Wir wollen Rebecca Paquette für die Unterstützung bei Reagenzzubereitung danken. MPM wird von einem Ruth L. Kirchstein Promotionsstipendium von der National Institutes of Health und der Unterstützung durch Stipendien GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) auch von den National Institutes of Health unterstützt.

1. Adoptiven Transfer von Zellen: Schwanzvene oder intraokulare Injektion sowohl geeignete Methoden für die Einführung der Zelle tracker-markierten oder fluoreszierenden Protein-exprimierenden Lymphozyten. In diesem Video. wir zeigen, adoptiven Transfer von Zellen durch Schwanzvene Injektion. a. Materialien CD4 + T-Zellen sind mit 1,4 uM CFSE für 30 Minuten bei 37 º C gekennzeichnet, zweimal gewaschen, und in 100 ul RPMI-1640 resuspendiert. Die Zellen werden in ein steriles 28 Stärke Insulin Spritze zur Injektion geladen. Die Anzahl der Zellen richtet sich nach dem Experiment getan. Typischerweise sind 5 Millionen T-Zellen ausreichend für einfache T-Zell-Visualisierung. Ein Nagetier restrainer für die Maus benötigt wird, um Verletzungen des Tieres und sich selbst zu verhindern. b. Die Sicherung der Tier- Die Maus ist für adoptiven Transfer von langsam Unterstützung des Tieres in das Nagetier restrainer (siehe Video) und das offene Ende der Röhre durch leichtes Herunterdrücken des Kolbens gesichert. Nicht loslassen der Maus Schwanz während dieses Prozesses, da einige kleinere Tiere können umdrehen im restrainer. Diese Methode verhindert, dass das Tier von einer Verletzung selbst und von beweglichen während der Injektion. Beim Einrichten der Nager restrainer, nicht drücken Sie den Kolben in weiteren als notwendig, um das Tier aus Springen nach vorn zu behalten. Auch tun nicht den Kolben gegen das Tier, und nicht aus dem Tier in der restrainer für einen längeren Zeitraum. c. Visualisierung der Schwanzvene Ziehen Sie das Heck zu Ihnen, so dass es leicht ist, über den Zeigefinger gewickelt und hielt gegen die Innenseite des Fingers durch den Daumen. Identifizieren Sie die Schwanzvenen auf beiden Seiten des aufrechten Schwanzes entfernt. Die Visualisierung ist durch die Erwärmung der Schwanz mit warmem Wasser, dann wischte sich mit Ethanol erleichtert. d. Die Injektion von Zellen Wenn die Vene gefunden wurde, legen Sie die Spritze Kegel-Seite nach oben in einem flachen Winkel parallel zur Ader. Einmal in die Vene, sanft drücken Sie den Kolben, und wenn du in die Vene werden sollte keinen Widerstand gegen die Injektion. Wenn es irgendeinen Widerstand, entfernen Sie die Spritze und versuchen Sie es erneut an einem anderen Ort. Wenn Sie in die Vene sind, langsam drücken Sie den Kolben, bis die Injektion abgeschlossen ist. Die Rute sollte nicht während der Injektion aufgetrieben. Wenn ja, würde dies bedeuten, dass die Nadel nicht in die Vene. Es ist möglich, &quot;verlieren&quot; die Vene bei der Injektion. Wenn dies geschieht, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie Ihr Injektion an einer anderen Stelle. Wenn Sie mehr als eine Injektion versuchen müssen, ist es am besten, den Schwanz nach oben in Richtung der Körper der Maus aus der ursprünglichen Einstichstelle. Planen Sie im Voraus für diese Möglichkeit, indem Sie nach distal auf dem Schwanz, um sich selbst Raum für einen weiteren Versuch an die Adoptiveltern übertragen. e. Post-Injektion Überlegungen Nach der Injektion abgeschlossen ist, wird eine kleine Rückfluss des Blutes aus den Venen auftreten. Drücken Sie vorsichtig die Einstichstelle mit einem, bis die Blutung aufhört sauber wischen. Entfernen Sie den Kolben und lassen Sie das Tier nach vorne zu gehen, aus dem restrainer, während sanft Festhalten an der Rute. Immer mit Ihrem Tierpflege Ausschuss und Nutzung von Tieren Protokolle überprüfen, um sicherzustellen, Sie sind im Einklang. Es ist wichtig, die Praxis dieser Technik mehrere Male, bevor Sie versuchen das echte Experiment. 2. Lymph Node Isolation Isolation von Lymphknoten für Zwei-Photonen-Imaging erfordert eine sorgfältige Entfernung der richtige Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe. a. Auswahl und Lage der peripheren Lymphknoten Auswahl der Lymphknoten für die Bildgebung auf den experimentellen Ziele abhängen. Seien Sie sich bewusst von einer lokalen Infektion oder Spritz-Lymphknoten, und wählen Sie den entsprechenden Knoten für die Bildgebung. Der Artikel von Van den Broeck et al., Beschreibt die Lage und Morphologie der murinen Lymphknoten in detail 3. In diesem Video zeigen wir, das Ausschneiden von sechs großen peripheren Lymphknoten, die sich für Zell-Isolierung oder Bildgebung. b. Lymphknoten-Entfernung: Denken Sie daran, die Integrität des Gewebes beim Entfernen Lymphknoten. Achten Sie darauf, nicht zum Bruch der Kapsel oder in irgendeiner Weise Schaden den Lymphknoten Struktur. Der Verlust der Lymphknoten strukturelle Integrität beeinträchtigt die experimentieren. Falls notwendig, entfernen Sie Fett aus den Lymphknoten Oberfläche mit feinen Zerlegung (# 5 Dumont) Pinzette unter einem Binokular. Lymphknoten sollten keine verbleibende Fett auf der Oberfläche des Knotens, da dies Bildgebung durch Streuung des Lichts im Dunkeln. Proper Exzision von Lymphknoten ist auch eine wichtige Technik, um vor dem ersten realen Experiment Praxis. 3. Lymph Node Imaging-Setup und Überlegungen Die Lymphknoten sollte die Bildgebung der Bühne, die in diesem Fall aus einem vertieften Kammer gesichert werden. Erwärmt, Sauerstoff-perfundierten Medien wird in die Kammer von einer Seite mit einer Schlauchpumpe und Durchlauferhitzer gepumpt, und es tritt über eine nach unten abgestufte Kanal in einen Sammelraum mit einer Vakuumröhre zu einer Sammelstelle Kolben. In unserem System ist die Lymphknoten in 37 ° C getaucht Medien und mit medizinischem Carbogen (5% CO 2, 95% O 2) super-perfundiert. Die Temperatur der Perfusion Medien sollten möglichst nahe an den Lymphknoten erfasst werden, wie es möglich ist. Ihr spezielles System kann verlangen, Variationen in den Medien Durchfluss und Bühnenbild an das Mikroskop Bühne und Ziel unterzubringen. a. Lymphknoten Imaging-Setup: Wie in dem Video zu sehen, sichern wir die Lymphknoten, indem Sie zuerst Anbringen es, medulläre-Seite nach unten (auf Bild T-oder B-Zell-Zonen mit einem aufrechten Mikroskop), um eine Kunststoff-Deckglas, zugeschnitten auf die entsprechende Größe. Es ist wichtig, eine ungiftige Gewebekleber (wir verwenden VetBond ™ von 3M Corporation) zu verwenden. Das Deckglas wird in der strömenden Medien, indem Sie einen kleinen Klecks Silikonfett an der Unterseite des Deckglases gesichert, dann haften diese auf das Glas Basis der bildgebenden Kammer. b. 2-Photonen-Imaging-Überlegungen: Mehrere Faktoren können dazu führen Lymphozyten nicht mehr bewegt: Temperatur zu hoch oder zu niedrig ist; mehr Laserleistung, Kompression oder andere Schäden an den Lymphknoten, und der Mangel an Sauerstoff. Schäden durch übermäßige Laserleistung oder Temperaturen&gt; ~ 39 ° C ist irreversibel. Wenn Zellen dim sind, ist es normalerweise besser, den Detektor zu gewinnen oder die Zell-Kennzeichnung Protokoll anstatt mit einem höheren Laserleistung, um Zellen zu visualisieren zu erhöhen. Optimierung der Kennzeichnung oder die Expression von fluoreszierenden Proteinen erforderlich, um die Fluoreszenz über dem Niveau des Hintergrund-Autofluoreszenz zu bringen. Mit angemessenen Gewinn-und Laser-Energie-Einstellungen, etwa zwei-log Verschiebung der Fluoreszenz über dem Ausgangswert (gemessen mittels Durchflusszytometrie) ist sinnvoll für die Zell-Visualisierung. Mit abstimmbaren Zwei-Photonen-Laser, sollte die Wellenlänge für die Anregung verwendet werden etwas weniger als das Doppelte der Single-Photonen-Anregung des Fluorophors wird abgebildet. In Zwei-Photonen-Experimente mit mehr als einem Etikett oder fluoreszierende Protein kann es notwendig sein, zu experimentieren mit der Anregungswellenlänge verwendet werden, um die optimalen Einstellungen für beide Labels zu finden. Zwei-Photonen-Anregung kann auch zu Bild endogene Kollagen-Strukturen unter Ausnutzung der inneren blauen Erzeugung der zweiten Harmonischen verwendet werden. Second Harmonic Generation (SHG) liegt vor, wenn zwei Photonen innerhalb eines Materials kombiniert und emittieren ein einzelnes Photon mit der doppelten Frequenz des ursprünglichen Photonen. Im Gewebe tritt Zwei-Photonen-Anregung, wenn das einfallende Laserlicht senkrecht zu einer hoch geordneten Proteinstruktur wie Kollagen. Praktische Fragen der Zwei-Photonen-Imaging wurden in der Vorschau ansehen 4, 5 diskutiert.

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	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

In diesem Video-Protokoll zeigen wir die Verfahren für Adoptiv-Zell-Transfer und Lymphknoten isoliert und die Vorbereitung für bildgebende Lymphozyten Motilität in einem peripheren Lymphknoten erforderlich. Zwei-Photonen-Imaging hat mehrere Vorteile gegenüber konfokale Bildgebung in beiden explantierten Gewebe (hier abgebildet) und in intravital Vorbereitungen. Insbesondere von Infrarot-Anregung verwenden minimiert Streulicht und erlaubt die Abbildung ~ 300 Mikrometer unter der Kapsel des Lymphknotens und tiefer in einigen Geweben 4. Darüber hinaus ist Multi-Photonen-Anregung, um den Brennpunkt des Objektivs begrenzt und minimiert Foto Bleich-und Gewebeschäden aus Seite der Fokalebene. Wie bei jeder neuen Technik ist jedoch, Zwei-Photonen-Imaging kein Allheilmittel und ihre Grenzen und mögliche Fallstricke zu beachten 5 gehalten werden. Unter diesen ist die Forderung, dass - mit Ausnahme intrinsische Signale wie Erzeugung der zweiten Harmonischen von Kollagen-Zellen von Interesse sind fluoreszierend durch extrinsische Sonden oder durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen markiert werden. Der Eindruck ist so angelegt, dass diese markierten Zellen werden in einem schwarzen Leere schwimmen, während in Wahrheit sind sie in getaucht, und die Interaktion mit einem komplexen Umfeld von Strukturelementen und unzähligen anderen unbeschrifteten, unsichtbare Zellen. In den sechs Jahren seit Einführung der Zwei-Photonen-Imaging zur Immunologie, hat diese Technik Forschern erlaubt, langjährige Fragen direkt Visualisierung in intakten lebenden Geweben Prozesse einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, Zell-Motilität und Lokalisierung, zelluläre Signalwege und zytotoxische Zelladresse Töten Veranstaltungen. Das Feld hat sich schnell über den anfänglichen phänomenologischen Beschreibungen entwickelt und quantitative Analysen zusammen mit Computer-Modellierung und Simulation beginnen jetzt zu spüren, wie die scheinbar chaotische zelluläre Bewegungen und Interaktionen in Lymphknoten führen zu einer effizienten Immunantwort zu machen. Dieser Fortschritt ist umfassend in einer kürzlich erschienenen Publikation 1, der über 100 Papiere beschreiben die Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie für immunoimaging Listen überprüft.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

Zwei-Photonen-Imaging hat eine elegante Choreographie von Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und bei der Initiierung einer Immunantwort 1 zeigte. Hier präsentieren wir Methoden zur adoptiven Transfer von markierten T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten als erste in 2002 2 beschrieben. Zwei-Photonen-Imaging von Immunzellen setzt voraus, dass die Zellen fluoreszierend markiert sind, entweder durch Färbung mit einer Zelle tracker Farbstoff oder die Expression eines fluoreszierenden Proteins. Wir zeigen die adoptiven Transfer Verfahren der Injektion von Zellen vom Spender-Mäusen in die Schwanzvene eines Empfängers Tier, wo sie die Heimat von lymphatischen Organen innerhalb von ca. 15-30 min. Abgeleitete Wir zeigen die Isolierung von einem Lymphknoten und beschreiben Methoden, um die ordnungsgemäße Montage der herausgeschnittenen Lymphknoten zu gewährleisten. Andere Überlegungen wie die korrekte Sauerstoffversorgung des perfundierten Medien, Temperatur und Laserleistung werden diskutiert. Schließlich präsentieren wir 3D-Videobilder von naiven CD4 + T-Zellen präsentiert steady state Motilität bei 37 ° C.

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Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

46.1K Aufrufe.  University of California, Irvine (UCI).  Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten. 

Serie: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Forschung

Biologie

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Eine Methode zur 2-Photonen-Imaging der Blutfluss in den Neocortex durch ein Cranial Fenster

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...