Die Autoren bedanken sich bei Lonza Walkersville für ihre Hilfe bei geschlossenen System Wissen, Beutel-Design, Darlehen in Höhe von bag Versiegelungen und Schweißer sowie die Schaffung der Tasche, um HyperStack Schaltpläne danken.

1. HyperStack Schiff - gasdurchlässige Material Technology Hintergrund <ol><li> Die HyperStack Schiff ist eine mehrschichtige Gefäß für geschlossenes System Kultivierung von Zellen, die auf den Gasaustausch setzt durch eine 76.2micron gasdurchlässige Polymerfilm für den Zellstoffwechsel. </li><li> Die HyperStack Schiff unterscheidet sich von traditionellen Zellkulturgefäße, dass es keinen &quot;Headspace&quot; über den Zellen im Inneren des Schiffes. Anstatt mit diesem &quot;Headspace&quot; für den Gasaustausch innerhalb des Gefäßes, die gasdurchlässige Produkte Lufträume (bezeichnet als &quot;Luftröhre&quot; Leerzeichen) unter jeder Kultur Kammer, die zur Atmosphäre offen ist. </li><li> Das tracheale Raum ermöglicht die wachsenden Zellen in jeder Zellkultur-Fach des Schiffes entspricht Gasaustausch haben. </li><li> Das Gas durchlässige Folie ermöglicht Gasaustausch stattfinden und gleichzeitig eine sterile Umgebung. Alle Flüssigkeit Manipulationen für jede der mehreren Schichten entstehen durch einen einzigen Eintrag Port. </li></ol> 2. HyperStack Schiff Component Summary <ol><li> Die Stackette ist die individuelle Zellkultur-Fach, das sich aus der oberen Platte und Gas durchlässige Folie hergestellt wird. Die Zellen werden in diesem Kompartiment kultiviert. </li><li> Das Liquid Manifold verbindet jeder der 12 stackette Schichten zusammen innerhalb eines HyperStack Modul. Die Module sind mit Schläuchen verbunden Schiffe in Vielfachen von 12 Schichten bilden. Die vielfältigen erlaubt dem Benutzer, ein Fluid Manipulation auf das gesamte Schiff zu machen. </li><li> Der Luftverteiler verbindet auch die stackette Schichten zusammen, aber es verwendet, um Luft aus dem Behälter zu verdrängen, wenn die Flüssigkeit Ergänzungen auftreten. Es enthält eine Markierung für den Einsatz während der Befüllung. </li><li> Die Tracheal Raum ist die Freifläche zwischen den einzelnen stackette Schicht, so dass der Gasaustausch durch jede Schicht &quot;Gas-durchlässige Folie auftreten. </li><li> Die Liquid-Handling-Schlauch wird die Flüssigkeit Verteiler verbunden und dient dazu, alle geschlossenen System Fluid-Manipulationen zu machen. Diese Komponente kann angepasst werden. </li><li> Die Vent-Schlauch wird an die Luft Verteiler verbunden, enthält einen Luftfilter, und wird verwendet, um überschüssige Luft freisetzt und gleichzeitig Aufrechterhaltung der Sterilität. </li><li> Die Jagd Schlauch hat einen Filter und klemmen und mit dem Liquid-Handling-Schlauch verbunden und werden verwendet, um die Flüssigkeit aus dem Liquid-Handling-Schlauch nach dem Befüllen des Behälters zu evakuieren. </li><li> Die Corning-Stack Manipulator oder CSM ist ein Handhabungsgerät bei der Platzierung der Schiffe in die richtigen Positionen während des Einsatzes zu unterstützen. </li><li> Die Füllung Wedge ist ein Edelstahl-Unterstützung verwendet werden, wenn manuellen Befüllen der HyperStack Schiffe. </li></ol> 3. Gas Diffusion Ergebnisse durch gasdurchlässige Film in der HyperStack eingesetzten Schiffe <ol><li> In der traditionellen Zellwachstum Systeme mit innenbelüfteten Kopfraum wird der Sauerstoff in den Medien um durchschnittlich 50% über 3 Tage in Kultur erschöpft. (Abbildung 1) </li><li> In der gleichen Zelle Wachstum-System wird der Sauerstoff-Gradienten in einem nur 3mm Höhe von Medien fast 50% mehr an die Medien, Kopfraum Kreuzung, als es an der Zellschicht. (Abbildung 2) </li><li> Die Diffusion von Sauerstoff durch die 76.2micron gasdurchlässige Polystyrol Film ist gleich der Diffusion durch 2.6mm von Medien. Das Gas durchlässige Folie in der HyperStack Schiffe eingesetzt ermöglicht den Gasaustausch an der Zellschicht auftreten. </li><li> Die% des Sauerstoffs in der Luftröhre Raum des HyperStack Schiffe konstant bleibt, wie Zellen bis zur Konfluenz wachsen. (Abbildung 3) </li></ol> 4. Medien Bag Vorbereitung <ol><li> Die HyperStack-12-Schicht Schiff nimmt 1.3L der Medien und der HyperStack-36-Schicht Schiff nimmt 3.9L von Medien. </li><li> Vor Beimpfung Ihrer eingesackt Medien, wenn Serum verwendet werden soll, schweißen Rohr das Serum Tasche, um die Medien Tasche und gründlich mischen. </li><li> Clamp off etwa 300 ml von Medien in der Tasche mit großen Sackklemmen. Dies wird sicherstellen, dass alle inokulierten Zellen während der Befüllung und keiner in den Medien Tasche verbleibenden verwendet werden. Legen Sie die Medien Tasche auf Tasche stehen. </li></ol> 5. Impfen Medien <ol><li> Füllen Sie eine Spritze mit Schlauch mit Zellsuspension befestigt. Rohr schweißen 3 / 16 &quot;Schlauch aus einer Spritze mit Zellsuspension zu den Medien Tasche. </li><li> Inject der Zellsuspension in die Media-Tasche und gut mischen. </li></ol> 6. Füllen Procedure <ol><li> Rohr schweißen die beimpfte Medien Tasche, um die HyperStack Schiffes 3 / 8 &quot;Liquid-Handling-Schlauch. (Mit sterilen Verbindet oder Multipurpose verbindet (MPL), können Sie auch legen die Medien Tasche, um das Schiff). </li><li> Schließen Sie die Klemmen auf der Liquid-Handling-und jagen Rohre auf der HyperStack. </li><li> Legen Sie die HyperStack 36 Layer-Schiff in das CSM in der Last Position; Haken der Entlüftungsfilter Schlauch in die Halteklammer auf der CSM. Ziehen Sie den Deckel ab und bewegen Sie den CSM, um die Füllung Position. Indem das Schiff in die richtige Position zu füllen, die Luft-Filter ist nun in die höchste Position, um die Benetzung während füllen Betrieb zu verhindern. Die 10 °-Winkel ermöglicht equilibrATION der Flüssigkeit, um die Schichten während der Befüllung. Die HyperStack-12-Schicht Schiff auf seiner Seite auf dem Füllkeil gelegt wird in die richtige Position für die Abfüllung. </li><li> Klare Luft von der Füllhöhe durch die Positionierung der Tasche auf dem gleichen Niveau wie die HyperStack Gefäß (nicht höher). Keeping the chase Schlauchklemme geschlossen; öffnen Sie das Liquid-Handling-Schlauchklemme und Medien Tasche Klemme an Flüssigkeit ermöglichen, das Schiff betreten. </li><li> Mit der Tasche stehen, erhöhen die Medien Tasche, um die Zellsuspension fließen in das Schiff zu helfen. </li><li> Füllen Sie den Behälter, bis die alle geimpft Medien betritt das Schiff, das 300 ml Medien sollten noch in den oberen Teil der Medien Tasche bleiben. Entfernen Sie die Klammer aus den Medien Tasche, um weiterhin Befüllen des Behälters. Als flüssige Ansätze der oberen Luft-Verteiler, verlangsamen die Füllrate durch eine Senkung der Medien Tasche, um Überfüllung zu vermeiden. Langsam bringen den Flüssigkeitsstand auf die Markierung und klemmen Sie die Liquid-Handling-Schlauch. </li></ol> 7. Isolation Vorgehensweise, um Flüssigkeit in der Ebenen-Sperre <ol><li> Bringen Sie die HyperStack Schiff in der CSM für die Isolierung so zu positionieren, beide Arten von Verteilern in die höchste Position und senken Sie die Medien Tasche unterhalb der Höhe des Schiffes. Die HyperStack-12-Schicht Schiffes können in die Isolation Position, indem sie eine Hand an der Seite des Schiffes und mit dem anderen auf die Füllkeil Lift angehoben werden. </li><li> Mit der Jagd-Filter in einer aufrechten Position gehalten wird, öffnen die Jagd Schlauchklemme. Dies wird leer oder jagen die Medien in der Liquid-Handling-Rohr wieder in den Medien Tasche. Sobald der Schlauch leer ist, schließen Sie die Klemme an die Medien bag Schlauch. </li><li> Keeping the chase Schlauchfilter in einer aufrechten Position, öffnen Sie die Klemme an der Liquid-Handling-Rohr auf der HyperStack, damit alle verbleibenden Flüssigkeit zu betreten und in das Gefäß ins Gleichgewicht. Warten Sie 1-2 Minuten für diese auftreten. </li><li> Drehen Sie den HyperStack Schiff in der CSM, so dass die Verteiler auf der linken Seite. Senken Sie den Behälter, um die Last Position auf dem CSM. Rocking the HYPEStack-12-Schicht Schiff leicht nach links wird die Beseitigung der die Füllung Keil. Schließen Sie die Klemmen auf beiden die Verfolgung auf und Liquid-Handling-Schlauch. </li><li> Die Medien Beutel kann nun aus dem Gefäß entfernt werden oder es kann für den Einsatz befestigt später in der Ernte Verfahren bleiben. So speichern Sie das beigefügte Medien Tasche, rollen Sie die leere Tasche und alle übrigen Medien in der Tasche, und unter der Haltebänder in der Ablage der HyperStack Schiff. </li><li> Bewegen Sie den HyperStack Schiff in den Inkubator. Bei der Durchführung des Schiffes ist darauf zu halten, vom Betreten des Belüftungsfilter Flüssigkeit sein. Dies wird durch Kippen der vielfältigen Ende des HyperStack leicht nach oben erreicht. </li></ol> 8. Ernte-Protokoll <ol><li> Zu Beginn der Ernte Verfahren, schweißen Rohr der Zelle Dissoziationslösung und Quench Beutel zusammen, um die Ernte Tasche zu bilden. Sicherstellen, dass alle Schlauchklemmen geschlossen sind. (Verwenden Karikatur zu zeigen) </li><li> Entfernen HyperStack Schiff aus dem Inkubator, lassen Sie die Medien Tasche unter der Haltebänder und hänge auf der Tasche stehen. Legen Sie das Schiff in der CSM in der Last Position und ziehen Sie den Deckel auf das Gefäß zu sichern. Haken Sie die Entlüftung Schlauch in die Halteklammer und bewegen Sie den CSM, um die Füllung Position. </li><li> Sicherstellen, dass die Medien Tasche auf der Tasche stand hängt niedriger als die HyperStack; öffnen Sie die Klemme an die Medien bag Schlauch und das Schiff ist Liquid-Handling-Schlauch, damit Medien in der beiliegenden Tasche fließen. </li><li> Sobald das Schiff geht ¾ leer, ändern Sie die CSM-Einstellungen, um die endgültige Position leer. Wenn die HyperStack Schiff und Liquid-Handling-Schläuche leer sind, heben Sie den Schlauch an den Medien vorbei die Klemme an der verbrauchten Medien bag Schlauch jagen, dann schließen Sie die Klemme an der Liquid-Handling-Schläuche und die Klemme an der verbrauchten Medien bag Schlauch. </li><li> Ersetzen Sie die verbrauchte Medien Tasche mit der Ernte Tasche Montage von Rohr Schweißen und erhöhen die Höhe der Zelle Dissoziation Tasche Montage über die Höhe des HyperStack mit der Tasche stehen. </li><li> Setzen Sie den CSM in der Äquilibrierung Position. Öffnen Sie die Zelle Dissoziationslösung Schlauchklemme und die Lösung in die HyperStack. Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie die Klemmen auf der Liquid-Handling-Schläuche und die Zelle Dissoziationslösung Schlauch. </li><li> Bringen CSM, um die Last Position. Durch das Halten der horizontalen Positionierung Hebel öffnen, schaukeln das Schiff hin und her mit dem Rad, Verteilen der Lösung in den Zellschichten. Das Schiff kann gelegentlich zu den Ausgleich Position beim Wippen auf eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu halten zurückgegeben werden. Es kann nicht visuell erkennbar, dass die Schichten völlig überzogen sind, aber die Dissoziation Lösung wird gleichmäßig über die Oberfläche der Zellen verteilt werden. Sobald die Lösung angemessen verteilt wurden, lassen Sie den Hebel auf der CSM die HyperStack in der Last seiner Position einrasten. Verlassen Sie die HyperStack in dieser Positionwährend der notwendigen Dissoziation Zeit für Ihre Zellen. </li><li> Sobald die Zellen abgelöst haben, mit Trübung als Leitfaden, bewegen Sie den CSM zur Equilibrierung Position. Es sollte darauf geachtet werden, dass über verdauen die Zellen sein. Öffnen Sie die stillen Tasche Klemme und die HyperStack Liquid-Handling-Schlauchklemme, damit die stillen Medien in das Gefäß geben. Schließen Sie die Klemme an der HyperStack Liquid-Handling-Schlauch, wenn die Übertragung abgeschlossen ist. </li><li> Senden Sie das CSM, um die Last Position und halten Sie die horizontale Positionierung Hebel, um das Schiff seitlich Felsen. </li><li> Mit der Tasche stehen, senken Sie die Position der Ernte Tasche Montage unter dem Niveau des HyperStack. Passen Sie die CSM auf die leere Stelle, öffnen Sie das Gefäß Liquid-Handling-Schlauchklemme und übertragen Sie die Zelle Lösung wieder in die stillen Tasche. Senden Sie das CSM, um die Last Position und trennen Sie die Ernte Tasche Montage aus dem Behälter mit einem Schlauch Versiegelung. Die Zell-Lösung zur Verarbeitung bereit ist. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse <ul><li> Erntezeit muss optimiert bei der Umwandlung von einer Standard-Polystyrol-Oberfläche, um das Gas durchlässig Polystyrol-Oberfläche sein. Zellen neigen dazu, schneller Freisetzung auf der HyperStack Produkt. </li><li> Um Zellen unter dem Mikroskop die Lüftungs-und Liquid-Handling-Schlauch muss abgeklemmt werden. Legen Sie die HyperStack Schiff auf den Kopf, mit dem Verteiler nach unten, auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Prävention Schritte unternommen werden können, um zu vermeiden Benetzung der Filter während des Gebrauchs, die dazu führen sie nicht mehr funktioniert werden. Mit nicht mehr als Füllung der HyperStack Schiff und halten die Luft jagen und Schläuche erhöht, wenn die Klemmen offen sind, sollten keine Benetzung auftreten. </li><li> Der Druck der geschlossenen Klammern an den Schlauch verursacht es geschlossen bleiben, nachdem die Klammern geöffnet werden. Kneifen Sie den Schlauch in die entgegengesetzte Richtung zu öffnen. </li><li> Medien Fließzeit Ein-und Aussteigen HyperStack Schiff via Schwerkraft ist auf dem Medium Höhenunterschied zwischen der obersten Ebene der Medien in der HyperStack Schiff und die oberste Ebene der Medien in den Medien Behälter. Der größere Abstand ist, desto schneller fließen. Der maximale Durchfluss wird durch die Bewertung der Filter 1.5L/min begrenzt. </li><li> Ausreichender Füllvolumen in der HyperStack Schiff wird verhindern, dass Luft Blasenbildung in das Zellwachstum Kammern. Luftblasen können entstehen durch Stichproben oder Inkubation in einem unhumidified Umwelt durch Wasserverlust durch Verdunstung. Die Probenahme Menge und Häufigkeit sowie Inkubationsbedingungen wird entscheiden, ob zusätzliche Flüssigkeit durch den Endbenutzer hinzugefügt werden sollte. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Oxygen Depletion von Medien in einem Standard-Zellkulturschale. Die Abbildung zeigt die Abnahme in mg / L Sauerstoff auf der Ebene der Zellen über 3 Tage. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Oxygen Gradienten in den Medien in einer Standard-Zellkulturschale. Die Abbildung zeigt die mg / l Sauerstoff am größten ist die Medien-Headspace-Kreuzung als an der Zellschicht. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Sauerstoffanteil in der Luftröhre Raum des HyperStack während des Zellwachstums. Die Abbildung zeigt, dass mehr als 96 Stunden ist der Anteil von Sauerstoff zwischen den Schichten, die jeweils gasdurchlässigen Folie unten liefert, konstant bleibt. Dies demonstriert die Fähigkeit der Zellen mit Sauerstoff während des Wachstums den Zugang zur Konfluenz.

7745209: Die HyperStack Schiff gasdurchlässige Technologie wird unter US-Patent # abgedeckt. Die Autoren sind Mitarbeiter von Corning Life Sciences, Inc, dass das Instrument in diesem Artikel verwendet produziert.

HyperStack Schiff erfolgreich gewachsen entwickelt, Primär-und Stammzellen. Fluid-Ergänzungen in den Behälter müssen über aseptische Beutel Verbindungen wurden durch Schwerkraft und auch durch Pumpen aus einem sterilen Medien Behälter geleitet. Das Schiff bietet eine mehr als das 2,5 fache Erhöhung der Wachstumsbereich im Vergleich zu einem Plattenstapelzellen Produkt der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Die HyperStack-12 ist mit 6.000 cm 2 Wachstumsbereich, der HyperStack-36, 18.000 cm 2 Wachstumsbereich, und das HyperStack-120 hat 60.000 cm 2 der Wachstumsbereich. Durch Vergrößerung der Oberfläche, werden die Benutzer in der Lage, mehr Zellen aus der gleichen Zellpopulation oder viel zu schaffen und Variabilität. Sie sind auch in der Lage, Raum und / oder Arbeit mit weniger Schiffe auf der gleichen Zelle Output zu erzielen, oder erhöhen Messsignaländerung ohne Zusatz von Menschen, Reinraum-Suiten oder Inkubatoren zu speichern. Das System ist mit niedrigen Partikel-Montageverfahren und ohne die Verwendung von Klebstoffen hergestellt. Es ist ein geschlossenes System, mit Schlauch und Filtern, dreifach verpackt und steril geliefert vormontiert ist.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

Großvolumige adhärente Zellkultur wird derzeit standardisiert Plattenstapelzellen Zellwachstum Produkte, wenn Mikroträger Perlen sind nicht die optimale Wahl. HyperStack Schiffe ermöglichen geschlossenes System Scale-up aus dem aktuellen Plattenstapelzellen Produkte und liefert&gt; das 2,5 fache mehr Zellen in der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Die HyperStack Schiffe Funktion über gasdurchlässige Material, das den Gasaustausch stattfinden kann, daher entfällt die Notwendigkeit für die interne Kopfraum innerhalb eines Gefäßes. Die Beseitigung der Kopfraum ermöglicht das Fach, wo das Zellwachstum tritt minimiert werden, um Platz zu reduzieren, so dass mehrere Schichten des Zellwachstums Fläche innerhalb der gleichen volumetrischen Fußabdruck. Für viele Anwendungen wie z. B. Zelltherapie oder zur Herstellung von Impfstoffen, ist ein geschlossenes System für das Zellwachstum und die Ernte benötigt. Die HyperStack Schiffes ermöglicht Zelle und Reagenz Hinzufügen und Entfernen über Schläuche aus Medien Säcken oder anderen Methoden. Dieses Protokoll wird erklärt, die Technologie hinter dem Gas-durchlässigen Material in der HyperStack Schiffe, Gasdiffusion Ergebnisse verwendet, um die metabolischen Bedürfnisse von Zellen, geschlossenes System Zellwachstum Protokolle und verschiedene Ernteverfahren gerecht zu werden.

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Eine Einführung in die Technologie, das Protokoll und die Handhabung der Corning HyperStack Schiffe und Zubehör für High-Yield-adhärente Zellkultur verwendet. Das Protokoll wird zeigen, wie man das geschlossene System Schiffe zur Erhöhung der Zellernte über aktuelle Plattenstapelzellen Produkte zu verwenden.

Closed System Cell Culture Protocol Mit HyperStack Schiffe mit gasdurchlässigen Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Aufrufe.  Corning Life Science. Eine Einführung in die Technologie, das Protokoll und die Handhabung der Corning HyperStack Schiffe und Zubehör für High-Yield-adhärente Zellkultur verwendet. Das Protokoll wird zeigen, wie man das geschlossene System Schiffe zur Erhöhung der Zellernte über aktuelle Plattenstapelzellen Produkte zu verwenden.

Serie: Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principles of ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Forschung

Biologie

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Engineering zellpermeablen Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Eine Stoff Screening Verfahren für die Glucocorticoid-Signalisierung mit einem Zebrafisch-Larve Luciferase-Reportersystems

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Die Entdeckung und Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen Protein-Funktion Mit HaloTag Technologie

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...