzlösung (A) und Bleomycin-behandelten (B) Maus Lungenparenchym gesammelt. Die farbigen Balken zeigen Schubmodul in Kilopascal. Achsenbeschriftungen anzuzeigen räumlichen Skala in Mikrometern. Maßstabsbalken: 20 um

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit AFM Mikroindentation bietet beispiellose räumliche Auflösung (Abb. 4) und bietet eine einzigartige Perspektive auf mikro-Variationen in Gewebesteifigkeit. Als ein Beispiel für seine Nützlichkeit, angegeben bisherigen Makro-Messungen in normaler und fibrotischen Lungengewebe Streifen eine ungefähre 2-3-fache Erhöhung der Elastance mit Fibrose 11,12. Im Gegensatz dazu zeigt AFM Mikroindentation dass Gewebe Versteifung ist klar lokalisiert und mit einigen Regionen ausstellenden bis ~ 30-fache Erhöhung der Schubmodul über dem Median in normalem Lungengewebe 10 beobachtet. Als Matrix Steifigkeit jetzt bekannt ist, entscheidend beeinflussen Zellfunktionen, bieten diese lokalen Messungen von unschätzbarem Wert Parameter an die biofidelity von Zellkultur-Studie der Lungenzellen zu verbessern. Mehrere praktische Fragen ergeben sich durch die Verwendung von dünnen Streifen des Lungengewebes. Die Oberflächen der Bänder sind nicht perfekt flach, da das Gewebe Profil folgt die Architektur des zugrunde liegenden Alveolen. Die AFM-System passt sich automatisch Spitzenposition in der Z-Richtung während Einzug, wenn die Probenoberfläche Höhenvariation kleiner ist als 15-um zu helfen, die Herausforderung zu meistern. Die Messungen sind bei Raumtemperatur nicht 37 ° C aus, so Abweichungen der mechanischen Eigenschaften durch diese Temperaturschwankungen verursacht werden, können nicht ausgewertet werden, obwohl sie würden erwarten, dass kleinere werden. Der Einfluss der zugrunde liegenden Alveolenwand Architektur auf den beobachteten mechanischen Eigenschaften ist schwierig, mit den aktuellen Lichtmikroskopie Setup ermitteln. Zum Beispiel wäre es wünschenswert, um festzustellen, ob Alveolarwände Anisotropie und unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie in Richtungen ausgerichtet oder quer zur Ebene der Wand eingedrückt. Allerdings sind die aktuellen Exemplare dick, und die Imaging-System keine 3D-Funktionen, daher ist es nicht möglich, die lokalen Alveolenwand Orientierung an jedem Punkt des Kontaktes zu bestimmen. Schließlich bleibt der Einfluss der zellulären Bestandteile am gemessenen mechanischen Eigenschaften nicht vollständig geklärt. In den Methoden detaillierte hier werden keine Anstrengungen unternommen, um gezielt zu entfernen zellulären Bestandteile des Gewebes. Allerdings stellen die Zellen an der Oberfläche zur Verfügung Eindrucks kaum lebensfähig zu sein angesichts der Zeit, da Gewebe Ernte und die Notwendigkeit des Schneidens des Gewebes um den Zugang zu den Alveolen zu gewinnen vergangen. Spezielle Experimente an Zellen zu entfernen oder neu zu besiedeln Matrizen mit lebenden Zellen, und bewerten die daraus resultierenden Veränderungen in Gewebesteifigkeit scheint gerechtfertigt. Da frische unfixierten Gewebe für diese Messungen benötigt wird, sollte die Zeit von Gewebe Ernte der Messung vergangen minimiert und Proben sollten bei 4 ° C gelagert werden, um Veränderungen der mechanischen Eigenschaften zu vermeiden. Besonderes Augenmerk sollte, wenn Gewebe Streifen zwischen Containern beim Waschen oder Färben, so dass minimale Verformung oder Beschädigung erzeugten übertragen werden. Für AFM Anwendung in flüssiger, ist ein entscheidender Schritt, um das Gewebe so flach wie möglich schneiden und bewegungsunfähig die Probe auf die Unterstützung Deckglas. Falls vorhanden, kann eine automatisierte Schneiden Maschine wie ein Vibratom oder Gewebe Hobel verwendet, um Scheiben von sehr gleichmäßige Dicke geschnitten werden. Es ist wichtig, um Gewebe-Streifen sofort anschließen, bevor AFM-Messungen und zur Minimierung der Zeit für AFM-Messungen verstrichen, da die Probe wird schließlich aus der Deckgläser ablösen. Eine nützliche Beobachtung ist, dass größere Streifen zu befestigen stabiler zu rutscht abdecken und in Kraft bleiben für längere Laufzeiten in PBS als kleinere Streifen erscheinen. AFM Mikroindentation können charakterisieren Proben umfassen ein breites Spektrum von 100 Pa bis 50 kPa (Schubmodul) bei Verwendung eines Standard 0,06 N / m Ausleger mit einem 5 Mikrometer Durchmesser kugelförmiger Spitze. Dieser Bereich lässt sich mittels Sonden mit unterschiedlichen Federkonstanten werden; AFM-Sonden mit kugelförmigen Glas-Tipps bis hin 0,6 bis 12 &amp;mgr; m im Durchmesser und Federkonstanten zwischen 0,01 bis 0,58 N / m sind im Handel erhältlich (z. B. Novascan) und häufig gebrauchte 3. Mit einem 5 um kugelförmige Spitze, ist die theoretische Kontaktfläche zwischen Spitze und Gewebe etwa 5-9 um 2 für 400-700 nm Vertiefung (Abb. 1A). Kleinere oder größere Tipps können verwendet werden, um kleinere oder größere Schuppen von räumlicher Auflösung liefern. Pyramidal Tipps sind auch in AFM Mikroindentation 13-16 verwendet worden, die zumeist kleineren Kontaktflächen und somit zur Steigerung räumliche Auflösung bei der Kartierung, obwohl Daten Montage komplexer ist für diesen Tipp Geometrie. Mehrere Einschränkungen dieser Methode zu beachten. Die Lunge ist traditionell mechanisch nicht-invasiv, zum Beispiel mit Druck-Volumen-Analyse 17 oder Punch-Einzug der ganzen Lunge 19,20 aus. Invasive Methoden wie das hier beschriebene Veränderung der Lunge Architektur in wichtigen Punkten durch den Verlust der Luft-Flüssigkeit-interface, die normalerweise existiert in der luftgefüllten Lunge und der Verlust der Vorspannung, die Lunge teilweise Inflation bleibt auf Entspannung der Atemmuskulatur. Diese Einschränkungen sind für alle Messungen im Lungengewebe Streifen 18 hergestellt. Bemerkenswert ist jedoch der Median Steifigkeit in das Parenchym von normalem Lungengewebe (Schubmodul ~ 0.5kPa) gemessen unterscheidet sich nicht wesentlich von Schätzungen, die auf Punch-Einzug der intakten Lunge in Ruhe Bänden 19,20 basieren. Während Lungengewebe ist bekannt, dass nicht-linearen Versteifung mit zunehmender Verformung aufweisen, ist es nicht möglich, in einem strengen Mode testen, ob diese Eigenschaft sich weiterhin auf die Mikro-Maßstab mit dem hier verwendeten Verfahren. Die Hertz-Modell geht Homogenität der Probe. Allerdings sind die meisten biologischen Materialien, einschließlich Lungenparenchym, zunehmend heterogenen bei sinkenden räumlichen Skalen. Die Heterogenität der Probe kann Artefakte wie Variation der Young-Modul je nach Eindringtiefe, dh je nach der Schicht oder Komponente, die Verformung führen. Die Heterogenität in der xy-Ebene können durch sorgfältige Auswahl der entsprechenden sphärischen Spitze Größe abhängig von der Mikrostruktur des Biomaterials durch Dimitriadis EK et al begrenzt werden. 8 Es ist viel schwieriger zu prognostizieren oder korrigieren Sie die Hertz-Modell Fehler aufgrund von Material Heterogenität in der z-Richtung. Azeloglu et al. vor kurzem vorgeschlagen, ein Hybrid-Rechenmodell, um die elastischen Eigenschaften von heterogenen Substrat mit diskreten eingebetteten Einschlüsse 21 charakterisieren. Ihre neue Technik bietet ein mögliches Mittel, um die Aufnahme Eigenschaften von heterogenen Materialien Überwindung der Beschränkungen des Hertzschen Analyse zu berechnen. Die Hertz-Modell nimmt auch absolute elastische Verhalten, während biologische Materialien zeigen in der Regel zeitabhängige viskoelastische Verhalten. Eine vollständige viskoelastische Charakterisierung des Gewebes kann durch Variation der Einzug Geschwindigkeiten verwendet eingeholt werden. Wichtig ist, zeigt bisherigen Makro-mechanische Prüfung von Normal-und fibrotischen Lungengewebe schwache Frequenzabhängigkeit des Lungengewebes mechanischen Eigenschaften und die Bewahrung der Unterschiede zwischen normalen und Bindegewebe mechanischen Eigenschaften über alle Frequenzen getestet 11. Diese Befunde legen nahe, dass die Messung der mechanischen Eigenschaften mit einer einzigen Vertiefung Geschwindigkeit, mit AFM ein wesentlicher Aspekt der Veränderungen im Gewebe mechanische Eigenschaften, die Fibrose begleiten erfasst. Die Poisson-Verhältnis von 0,4 für das Lungengewebe in dieser Arbeit verwendet wird, aus einer makroskopischen Messung 9. Leider sind die Poissonzahl auf Mikro-Ebene und Änderungen unter Krankheitszustand in der Literatur nicht zur Verfügung. Als Alternative zu E, E / (1-υ 2) oder (1-υ 2) / πE (die elastische Konstante k bezeichnet) 22 kann von AFM Mikroindentation berechnet und gemeldet werden, wenn die Poissonzahl unbekannt ist. Für die meisten Biomaterialien Poissonzahl ist im Bereich von 0,4 bis 0,5 aufgrund ihres hohen Wassergehaltes. Im Bereich von 0,3 bis 0,5 variiert der Faktor 1 / (1-υ 2) nur 1,10 bis 1,33, so dass zumutbare Abweichungen in der Poissonzahl nur bescheidene Auswirkungen auf die gemeldete Modul auszuüben. Der Anstieg der Schubmodul, dass wir Bericht für fibrotische Gewebe bezogen auf normales Gewebe ist mehrfach in Größe, was bedeutet, dass Fehler mit Variationen in Poissonzahl verbundenen geringen relativ zu den Veränderungen der mechanischen Eigenschaften beobachtet werden. Der eigentliche Algorithmus und Code, der für die Analyse der Kraft-Weg-Daten verwendet werden kann, ist vorbehaltlich der spezifischen Anwendung Zustand und die anschließende Eigenschaften der verschiedenen Bevölkerungsgruppen des Kraft-Weg-Kurven. Wenn mehr ausgefeilte Analyse von Interesse ist, kann man bitte das Arbeitsprogramm der Lin et al. 23. Die Autoren stellten eine Reihe von synergistischen Strategien in einen Algorithmus, der viele der Komplikationen, die bisher die Bemühungen um den Einbau von Hertz-Modelle Einzug Daten automatisieren behindert haben überwindet. Mehrere andere Bereiche sind für die weitere Entwicklung und Nutzung dieser Methode. In Fällen, wo man bei der Visualisierung der Alveolarwände ohne Antikörpermarkierung interessiert ist, kann sowohl Elastin und Kollagen visualisiert werden von ihren autofluoreszierenden Signal im grünen Spektrum. Auf der anderen Seite könnte eine bessere Bildgebung, entweder mit dünner Gewebeschnitte, 3D-Bildgebung, oder beides, verbessern die Fähigkeit, Gewebe-Architektur mit zugrunde liegenden mechanischen Eigenschaften korreliert. Während die aktuellen Methoden Färbung und Visualisierung von Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Kollagen und Laminin ermöglichen, könnten zusätzliche Anstrengungen zur Färbung Zelloberflächenmarker auf bestimmte Zellpopulationen zu identifizieren und die mechanische Mikroumgebungen in der Nähe solcher Populationen zu charakterisieren angestrebt werden. Alternatively, konnte Gewebe von Mäusen, die Fluoreszenz-markierten Linie Marker oder Zelle bestimmte Proteine, die dasselbe Ziel verfolgen, geerntet werden. Schließlich detailliert die Methode scheint hier gut zu charakterisieren andere anatomische Merkmale in der Lunge, wie Schiffe, die Umgestaltung in Hypertonie und Atemwegen, die Umgestaltung in Asthmatiker geeignet. Auf der Grundlage seiner aktuellen Stand der Entwicklung und das Potenzial für eine weitere Verbesserung, erscheint AFM Mikroindentation balanciert, um wertvolle Einblicke in die Veränderungen im Gewebe Steifigkeit, die Progression der Erkrankung in der Lunge begleiten Ausbeute und wird ohne Zweifel von Wert bei der Charakterisierung von räumlichen und zeitlichen Veränderungen in der Steifigkeit einer Vielzahl anderer Weichteile.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> AFM-Spitze </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 Mikron Borosilikat Perlen, 0,06 N / m </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12 mm rund No.1 Glas </td></tr><tr><td> Agarose, Low Geliertemperatur </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen-Anti-Collagen I (Rb PAB) Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab34710-100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 Ziege anti-Kaninchen-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen-anti-Laminin </td><td> Sigma </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy

Matrix Steifigkeit stark beeinflusst Wachstum, Differenzierung und Funktion von anhaftenden Zellen 1-3. Auf der Makroebene die Steifigkeit von Geweben und Organen im menschlichen Körper über mehrere Größenordnungen 4. Viel weniger ist über, wie Steifigkeit räumlich variiert innerhalb von Geweben bekannt, und was den Umfang und die räumliche Skala von Steifigkeit Änderungen sind in Krankheitsprozesse, die sich in Gewebe-Remodeling. Um besser zu verstehen, wie sich Änderungen in der Matrix Steifigkeit Zellphysiologie beitragen in Gesundheit und Krankheit, werden die Messungen von Gewebe Steifigkeit bei einer räumlichen Skala relevanten Wohnsitz erhaltenen Zellen benötigt. Dies gilt insbesondere für die Lunge, ein hoch-konform und elastischem Gewebe, in dem Matrix Remodelling ist ein hervorstechendes Merkmal in Krankheiten wie Asthma, Emphysem, Hypertonie und Fibrose. Zur Charakterisierung der lokalen mechanischen Umfeld des Lungenparenchyms mit einer räumlichen Skala relevanten residenten Zellen haben wir Methoden zur direkten Messung der lokalen elastischen Eigenschaften des frischen murine Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikroindentation entwickelt. Bei entsprechender Wahl der AFM Eindringkörper, Freischwinger und Eindringtiefe, erlauben diese Methoden Messungen der lokalen Gewebe Schubmodul parallel mit Phasenkontrast-und Fluoreszenz-Imaging in der Region von Interesse. Systematische Entnahme von Gewebe-Streifen bietet Karten von Gewebe mechanische Eigenschaften, die lokale räumliche Variationen in Schubmodul offenbaren. Korrelationen zwischen mechanischen Eigenschaften und der zugrunde liegenden anatomischen und pathologischen Merkmale zeigen, wie Steifigkeit mit Matrix-Ablagerung in Fibrose variiert. Diese Methoden können in andere Weichteile und Krankheiten ausgedehnt werden, um zeigen, wie lokale Gewebe mechanische Eigenschaften über Raum und zum Fortschreiten der Krankheit variieren.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Die Steifigkeit der extrazellulären Matrix stark beeinflusst mehrere Verhalten von adhärenten Zellen. Matrix Steifigkeit variiert räumlich in einem Gewebe, und unterliegt Änderungen in verschiedenen Krankheitszuständen. Hier entwickeln wir Methoden, um räumliche Veränderungen der Steifigkeit in normalen und fibrotische Maus Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie Mikroindentation charakterisieren.

Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

micro-mechanical-characterization-lung-tissue-using-atomic-force

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Aufrufe.  Harvard School of Public Health. Die Steifigkeit der extrazellulären Matrix stark beeinflusst mehrere Verhalten von adhärenten Zellen. Matrix Steifigkeit variiert räumlich in einem Gewebe, und unterliegt Änderungen in verschiedenen Krankheitszuständen. Hier entwickeln wir Methoden, um räumliche Veränderungen der Steifigkeit in normalen und fibrotische Maus Lungengewebe mit Rasterkraftmikroskopie Mikroindentation charakterisieren.

Serie: Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Forschung

Biologie

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Three-dimensional Characterization of Interorganelle Contact Sites in Hepatocytes using Serial Section Electron Microscopy

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is often limited to two dimensions, hampering the ability to fully describe the three-dimensional (3D) ultrastructure and functional relationship between organelles. Volume electron microscopy (vEM) describes a collection of techniques that enable the interrogation of cellular ultrastructure in 3D at mesoscale, microscale, and nanoscale resolutions. 
This protocol provides an accessible and robust method to acquire vEM data using serial section transmission EM (TEM) and covers the technical aspects of sample processing through to digital 3D reconstruction in a single, straightforward workflow. To demonstrate the usefulness of this technique, the 3D ultrastructural relationship between the endoplasmic reticulum and mitochondria and their contact sites in liver hepatocytes is presented. Interorganelle contacts serve vital roles in the transfer of ions, lipids, nutrients, and other small molecules between organelles. However, despite their initial discovery in hepatocytes, there is still much to learn about their physical features, dynamics, and functions. 
Interorganelle contacts can display a range of morphologies, varying in the proximity of the two organelles to one another (typically ~10-30 nm) and the extent of the contact site (from punctate contacts to larger 3D cisternal-like contacts). The examination of close contacts requires high-resolution imaging, and serial section TEM is well suited to visualize the 3D ultrastructural of interorganelle contacts during hepatocyte differentiation, as well as alterations in hepatocyte architecture associated with metabolic diseases.

A simple and comprehensive protocol to acquire three-dimensional details of membrane contact sites between organelles in hepatocytes from the liver or cells in other tissues.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Transmission electron microscopy has been long considered to be the gold standard for the visualization of cellular ultrastructure. However, analysis is ...