Diese Arbeit wurde durch Fördermittel aus dem Undergraduate Research Opportunities Program an der UCI (AR und SP) und Zuschüsse aus dem US-Bundesstaat Kalifornien Alzheimer-Initiative und die National Institutes of Health Grant No unterstützt. HD38466 und Alzheimer Research Center keinen Zuschuss. AG16573 (JB)

1. Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Blocks Materialvorbereitung <ol><li> Bereiten 1X Hanks Salzlösung (HBSS) durch Verdünnung mit 10X-Stammlösung in sterilem Wasser (1:9). Shop HBSS bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie 10% DMSO Einfriermedium durch Verdünnen DMSO in HBSS (1:9). Das Einfriermedium sollte frisch zubereitet werden, bevor die Kryokonservierung und Lagerung bei 4 ° C bis gekühlt. </li><li> Ein Stahl Rasierklinge ist für die systematische Zerkleinerung von Gewebe verwendet. Vor der Anwendung wird die Rasierklinge durch Eintauchen in 70% Ethanol für 2 h sterilisiert. Unmittelbar vor dem Gewebe Verarbeitung, spülen Sie die Rasierklinge mit sterilem Wasser 3-mal. Vermeiden Sie den Rasierer in sterilem Wasser für eine übermäßige Menge an Zeit, da sie anfällig für Oxidation ist. </li><li> Ein Nalgene Gefrierbehälter ist mit Kryoröhrchen (2,5 ml) geladen und brachte dann in eine sterile biologische Schrank. 1 ml gekühltem Einfriermedium ist jedem Fläschchen gegeben. Das Einfrieren Container wird dann bei 4 ° C für mindestens 2 Stunden platziert. </li></ol> Reinigung, Schneidebrett und Gefrieren <ol><li> Das Hirngewebe eingefroren werden ist der meningealen Membran und Blutgefäße zu reinigen. Verwenden Sie sterile Nadel Tipps sorgfältig entfernen Schmutz aus dem Gewebe während der Arbeit auf der einen Eisbeutel. Gereinigt Gewebe sollte leicht mit kaltem HBSS gespült werden und in eine neue Petrischale für das Hacken. </li><li> Arbeiten auf der einen Eisbeutel, verwenden Sie eine sterilisierte Rasierklinge schnell hacken das Gewebe in etwa 1 mm 3 Blocks. Arbeiten mit kleinen Portionen von gereinigten Gewebe in einer Zeit, führt zu einer besseren Kontrolle über die Hacken Verfahren, wodurch eine gleichmäßigere Blockgrößen. </li><li> Langsam gehackte Gewebe in 50 ml HBSS in einem 50 mL konischen Rohr. Vorsichtig spülen Sie die Petrischale mit HBSS, um alle verbleibenden Gewebes Blöcke zu sammeln. Lassen Sie das Gewebe Blöcke an den Boden des Röhrchens hinab, die Schaffung eines lockeren Gewebe blockieren Pellet. </li><li> Während das Gewebe Absetzen bringen die zuvor gekühlt Gefrierbehälter und Kryoröhrchen in die biologische Sicherheitswerkbank. Uncap alle Kryoröhrchen, um den Prozess des Hinzufügens Gewebe zu beschleunigen. </li><li> Nach all dem Gewebe blockiert niedergelassen haben, vorsichtig aspirieren das überschüssige HBSS, so dass eine sehr dünne Schicht von Medien über dem Pellet. Zentrifugation wird abgeraten, da es dafür sorgt, das Gewebe Blöcke aneinander haften, deutlich vermindert Einfrieren Effizienz. </li><li> Langsam sammeln 200 ul von der Unterseite des lockeren Gewebes Block Pellet mit Pipettenspitze mit breiten Öffnungen (Cut-Spitze mit einer sterilen Schere). Das Material in einem Kryoröhrchen und ziehen weiter zum nächsten, wieder sammeln Gewebe von der Unterseite der Pellets. Es ist wichtig, dass das gesamte Gewebe Vergabeverfahren dauert nicht länger als 3-4 min pro Gefrierbehälter. Dadurch wird sichergestellt, dass das Gewebe zu DMSO ist nur für eine kurze Zeit vor dem Einfrieren ausgesetzt. Nach der Übertragung des Gewebes auf den Fläschchen, platzieren Sie den Gefrierbehälter in a-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 4 Stunden. Alternativ kann das Einfrieren Behälter über Nacht bei -80 ° C belassen werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle verbleibenden Gefrierbehältern. </li><li> Übertragen Sie die Kryoröhrchen aus dem Einfrieren Behälter (s) zu einem Kryoboxen und in einen flüssigen Stickstoff-Tank für eine langfristige Lagerung. </li></ol> 2. Auftauen und Kultivierung von Frozen Rindengewebe Blocks Materialvorbereitung <ol><li> Einen Tag vor dem Auftauen Gewebeproben, Poly-L-Lysin beschichteten Petrischalen / Deckgläser sind vorbereitet. Im Allgemeinen ist für kortikalen Neuronen bereiten wir beschichtete Platten mit 500 pg / mL bzw. 1 mg / mL. Fügen Sie genug Poly-L-Lysin-Lösung (made in Boratpuffer) zur Deckung der Boden der Schale. Wenn Deckgläser erforderlich sind, sicherzustellen, dass sie vollständig unter dem Poly-L-Lysin-Lösung getaucht. Inkubieren für mindestens 12 Stunden. Vor dem Gebrauch gründlich die Gerichte mit einer liberalen Menge steriles Wasser 3-mal, jeweils 5 min. </li><li> Warm HBSS wird verwendet, um aufgetaute Gewebe sowie Gewebe in Zellsuspensionen distanzieren reinigen. Das Volumen der HBSS benötigt wird hängt von der Menge an Gewebe aufgetaut werden, aber in der Regel 1-Kryoröhrchen werden in 50 ml HBSS verdünnt und wird in 10 ml HBSS dissoziiert. </li><li> Dulbecco Modified Eagle Medium mit 10% Eisen-ergänzt bovinem Kälberserum (EBS) und 1% Antibiotikum / Antimykotikum (AA)-Gemisch (DMEM (++)) sollten in einem 37 ° C Wasserbad gestellt werden. </li><li> Plating-Medium (NB (+++)) sollte frisch vor Gebrauch werden. Dieses Medium wird durch Zugabe von 1% Antibiotikum / Antimykotikum sowie B27 und N2 Ergänzungen vorbereitet. </li></ol> Hinweis: Media Namen mit Kreuzen (+) angehängt zeigen die Zugabe von Additiven an der Basis Zusammensetzung der Medien. In diesem Text, DMEM (+ +) bezeichnet DMEM plus 10% EBS plus 1% AA, während NB (+++) bezeichnet NB pluns 1% AA plus B27 und N2. Auftauen und Kultivierung <ol><li> Entfernen Sie die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank und schnell bei 37 ° C auftauen in einem Wasserbad, bis nur noch ein kleines Eis Pellet wird im Inneren der Flasche Inhalt beobachtet. </li><li> Gently Transfer der Flasche Inhalt 50 ml warmem HBSS in einem konischen Rohr. Verwenden Sie eine breite Öffnung Spitze vorsichtig entfernen verbleibende Gewebe Blöcke in der Kryoröhrchen stecken. Das Röhrchen 3-4 mal und lassen das Gewebe langsam am Boden sammeln. Tissue sollte schnell einleben, aber wenn die Blöcke zu klein sind kann dies nicht eintreten und leichte Zentrifugation (~ 200 x g) wird empfohlen. </li><li> Absaugen überschüssigen HBSS. </li><li> Fügen Sie 10 ml warmes HBSS auf das Gewebe Pellet und 300 ul von 0,25% Trypsin und 50 ul DNAase. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 5 min, dann in einem Orbitalschüttler auf 80 rpm und 37 ° C für weitere 5 min. </li><li> Nach Ablauf dieser Frist, bringen das Gewebe Blöcke in einem biologischen Sicherheitsschrank und Verwendung einer 10 ml Pipette vorsichtig rühren das Gewebe blockiert, bis eine trübe Zellsuspension gebildet wird. Deaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 10 ml warmes DMEM (+ +) zur Zellsuspension. </li><li> Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 1200 x g für 5 min. Absaugen und den Überstand verwerfen, Zellpellet in 10 ml warmes DMEM (+ +) und zu quantifizieren Zellzahl mit einer Zählkammer. </li><li> Platte Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichtete Platten. Typischerweise wird eine 60-mm-Schale mit 1x10 6 Zellen plattiert werden. </li><li> Lassen Sie die Zellen, die Schüssel / Deckgläser für ca. 1 Stunde in der Gewebekultur-Inkubator legen. Es wird empfohlen, den Fortschritt der Anlage in einer Platte Monitor alle 10 min bis gute Anbindung zu beobachten ist. Dann vorsichtig ersetzen das Medium durch frisches DMEM (++). </li><li> Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das DMEM (+ +) mit warmem NB (+++). Teilweise Medium ändert (50%) werden alle 5 Tage mit frischem NB (+++). durchgeführt Gesunde Kulturen in der Regel Anzeichen von Differenzierung und Wachstum von Prozessen nach 24 Stunden. Unter diesen Bedingungen und darstellende teilweise Medium wechselt alle 4-5 Tage, können die Kulturen für längere Zeit bis zu 4-6 Wochen beibehalten werden. </li><li> Für die Erzeugung von neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), ist ein ähnliches Protokoll mit der Ausnahme, dass nach der Zentrifugation, DMEM ohne EBS verwendet wird. Die Zellen werden in T-25 Flaschen in DMEM/F12 (1:3) mit B27 und EGF (20 ng / mL) ergänzt, um die Bildung von neuropheres ermöglichen überzogen. Zur Unterscheidung NPCs sind Neurosphären auf Laminin (10 ug / ml) beschichtete Deckgläser in DMEM/F12 (1:3)-Medium mit N2 ausplattiert. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Gesunde Kulturen wird ein deutliches Wachstum und die Differenzierung nach 5 Tagen nach dem Auftauen zu zeigen und wird in der Regel in ihrem Wachstum zu stabilisieren um 10 Tage (Abbildung 1). Immuncocytochemical Färbung dieser Kulturen offenbart zahlreiche Astrozyten (Abbildung 2A) und Neuronen (Abbildung 2B) für die Ratte und Mensch primären neuronalen Kulturen. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Erzeugung von NPCs als frei schwebende Neurosphären (Abbildung 3A), die unter differenzierenden Bedingungen führen zu einer hohen Qualität Mischkulturen (Abb. 3B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Zellkulturen von gefrorenen menschlichen kortikalen Gewebe. Gefrorene menschlichen kortikalen Gewebe blockiert werden aufgetaut und auf Poly-Lysin beschichtete Deckgläschen ausplattiert und für 10 Tage angewachsen. Am Tag 5 Zellen Expansion ist offensichtlich und von Tag 10 Konfluenz erreicht ist. Maßstab: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Immunzytochemische Färbung von Zellkulturen. (A) Die Kulturen wurden mit der glialen Marker sauren Gliafaserproteins (GFAP, dicke Pfeile) gefärbt. (B) Neurone wurden mit dem neuronalen Marker beta-Tubulin-III (TIII, dünne Pfeile) erkannt werden. (C) von Ratte und Mensch Kulturen zeigen reichlich Gliazellen und Neuronen nach 10 Tagen in Kultur. Primäre Antikörper: Maus-anti-GFAP (1:1000) und Kaninchen-Anti-TIII (1:1000). Sekundäre Antikörper: anti-Maus-Alexa 594 (1:500) und Anti-Kaninchen Alexa 488 (1:500). Kerne Färbung: Hoestch blau (1:1000). Maßstab: 50 pm. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Generierung von Neurosphären. (A) Gefrierschnitte wurde wie oben beschrieben und darf als Neurosphären vermehren. (B) Neurosphären wurden auf Deckgläschen unter differenzierenden Bedingungen vernickelt gewachsen und für 10 Tage, was in den Zellen die Migration weg von der Neurosphäre. (C) Beide Neuronen und Astrozyten sind in den expandierenden Rande eines differenzierenden Neurosphäre. Nuclear Gegenfärbung, primäre und sekundäre Antikörper, wie in Abb. 2 verwendet.

<ol>
	<li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+brain+tissue.">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li><li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells.">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li><li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells.">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li><li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium.">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li></ol>

Kryokonservierung bietet die Möglichkeit, Bank kostbaren Gehirn Gewebeproben für eine spätere Verwendung. Hier beschreiben wir eine einfache, aber effektive Protokoll sowohl Neuron-angereicherten Kulturen und neuronale Vorläuferzellen aus gefrorenem Hirngewebe Blöcke zu generieren. Dieses wirtschaftliche Verfahren vermeidet die Kosten der traditionellen Kryokonservierungstechniken, die teurer Rate-kontrollierten Tiefkühltruhen zu nutzen. Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung von lebensfähigen neuronalen Kulturen post-Auftauen, indem sie eine schnelle, aber effektive Mittel, um Gewebe-Blöcke einfrieren. Die gesamte Einfrieren Prozess kann so wenig wie 20 Minuten. Neben primären neuronalen Kulturen, kann mit dieser Methode Gewebeblöcke auch aufgetaut NPCs als frei schwimmende Neurosphären gewachsen zu generieren. In dieser Hinsicht stellt der Mangel an Serum in unserer Einfriermedium, dass die Zellen in einem undifferenzierten Zustand erhalten bleiben. Unter differenzierenden Bedingungen produziert Neurosphären aus gefrorenem Gewebe zeigen Expansion und Differenzierung Preise sehr vergleichbar Neurosphären aus frischem Gewebe erzeugt.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995-073</td>
<td>High gluclose 1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine calf serum supplemented</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HYCLONE</td>
<td>SH30072.03</td>
<td>For culture medium </td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1088-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502-048</td>
<td>Supplement for Neurobasal medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro </td>
<td>25-054CI </td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4527-30KU</td>
<td>Tissue dissociation</td>
</tr>
<tr>
<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14065</td>
<td>Cleaning tissue, washes, and freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine- 500mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P2636</td>
<td>Substrate for adhesion of neuronal cells</td>
</tr>
<tr>
<td>antibiotic-antimycotic (100X), liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240-062</td>
<td>To prevent contamination</td>
</tr>
<tr>
<td>Large orifice pipette Tips (1-200 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>02-681-141</td>
<td>To prevent shear stress to cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated pipette tips (101-1000 ul)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1111-2721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>21 G1 precision guide needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>305165</td>
<td>To clean tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>10 ml pipette </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1071-0810</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>926-9-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single edge razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Smith Brand</td>
<td>67-0238</td>
<td>To chop tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>100 x 15 mm polystyrene petri dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0010</td>
<td>For cleaning tissue</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryogenic box </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5026-1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Freezing container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5100-0001</td>
<td>"Mr. Frosty"</td>
</tr>
<tr>
<td>2.0 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NALGENE Labware</td>
<td>5012-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol 200 proof</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E7023</td>
<td>For sterilizing razor blade</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures

In dieser Studie skizzieren wir ein standardisiertes Protokoll für die erfolgreiche Kryokonservierung und Auftauen der kortikalen Hirngewebe Blöcke zu hoch angereicherten neuronalen Kulturen zu generieren. Aus diesem Protokoll das Einfrieren Medium verwendet wird 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) in Buffered Salz Hanks Solution (HBSS) verdünnt. Blocks der kortikalen Gewebe sind Kryoröhrchen mit dem Einfrieren Medium überführt und langsam bei -1 ° C / min in einer Rate-kontrollierten Einfrieren Behälter eingefroren. Post-Tau-Verarbeitung und Dissoziation von gefrorenen Gewebe-Blöcke konsequent produziert neuronalen angereicherte Kulturen, die eine schnelle neuritischen Wachstum in den ersten 5 Tagen in Kultur und wesentliche Erweiterung des neuronalen Netzwerks ausgestellt innerhalb von 10 Tagen. Immunzytochemische Färbung mit den Astrozyten-Marker sauren Gliafaserproteins (GFAP) und die neuronalen Marker beta-Tubulin-Klasse III zeigte eine hohe Zahl von Neuronen und Astrozyten in den Kulturen. Generierung von neuralen Vorläuferzellen Zellkulturen nach Gewebe blockieren Dissoziation führte rasch expandierenden Neurosphären, die eine große Anzahl von Neuronen und Astrozyten differenzieren unter Bedingungen hergestellt. Diese einfache Kryokonservierung Protokoll ermöglicht die schnelle, effiziente und kostengünstige Erhaltung der kortikalen Hirngewebe Blöcke, die mehr Flexibilität für die spätere Generation von neuronalen, Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen gewährt.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures at JoVE.com

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Kryokonservierung und Auftauen der kortikalen Hirngewebe Blöcke zu hoch angereicherten neuronalen Kulturen zu generieren. Dieses einfache Protokoll bietet Flexibilität für die spätere Generation von neuronalen, Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen.

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

cryopreservation-cortical-tissue-blocks-for-generation-highly

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Aufrufe.  University of California, Irvine. Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Kryokonservierung und Auftauen der kortikalen Hirngewebe Blöcke zu hoch angereicherten neuronalen Kulturen zu generieren. Dieses einfache Protokoll bietet Flexibilität für die spätere Generation von neuronalen, Astrozyten und neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen.

Serie: Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Ein vollautomatisiertes und vielseitig verwendbares System zum Testen von Multi-kognitiven Funktionen und Aufnahme neuronaler Aktivitäten bei Nagetieren

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen