Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt R01-HL70393 und R01-NS060706 zu JCJC unterstützt ist Professor für Biomedizinische Technik an der Spencer T. Olin Endowment.

1. Die Injektion von mRNA in Oozyten <ol><li> Inject von 0,05 bis 50 ng Boten-RNA, die in vitro in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) mit Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond Scientific Company, Modell 3-000-204) transkribiert wurde. Wiederholen Sie die Injektion auf ein Dutzend Eizellen für jede mRNA. </li><li> Spülen Sie den injizierten Oozyten zweimal mit ND-96-Lösung (96 mM Natriumchlorid (NaCl, Herr 58,44 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, Herr 74,56 g / mol), 1,8 mM Calciumchlorid (CaCl 2 • 2H 2 O Herr 147,02), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, Herr 203,31 g / mol), 5 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, Herr 238,31 g / mol), 2,5 mM Natriumpyruvat (Herr 110,04 g / mol) und 1x Penicillin-Streptomycin. pH 7,6), dann legen Sie sie in einer Kultur Platte und inkubieren bei 18 ° C für 2 + Tage. </li></ol> 2. Vorbereitung der Perfusion System <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Illustration der Automatisierung ValveLink 16 Perfusion System. Die Perfusion System nutzt unter Druck Stickstoff zu Perfusionslösungen Push-out der Lösung Stauseen, durch die Infusionsschläuche, und die Durchblutung Bleistift und Trinkgeld. Der Durchfluss der einzelnen Streams von Perfusionslösung wird von einem Reservoir-Ventil und eine elektronische Ventil gesteuert. In diesem Protokoll ist eines der Reservoirs nicht unter Druck und fungiert als Abfallsammler sowie eine Druck-Auslösemechanismus. (Bild aus Hersteller-Website http://www.autom8.com angepasst) <ol><li> Verbinden Sie die Schläuche auf die Perfusion Bleistift. Schalten Sie das elektronische Ventilsteuerung und öffnen Sie die Elektronenröhren. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Schläuche und die Durchblutung Bleistift frei von Verstopfung und Luftblasen sind, drücken Sie deionisiertem Wasser (DI) durch jeden Schlauch mit einer Spritze mit deionisiertem Wasser gefüllt. </li><li> Verbinden Sie die Schläuche auf die Lösung Stauseen und öffnen Sie das Ventil der Gasflasche unter Druck stehendem Stickstoff anzuwenden. </li><li> Öffnen Sie das Reservoir-Ventil, um den Schlauch mit Reservoir-Lösung füllen. Flick das Reservoir-Ventil, um Luftblasen in der Lösung zu entfernen, wenn nötig. Schließen Sie das Ventil nach der Schlauch mit der Lösung gefüllt ist. </li><li> Füllen Sie die Perfusion Spitze mit Wasser und schrauben Sie ihn auf die Perfusion Bleistift. Achten Sie darauf, keine Blasen-Falle beim Anschließen der Spitze. </li><li> Fix die Perfusion mit Bleistift auf das Bad Stufe mit Knetmasse. Vergewissern Sie sich, die Durchblutung Spitze ist in der Badewanne Platz. Die Perfusion ist jetzt eingerichtet. </li><li> Add DI-Wasser in der Badewanne. Vergewissern Sie sich, die Durchblutung Spitze in das Wasser eingetaucht ist. </li><li> Testen Sie, dass jeder Perfusionslösung kommt aus dem Perfusion Tipp richtig. Schließen Sie das elektronische Ventil verbunden, um den Schlauch der Abfallsammler und öffnen das Ventil für eine Perfusionslösung zu einer Zeit (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 1 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;- tetraessigsäure (EGTA, M r 380,35 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol), Ca 2 eingestellt + oder Mg2 + ist es, gewünschten Konzentration zugegeben, wenn nötig). Unter dem Mikroskop beobachten, der Strahl der Perfusion Flüssigkeit aus der Perfusion Spitze. Schließen Sie das Ventil für die Perfusionslösung und öffnen das Ventil für die Abfallsammler. Die Perfusion Jet sollte fast verschwinden. Wiederholen Sie den gleichen Test für alle Perfusionslösungen. </li><li> Wenn Sie, dass alle Perfusionslösungen flow korrekt überprüft, ersetzen DI-Wasser in der Wanne mit Bad-Lösung (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol)) eingestellt. </li></ol> 3. Patch-Clamp- <ol><li> Recoat der Ag Aufnahme-Elektrode mit AgCl vor jedem Patch-Clamp-Sitzung. Entfernen Sie zunächst die Drahtelektrode aus dem Pipettenhalter und tauchen die Spitze der Hälfte der Drahtelektrode in einem Fläschchen mit frischem Bleichmittel für mindestens 15 Minuten. Diese Ablagerungen einer Schicht von AgCl auf den Draht. </li><li> Spülen Sie die Elektrode Draht mit deionisiertem Wasser und trocken tupfen. Installieren Sie dann die Ag / AgCl-Elektrode wieder in den Pipettenhalter. </li><li> Schließen Sie das Bad (Bezugs-) Elektrode zur headstage und legen Sie sie in das Bad. Dieser bereitet die Elektroden für die Aufzeichnung. </li><li> Jetzt für die Datenerfassung vorzubereiten. Schalten Sie den Computer und stecken Sie den Dongle in den Drucker-Port Ihres Computers. Die Hardware-Schlüssel muss gesteckt werden, damit Sie die Software zur Datenerfassung, die HEKA Impuls zu nutzen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) und starten HEKA Pulse. Laden Sie die Protokoll-Datei und stellen Sie die Konfigurationseinstellungen, wie die Stimulus-Skala. Das Ziel für die Anpassung der Konfigurationseinstellungen ist, um sicherzustellen, dass der Test Potenzial genau gleich der Befehl Potenzial ist. Dies bereitet den Datenerfassungsgeräten. </li><li> Bereiten Eizellen. Tauchen Sie die Eizelle in Stripping-Lösung (200 mM N-Methyl-D-glucamin (NMG, M r 195,22 g / mol), 200 mM Aspartat (keine K +) (M r 133,1 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl , M r 74,56 g / mol), 10 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N &#39;, N&#39;-tetraessigsäure (EGTA, M r 380,35 g / mol), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6 H 2 O, M r 203,31 g / mol), 10 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), ist pH auf 7,4 mit Natriumhydroxid eingestellt (NaOH, M r 40,0 g / mol) für 5 - 10 min. Das Strippen Lösung löst die Dotterhaut von der Plasmamembran, die es ermöglicht, die Dotterhaut Streifen macht. </li><li> Gently Streifen die Dotterhaut von der Eizelle mit zwei Pinzetten. Ein devitellinized Eizelle ist äußerst fragil und sollte daher verschoben werden so wenig wie nötig. </li><li> Die Pflege zu verhindern, daß die devitellinized Eizelle in die Luft oder Blasen, verwenden Sie eine Glaspipette mit genügend Lösung der Eizelle in das Bad übertragen gefüllt. Dieser bereitet die Eizelle für die Aufnahme. </li><li> Bereiten Sie Patch-Pipetten. Ziehen Sie die Glaspipetten nach dem Einlegen einer Glaskapillare (VWR International, Cat # 53432-921) in eine Sutter P-97 Flaming / Brown Micropipette Puller. Beachten Sie die Pipetten unter dem Mikroskop an der Spitze Form und Öffnung Durchmesser zu bestimmen. Der Öffnungsdurchmesser sollte 2-4 Mikrometer betragen. </li><li> Um kapazitive Strom während der Aufnahme zu reduzieren und eine glatte Spitze, Fell der Spitze mit Wachs zu gewährleisten und dann Feuer-polieren. </li><li> Füllen Sie die Pipettenspitze, indem Sie die Spitze der Pipette in die Pipette Lösung (140 mM Kaliumhydroxid (KOH, M r 56,1 g / mol), 20 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Säure (HEPES, M r 238,31 g / mol), 2 mM Kaliumchlorid (KCl, M r 74,56 g / mol), 2 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2 • 6H 2 O, M r 203,31 g / mol), ist pH-Wert auf 7,1-7,2 durch Methansulfonsäure eingestellt Säure (MeSO 3, M r 96,1 g / mol)) und Zeichnung der Kolben. Diese benetzt die Spitze. </li><li> Füllen Pipette 1 / 3 voll mit Pipette Lösung mit einer Spritze und setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter mit der Ag / AgCl-Elektrode im Inneren und Kontaktaufnahme mit der Pipette Lösung. Dies bereitet der Patch-Pipette. </li><li> Verbrauchsteuerpflichtige Inside-out-Patch von der Eizelle vorbereitet, finden die klare Kante Eizelle unter dem Mikroskop. Bewegen Sie den Patch-Pipette in der Nähe der Eizelle mit Manipulator. Notieren Sie die Seriennummer Widerstand der Pipette. Die ideale Serie Widerstand der Patch-Pipette wird zwischen 1-1,5 MOhm, wenn sie mit Pipette gefüllt und unter Wasser in Bad-Lösung. </li><li> Langsam schieben Sie die Pipette gegen die Eizelle, bis der Widerstand etwa verdoppelt. </li><li> Bewerben sanfte Saugwirkung auf die Membran durch den Mund durch ein Saugrohr, die den Pipettenhalter verbunden ist, bis ein Giga-Ohm-Siegel erhalten. Stabilisieren Sie den Patch, indem Sie am Spannung -30 mV für ein paar Minuten. </li><li> Um eine inside-out-Patch-, Verbrauchsteuer den Patch schnell drücken Sie die Pipette weiter in die Eizelle und dann vorsichtig herausziehen. </li><li> Die inside-out-Patch ist nun bereit zum Spannen. Bewegen Sie die Pipette hält die inside-out patch bis etwa 100 Mikrometer weg von der Öffnung der Perfusion Spitze. </li><li> Schließen Sie das elektronische Ventil für Abfälle sammeln und öffnen Sie das Reservoir-Ventil für die gewünschte Perfusionslösung </li><li> Starten Sie die Aufnahme Ströme über das Pflaster. Ändern Sie den Spannungs-und Perfusionslösungen wie gewünscht. </li><li> Wenn Sie die Aufnahme beendet ist, reinigen Sie die Infusionsschläuche, Bleistift und Spitze, indem Sie durch entionisiertes Wasser verstopft zu vermeiden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Bei der Herstellung von Eizellen für die Patch-Clamp, würde die 5-10 min Behandlung von Abbeizlösung die Dotterhaut von der Plasmamembran, die es ermöglicht Abziehen der Dotterhaut zu lösen. Die ideale Serie Widerstand der Patch-Pipette wird zwischen 1-1,5 MOhm, wenn sie mit Pipette gefüllt und unter Wasser in Bad-Lösung. Nachfolgend finden Sie eine repräsentative Aufnahme von Wildtyp-BK-Kanäle auf eine Eizelle Membran-Patch. Auf der linken Seite oben, zeigen die quadratische Wellen der Spannung an den patch - der zweite Schritt mit steigender Spannung von 50 mV bis 200 mV mit Schrittweite von 50 mV. Nachfolgend finden Sie die entsprechenden aktuellen Spuren, wenn die Perfusionslösung nominal 0 Ca 2 + (frei [Ca 2 +] liegt bei etwa 0,5 nm). Die inAnstieg der Stromamplitude bedeutet, dass die offene Wahrscheinlichkeit BK-Kanäle mit steigender Spannung. Auf der rechten Seite ist der gleiche Patch mit 1,0 uM Ca 2 + perfundiert, wenn sie mit der gleichen Spannung Protokoll angewendet. Die Stromamplitude erhöht mehr unter der gleichen Spannung, was darauf hinweist, dass die offene Wahrscheinlichkeit, mit [Ca 2 +] erhöht. <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="Abbildung 2" />

<ol>
	<li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes:+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels.">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pfl&#252;gers Arch. 407, 577-588 (1986).</li><li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maxi-K+(Ca),+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily.">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li><li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+cell+tuning.">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li><li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder.">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li><li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone.">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li><li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family.">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li><li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mg2++enhances+the+function+of+BK-type+Ca2+-activated+K++channels.">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li><li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+mechanism+of+BK+(Slo1)+channels:+so+near,+yet+so+far.">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li><li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conductance+Ca2+-activated+K++(BK)+channel:+activation+by+Ca2++and+voltage.">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li><li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K++channel.">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li><li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2+-dependent+activation+of+BK-type+mslo1.">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li><li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2++coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1.">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li><li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term={beta}+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia.">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li></ol>

Die Eizelle Ausdruck System ist ideal für elektrophysiologische Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen aufgrund der relativ niedrigen Hintergrund der endogenen Kanäle. Darüber hinaus, da es sich um eine vorübergehende Expression System ist, bietet es eine effiziente Methode zur Durchführung Mutagenesestudie dieser Kanäle. Es ist jedoch zu beachten, dass die Eizelle Expressionssystem anders als in Säugerzellen ist, so kann es Unterschiede in post-translationale Modifikation und Verknüpfung mit verschiedenen Untereinheiten werden. Darüber hinaus kann die Lipid-Konzentration zwischen den beiden Zellen, die den Kanal der funktionalen Eigenschaften beeinflussen können abweichen. Die Infusionsschläuche, Bleistift und Spitze sollte mit DI-Wasser gereinigt werden jedes Mal nach dem Experiment zu verstopfen vermeiden. Immer frische Bleiche, die Ag-Elektrode Draht zu behandeln, um sicherzustellen, dass es mit AgCl beschichtet ist, sonst die Aufnahme ungenau sein. Stellen Sie die Konfigurationseinstellungen für die Datenerfassung, so dass der Test Potenzial genau gleich der Befehl Potenzial ist. Es wäre hilfreich, damit der Patch-Pipetten sauber, so dass mit einem Deckel, um sie vor Schmutz und Feuer-polieren sie nur vor dem Gebrauch zu schützen.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion System and Electronic Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutoMate Scientific, Inc.</td>
<td>ValveLink 16</td>
<td>Inner diameter of perfusion tip: 100 microns</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>CKX31</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>AXOPATCH 200B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer Interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>INSTRUTECH Corporation</td>
<td>ITC-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>CV 203BU</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes

Das Protokoll hier vorgestellten soll die Aktivierung der großen Leitfähigkeit, Spannungs-und Ca 2 +-aktivierten K + (BK) Kanäle zu studieren. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um die Struktur-Funktions-Beziehung für andere Ionenkanäle und Neurotransmitter-Rezeptoren-1-Studie sein. BK-Kanäle sind weit verbreitet in verschiedenen Geweben exprimiert und haben in vielen physiologischen Funktionen, einschließlich der Regulierung der Kontraktion der glatten Muskulatur, Frequenzabstimmung von inneren Haarzellen und Regulierung der Freisetzung von Neurotransmittern 2-6 in Verbindung gebracht. BK-Kanäle werden durch Membran-Depolarisation und durch intrazelluläre Ca 2 + und Mg 2 + 6-9 aktiviert. Daher ist das Protokoll, mit dem sowohl die Membran-Spannung und die intrazelluläre Lösung zu kontrollieren. In diesem Protokoll wird Boten-RNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten (Stadium V-VI) von 2-5 Tagen Inkubation bei 18 ° C 10-13 gefolgt injiziert. Membrane Patches, die einzelne oder mehrere BK-Kanäle enthalten, werden mit der inside-out-Konfiguration mit Patch-Clamp-Techniken 10-13 herausgeschnitten. Die intrazellulären Seite der Patch mit der gewünschten Lösungen während der Aufnahme, so dass die Kanal-Aktivierung unter verschiedenen Bedingungen untersucht werden kann perfundiert. Zusammenfassend ist die mRNA von BK-Kanälen in Xenopus laevis Oozyten injiziert, um Kanal-Proteine ​​an der Eizelle Membran auszudrücken; Patch-Clamp-Techniken werden benutzt, um Ströme durch die Kanäle unter kontrollierten Spannung und intrazelluläre Lösungen aufnehmen.

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Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in Ausdruck<em&gt; Xenopus Oozyten</em&gt; Durch die Injektion von Boten-RNA. Die intrazelluläre Lösung während Patch Clamp Messungen wird durch eine Perfusion System gesteuert.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

20.9K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in Ausdruck Xenopus Oozyten Durch die Injektion von Boten-RNA. Die intrazelluläre Lösung während Patch Clamp Messungen wird durch eine Perfusion System gesteuert.

Serie: Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...