Die Finanzierung wurde von NIH gewährt 5T32CA09216-26 (GKI) und K01 AR055619-01A1 und 3 K01 AR055619-03S1 (für DML) sowie von der Alex &#39;Lemonade Stand-Stiftung, der Harvard Stem Cell Institute und der American Cancer bereitgestellt Society.

1. DNA Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen <ol><li> Linearisieren Rag2: cMyc und Rag2:: GFP 11 DNA-Konstrukte durch Verdauen 10 ug jedes Plasmid mit NotI bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Phenol: Chloroform-Extrakt und Fällung der Plasmide und resuspendieren jeweils in 20 &amp;mgr; l H 2 O. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der DNA, indem Sie einen 1:1, 1:5 und 1:10 Verdünnung von jeder verdauten Plasmid auf einem 1% Agarosegel mit 20 &amp;mgr; l, 10 &amp;mgr; l und 5μL eines High-Bereich DNA-Leiter. Diese Art der Quantifizierung ist in der Regel genauer als ein Spektrometer zu lesen. </li><li> Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 60ng/μL in 1M KCl +0.5 x TE für die Injektion in CG1-Dehnungs-(oder andere syngenen Stamm) Zebrafischembryonen mit 30ng/μL Rag2: cMyc + 30ng/μL Rag2:: GFP. </li><li> Injektionen sollten wie zuvor gezeigt, 12, 13 durchgeführt werden. Kurz gesagt, werden männliche und weibliche Zebrafisch in Paarung Kammern der Nacht vor der Injektion gesetzt. Am Tag der Injektion von DNA in die Injektionsnadel geladen wird, ist der Druck, so dass eine Blase mit einem Durchmesser von 50 um ausgestoßen wird (30pg DNA), das von einer Bühne Mikrometer gemessen angepasst. Dann werden Embryonen im Ein-Zell-Stadium injiziert, mit der DNA direkt in die Zelle injiziert, und nicht in den Dotter. Survival of the injiziert CG1 Embryonen und Larven in der Regel arm, und nur 5% der Fische erfolgreich integrieren das Transgen, so&gt; 600 Embryonen injiziert, um sicherzustellen, dass einige Fische Leukämie zu entwickeln. </li><li> Bewahren Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 ° C, und entfernen Sie die toten Embryonen nach 24 Stunden. Die Tiere werden dann zu großen Tanks bei 5 Tagen des Lebens übertragen und aufgewachsen wie zuvor 14 beschrieben. </li></ol> 2. Screening für primäre T-ALL in Zebrafisch-Larven <ol><li> Etwa 28 Tage nach der Injektion betäuben Larven Zebrafisch, indem 200 ul der 4ng / m Tricane-S auf 25 mL der Fische System Wasser in einer Petrischale. </li><li> Untersuchen Sie die Larven für die Entwicklung der T-ALL mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung, mit einer 485/20 Anregungswellenlänge und 530/25 Emissionsfilter auf GFP-Fluoreszenz (Abbildung 1) erkennt fluoreszenzmarkierten. </li><li> Separate Tumor positive Larven von denen, die negativ sind. Negative Larven zu einem späteren Zeitpunkt geprüft werden kann, wenn Tumoren größer geworden sind, um sicherzustellen, dass kein T-ALL positive Fisch verpasst wurden. </li><li> Monitor-T-ALL positive Fisch mindestens einmal pro Woche mit dem Epifluoreszenzmikroskop, das Tumorwachstum zu verfolgen. </li></ol> 3. Isolierung und Aufreinigung von fluoreszenzmarkierten primären Leukämiezellen <ol><li> Wenn GFP-positive Leukämie-Zellen haben&gt; 50% der Tier überholt, Opfer der Fische durch Zugabe von 1 ml der 4ng/mL Tricane-S in einer Petrischale mit 9 mL Fisch System Wasser. </li><li> Den Fisch in eine neue Petrischale mit 1 ml 0.9X PBS mit 5% fötalem Rinderserum, um die Zellen Puffer. Mazerat die Fische mit einer Rasierklinge, pipet die Mischung auf große Zellklumpen distanzieren, dann passieren die Zellen durch ein 40 um mesh Sieb in eine 50 ml Tube. Es ist nicht notwendig, alle Gewebe Klumpen in einzelne Zellen zerfallen. </li><li> Pipet 500μL der Zellen zu einer 4mL Polystyrol Röhre. Add 1μL 1mg/ml Propidiumiodid (PI), die toten Zellen Etikett wird. Vortex, dann halten die Zellen auf Eis. </li><li> Sacrifice einem Wildtyp-CG1 Fisch, Mazerat und Belastung in der gleichen Weise wie oben zu normalen Zellen, die als Träger für die Tumorzellen dienen während transplant.Add 4mL 5% FBS in 0.9X PBS zu sammeln, um die 50ml Tube für insgesamt Volumen von 5 mL. </li><li> Zählen Sie die normalen Zellen, zu verdünnen, um 3x10 5 Zellen / ml in 5% FBS in 0.9X PBS, dann pipet 100μL/well einer 96-Well-Platte. </li><li> Mit einem Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), sort GFP positive, PI negativen Tumorzellen (Abbildung 2A, B) in den 96-Well-Platte mit Blutzellen bei den folgenden Dosierungen: 10 Zellen / Well in 48 Brunnen, 100 Zellen / well in 24 Wells, 1000 Zellen / Well in 12 Brunnen, und 10.000 Zellen / Well in 6 Vertiefungen. Darüber hinaus sollten 10.000 Zellen in einen Brunnen ohne normale Blutzellen sortiert werden, und erneut analysiert mittels FACS, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der sortierten Zellen (Abbildung 2C) zu beurteilen. </li></ol> 4. Grenzverdünnung Transplantation in erwachsenen Zebrafisch <ol><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugieren der 96-Well-Platte bei 2000xg für 10 Minuten. </li><li> Entfernen 95μL des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in den verbleibenden 5μL. </li><li> Halten Sie ein Erwachsener (&gt; 60 Tage alt) syngenen Zebrafisch Bauchseite auf und injizieren die Zellsuspension in die Bauchhöhle mit einem 26G / 2 &quot;Mikro-Spritze. Zebrafische haben nicht zu sein vor der Transplantation betäubt. In der Regel, 45 Fische mit 10 Leukämie-Zellen transplantiert, 20 mit 100 Zellen transplantiert werden, 7 sind mit 1.000 Zellen und 5 Fische transplantiert werden mit 10.000 T-ALL-Zellen transplantiert. </li></ol> 5. Analyse zur Leukämie-initiierende Zellen Frequenz bestimmen <ol><li> Etwa 28 Tage nach der Transplantation, untersuchen die transplantierten Fisch mit einem epifluoresence Mikroskop mit einer 485/20 Anregungswellenlänge und 530/25 Emissionsfilter auf GFP-Fluoreszenz zu erkennen. Notieren Sie die Anzahl der positiven Fisch pro Gesamtzahl der Fische injiziert. </li><li> Erneut zu prüfen, die Fische alle 14 Tage für bis zu 90 Tage und notieren Sie die Anzahl der positiven Fisch. Wenn ein Tumor-positive Fisch moribund geworden, Opfer des Tieres durch Tricane-S Überdosierung. </li><li> Geben Sie die Ergebnisse in eine Tabelle, wie in Abbildung 3D gezeigt. Laden Sie die Daten in die Web-basierte ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) statistische Software <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, die die Häufigkeit des Tumor-positiven und negativen Tieren verwendet bei Jede Transplantation Dosis die Häufigkeit von selbst erneuernden Leukämiezellen in der primären T-ALL zu bestimmen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: DNA Mikroinjektion in Embryonen aus syngenen Fisch führt oft zu einer geringen Überlebensrate der injizierten Embryonen, mit &lt;60% der Embryonen überleben über 24 Stunden. Darüber hinaus ist das Überleben der injizierten syngenen Fische in der Regel während Larvalentwicklung Armen, mit oft &lt;20% überlebende für 28 Tage. Es ist daher wichtig, eine große Anzahl von Embryonen zu injizieren, um transgene Fische, die T-ALL entwickeln zu schaffen. Als Beispiel CG1 Belastung Embryonen wurden mit Rag2 injiziert: cMyc + Rag2:: GFP. Die Transgene in den sich entwickelnden Embryo Zusammenarbeit zu trennen, so dass jede Zelle, die GFP drückt auch ausdrücken cMyc. Die Larven wurden für die primäre T-ALL nach 28 Tagen (Abbildung 1) gezeigt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass etwa 5% der injizierten Fische haben GFP-positive T-Zellen innerhalb ihrer Thymus (Abbildung 1) und 100% dieser Fische Leukämie zu entwickeln, wie die T-Zellen transformiert 11 werden. Während ein kleiner Teil der Zebrafisch eine erweiterte Leukämie, die sehr leicht zu erkennen an Tag 28 wird haben können, die meisten haben nur eine GFP-positive Thymus (Abbildung 1), sollte so Larven einzeln unter hoher Vergrößerung untersucht werden, um sicherzustellen, dass alle positiven Fische sind ausgewählt. GFP-positive T-ALL Zellen&gt; 50% der Tiere zwischen den Tagen 45-70 überholen. In dem Beispiel zur Verfügung gestellt wurden Zebrafisch bei 65 Tagen des Lebens geopfert, und Leukämie-Zellen wurden isoliert und FACS für Grenzverdünnung Transplantation sortiert. Einzelne Zellen, die Propidiumiodid negativ und GFP-positiv (Abbildung 2) wurden in eine 96-Well-Platte sortiert. Reanalyse wurde auf 10.000 sortierten Zellen durchgeführt, um die Lebensfähigkeit (idealerweise&gt; 95%) und Reinheit zu beurteilen (idealerweise&gt; 92%, Abbildung 2). Transplantierte T Besserwisser in der Regel auftreten, bevor 28 Tage, aber einige Tumoren kann mehr als 60 Tage zu entwickeln. In diesem Beispiel am Tag 28 wurden frühzeitig Tumore als einen Raum der GFP-positiven Zellen in der Nähe der Injektionsstelle (3B) zu sehen, während einige T Besserwisser wurden mehr Fortschritte gemacht, mit erweitert, um die Bauchhöhle (Abbildung 3C) füllen . Daten aus Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays aus drei verschiedenen primären T-Alls sind in Abbildung 3D gezeigt. Für diese Experimente wurden über 220 Tiere transplantiert, die leicht von einer Person innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden. Datenanalyse mit ELDA-Software zeigten, dass im Durchschnitt 1 in 135 T-ALL-Zellen selbst erneuernden wurden Leukämie-Zellen ausbreiten (Abbildung 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1 Zebrafisch-Larven an der Ein-Zell-Stadium mit Lappen injiziert.::-CMyc + Tuch::-eGFP wurden für die primäre Leukämie Wachstum abgeschirmt 28 Tage nach der Injektion. Fisch (*) hatte GFP-positive T-Zellen innerhalb des Thymus; dieser Fisch wird T-ALL entwickeln, wie die T-Zellen transformiert im Laufe der Zeit geworden. Diese Phase ist sehr häufig am Tag 28. Ein Fisch (**) hatten eine fortgeschrittene T-ALL, die in die Weichteile ausgebreitet hat. Die restlichen zwei Fische sind für das Tumorwachstum negativ. Das Bild wurde bei 16-facher Vergrößerung aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Fluoreszenzmarkierten T-ALL-Zellen wurden aus erkrankten Tieren sortiert und in den Grenzverdünnung Zelltransplantation Assay. Erstens, ein Tor gezogen wurde, um einzelne Zellen (obere linke Seite) wählen, werden dann Propidiumiodid-negativen Zellen ausgewählt (Mitte links). Schließlich wurde ein Tor gezogen, um nur die GFP-positiven Leukämiezellen zur Sortierung (untere linke Tafel) auszuwählen. Sortiert Zellen sollten erneut analysiert werden, um die Lebensfähigkeit und Reinheit vor der Transplantation (rechte Bilder) zu beurteilen. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Zebrafisch wurden für Leukämie Wachstum von 28 Tagen nach Transplantation untersucht. Die Fische werden entweder Tumor negAtive (A), haben einen kleinen Tumor wächst an der Injektionsstelle (B), oder einen Verlauf Leukämie (C). Die Bilder wurden in 7-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Gesamtzahl der Leukämie-positive Fisch pro Gesamtzahl der Fisch bei jeder Verdünnung transplantiert wird aufgezeichnet, wie in (D). Die Daten werden in die Web-basierte ELDA-Programm die Anzahl der Berechnung selbst erneuernden Leukämiezellen und die oberen und unteren 95%-Konfidenzintervall (E).

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Eine wesentliche Stärke der Verwendung von Zebrafisch in der Krebsforschung ist, dass eine große Zahl von Tieren mit relativ geringem Aufwand genutzt werden kann. Dies ist besonders wichtig in Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays, in denen der Anteil der transplantierten Tieren, die Tumoren zu entwickeln, um die Gesamtzahl transplantiert verwendet werden, um Tumor-initiierende Zellen Frequenz zu bestimmen. In dem hier vorgestellten Verfahren sind über 70 Transplantatempfängers Tiere pro Test verwendet und bietet eine genaue Schätzung der Tumor-Ausbreitung Zellzahl. Sowohl die Anzahl der verwendeten Tiere und die Dosen von Tumorzellen transplantiert auf eine bestimmte Krebsart Modell sollte optimiert werden, zum Beispiel, wenn erste Versuche Tumor-initiierende Zellen sind selten zeigen, kann nützlich Transplantation Dosen 100.000, 50.000, 10.000 und 1.000 Zellen pro werden Transplantation. Syngenen Zebrafisch-Stämme sind nützlich in Grenzverdünnung Analyse. Allerdings sind diese Stämme noch nicht allgemein in allen Laboren verwendet, und einige Zebrafisch Krebs Modelle gibt es nur in allogenen Fisch. Grenzverdünnung zelltransplantationen kann in Wildtyp-Stämmen, die immun Ablation unterzogen haben durchgeführt werden, obwohl der sich selbst erneuernden Zellen Frequenz von 10 bis 100-fach höher als bei syngenen Zebrafisch wurden 8 verwendet berechnet werden kann. Es ist wichtig zu beachten, dass größere Dosen von Zellen für Transplantationen in nicht-immune abgestimmt, bestrahlte Empfänger verwendet werden soll, wie manche Tumorzellen nicht überleben wird Transplantation in eine fremde Mikroumgebung. Darüber hinaus werden viele Tumoren beginnen, nach 21 Tagen, wenn der Empfänger Tier, das Immunsystem erholt sich zurückbilden, so Tiere sollten für das Tumorwachstum alle 7 Tage nach der Transplantation beurteilt werden. Die hier vorgestellten Methoden eignen sich für den Einsatz mit jedem Zebrafisch Krebs-Modell und wurde bisher noch nicht verwendet, um festzustellen, Tumor-initiierende Zellen Frequenz in den beiden T-Zell akute lymphatische Leukämie 8 und einen soliden Tumor-Modell, Rhabdomyosarkom 16. Diese Tumoren wurden Fluoreszenz durch Co-Injektion von Embryonen mit beiden ein Onkogen und fluoreszierenden Marker markiert, weil die DNA co-trennt, jede Zelle, die das Onkogen wird auch zum Ausdruck des fluoreszierenden Proteins 17. Während Fluoreszenz wird empfohlen, weil es Verfolgung von Tumorwachstum, ohne die Notwendigkeit, die Tieropfer erleichtert und bietet eine unkomplizierte Möglichkeit, Tumorzellen durch FACS zu isolieren, ist es möglich, Tumorzellen mit Antikörpern gegen Tumor-spezifische Entscheidungsträger Label, um ihre Reinigung zu erleichtern , kann aber Antikörper-Färbung in Zebrafisch erfordern Optimierung. Schließlich, nachdem die Häufigkeit von Tumor-Zellen propagieren für eine bestimmte Tumorart bestimmt worden ist, ist es möglich, diese Tests verwenden, um die Mechanismen, die ihre Zelle Frequenz regeln zu identifizieren. Zum Beispiel können primäre Tumorzellen mit Bahn spezifische Inhibitoren vor Grenzverdünnung Transplantation oder transplantiert Fische selbst mit Medikamenten verabreicht werden kann, behandelt werden. Darüber hinaus kann die Genetik der Tumoren selbst durch Injektion des one-Zell-Stadium Fisch mit einem Gen von Interesse manipuliert werden, so dass die resultierende primäre Tumoren überexprimieren des Gens. In diesen Experimenten wird keine Auswirkungen auf sich selbst erneuernden Zellen Frequenz im Grenzverdünnung Assays beobachtet werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagens </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th></tr><tr><td> NotI Restriktionsenzym </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Phenol: Chloroform </td><td> EMD Biochemicals </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> 5M KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> High Range DNA-Leiter </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Syngenen Zebrafisch </td><td></td><td> Referenzen 6-8 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Mikroliterspritze </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40 um Maschenweite Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

Self-Erneuerung Krebszellen sind die einzigen Zelltypen innerhalb eines Tumors, der eine unbegrenzte Fähigkeit, das Tumorwachstum zu fördern, und sind damit als Tumor-Ausbreitung Zellen oder Tumor-initiierende Zellen bezeichnet. Es wird vermutet, dass die Konzentration dieser sich selbst erneuernden Zellen für die Zerstörung wird Tumorprogression Block und stoppen Rückfall, erheblich verbessert Prognose der Patienten 1. Der häufigste Weg, um die Häufigkeit der Bestimmung selbst erneuernden Zellen innerhalb eines Tumors ist eine Grenzverdünnung Zelltransplantation Assay, in dem Tumorzellen in Empfängertiere bei steigenden Dosen transplantiert werden, der Anteil der Tiere, die Tumoren zu entwickeln wird die Berechnung der Anzahl der sich selbst erneuernden Zellen innerhalb des ursprünglichen Tumors Probe 2, 3. Im Idealfall würde eine große Zahl der Tiere in jeder Grenzverdünnung Experiment verwendet werden, um eine genaue Bestimmung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Zellen. Allerdings sind in großem Maßstab Experimenten mit Mäusen teuer, und die meisten Grenzverdünnung Assays verwenden nur 10-15 Mäuse pro Experiment. Zebrafische haben Bedeutung als Krebs-Modell gewonnen, zum großen Teil durch ihre einfache genetische Manipulation und die Wirtschaft durch die breit angelegte Erprobung durchgeführt werden können. Darüber hinaus haben die Krebsarten in Zebrafisch-Modell gefunden worden, um genau imitieren ihr Gegenstück menschlicher Erkrankungen 4. Während es möglich ist, Tumorzellen von einem Fisch zum anderen durch sub-letalen Bestrahlung des Empfängers Tiere, die Regeneration des Immunsystems nach 21 Tagen Transplantation häufig zu Tumorregression 5. Die jüngste Kreation von syngenen Zebrafisch hat erheblich erleichtert Tumortransplantation Studien 6-8. Da diese Tiere genetisch identisch sind, transplantiert Tumorzellen einprägen robust in Empfänger Fisch, und das Tumorwachstum kann über längere Zeit überwacht werden. Syngenen Zebrafisch sind ideal für Grenzverdünnung Transplantation Assays in die Tumorzellen müssen nicht um das Wachstum in einem fremden Mikroumgebung, die sich selbst erneuernden Zellen Frequenz 9, 10 unterschätzen angepasst werden können. Zusätzlich ein Zelltransplantaten wurden erfolgreich abgeschlossen mit syngenen Zebrafisch 8 und mehrere hundert Tiere können einfach und kostengünstig auf einmal transplantiert werden, die beide um eine genauere Schätzung der sich selbst erneuernden Zellen Frequenz sorgen dienen. Hier wird eine Methode zum Erstellen primärer, fluoreszenzmarkierten T-Zell akuter lymphatischer Leukämie (T-ALL) in syngenen Zebrafisch und Transplantation dieser Tumoren bei Grenzverdünnung zu erwachsenen Fische selbst erneuernden Zellen Frequenz bestimmen, vorgestellt. Während Leukämie als Beispiel vorgesehen ist, ist dieses Protokoll geeignet, um die Häufigkeit der Tumor-Ausbreitung Zellen mit jeder Krebs-Modell in der Zebrafisch zu bestimmen.

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays werden benutzt, um die Häufigkeit des Tumor-Ausbreitung Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von syngenen Zebrafisch, dass fluoreszenzmarkierten Leukämie und Details, wie zu isolieren und zu verpflanzen diesen Leukämiezellen bei Grenzverdünnung in die Bauchhöhle von erwachsenen Zebrafisch zu entwickeln.

Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Aufrufe.  Harvard Medical School. Grenzverdünnung Zelltransplantation Assays werden benutzt, um die Häufigkeit des Tumor-Ausbreitung Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von syngenen Zebrafisch, dass fluoreszenzmarkierten Leukämie und Details, wie zu isolieren und zu verpflanzen diesen Leukämiezellen bei Grenzverdünnung in die Bauchhöhle von erwachsenen Zebrafisch zu entwickeln.

Serie: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Tracheotomie: Eine Methode zur Transplantation von Stammzellen in die Lunge

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...