Mitral 07CVD04: Diese Forschung wird von der Hartwell-Stiftung, der American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) und der Stiftung Leducq unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Inkubieren fruchtbaren Wachtel oder Hühnereier zu Stufe 14 - (ca. 2 Tage) oder 25 (ca. 4,5 Tage) bei 60% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie sterile Earls Balanced Salt Solution (EBSS) <ol><li> Add 100 ml 10x EBSS zu 600 ml 18 MOhm Wasser </li><li> Add 2,2 g Natriumbicarbonat </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2 </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 1000 ml </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter </li></ol></li><li> Bereiten Sie sterile M199 Kulturmedium. <ol><li> Add 1 Packung M199 Pulver zu 700 ml 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 2,2 g Natriumbicarbonat </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Fügen Sie 10 ml (1%) Penicillin-Streptomycin </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 1000 ml </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter </li><li> 1 ml sterile 100X Insulin-Transferrin-Selen-G zu ergänzen </li><li> Fügen Sie 10 ml (1%) sterile Hühnerserum </li></ol></li><li> Bereiten dreidimensionalen Kollagen-Gelen bei einer Kollagen-Konzentration von 1,5 mg / mL. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass eine Kollagen-Konzentration von mehr als 1,5 mg / mL eine Matrix, die auch biomechanisch steif ist für die Zellen durch Umzug nach zur Verfügung stellt. Collagen-Gel-Konzentrationen unter 1,5 mg / mL haben so wenige Kollagenfasern, die die Zelle verklumpen die Fasern lokal shred, produziert eine Insel der Zellen. <ol><li> Fügen Sie die folgenden eiskalten Reagenzien in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen in dieser Reihenfolge: <ul><li> 3X M199: Volume = Gesamtvolumen notwendig / 3 </li><li> Sterile 18 MOhm Wasser: Volume = Gesamtvolumen notwendig (M199 Volumen + Hühnerserum Volumen + 0,1 M NaOH Volumen + Kollagen Volumen) </li><li> Sterile Hühnerserum: Volume = Gesamtvolumen notwendig * 0,01 </li><li> Rattenschwanz Kollagen I: Volume = (Kollagen-Gel-Konzentration * Volumen erforderlich) / Kollagen Lager Konzentration </li><li> Sterile 0,1 M NaOH: Volume = Kollagen Volumen * 0,2 Hinweis: Die Menge an Wasser, 0,1 M NaOH, und Kollagen aufgenommen wird je nach der Konzentration der Kollagen-Stammlösung. </li></ul></li><li> Mischen Sie die Kollagen-Lösung auch mit einer sterilen Pipette. </li><li> Sofortüberweisung 0,3 ml der Kollagen-Lösung in 1,9 cm 2 Wachstum Bereich Brunnen. Das ist genug Kollagenlösung vollständig decken die gut und zu einem Gel, das ca. 3 mm dick ist bereitzustellen. Ein Gel Dicke von mindestens 250 um, die für Zell-Invasion Studien. </li><li> Lassen Sie die Kollagen-Lösung zum Gel für mindestens 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2, und 100% Luftfeuchtigkeit. </li></ol></li></ol> 2. Pre-EMT Endocardial Zellisolation und Kultur <ol><li> Embryo isoliert <ol><li> Legen Sie ein Zoll langes Stück Labor Klebeband über das größere Ende des Eies. Hier wird die Luft-Zelle befindet. Das Band stabilisiert das fragile Wachtelei Shell. </li><li> Gently Punktion der abgeklebt Bereich der Eizelle in der Luft-Zelle mit der Spitze des sterilisiert gebogene Schere. </li><li> Schneiden Sie ein Loch in den abgeklebten Teil der Eier, die groß genug, damit das Eigelb passieren wird. Starten Sie das Loch an der Einstichstelle und schneiden nach außen in Form einer Spirale. Achten Sie darauf, durch die äußere Membran geschnitten, aber vermeiden piercing das Eigelb. </li><li> Wenn das Loch in der Schale abgeschlossen ist, visualisieren die Wachtel Embryo. Der Embryo wird in der Regel auf der Oberseite des Dotters liegt. </li><li> Beginnen Sie das Eigelb durch das Loch geschnitten in das Ei gießen mit einer Hand. Halten Sie ein # 55 Pinzette in der anderen Hand. Da der Embryo verlässt das Ei auf der Oberseite des Dotters, schieben Sie die Nr. 55 Pinzetten unter dem Embryo und entfernen Sie es aus dem Eigelb. Hinweis: Bei Hühnereiern, geht der Embryo isoliert Knacken des Hühnereis auf eine scharfe, saubere Oberfläche und bricht das Ei in eine 100 mm Petrischale. Der Embryo ist auf der Oberseite des Eigelbs befinden. Schieben Nr. 55 Pinzetten unter dem Embryo und entfernen Sie es aus dem Eigelb. </li><li> Setzen Sie den Embryo in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem, sterilen EBSS. </li></ol></li><li> Stufe die Embryonen nach den Kriterien der Hamburger und Hamilton 1. Embryonen im Stadium 14 - sind vorbei Stufe 13, aber noch nicht im Stadium 15, mit 20-21 Somiten und einem Schwanz Knospe. Ein wesentliches Merkmal der Stufe 14 - Embryonen ist der Kopf Winkel, der etwas größer ist als 90 °, um den Körper ist. </li><li> Entfernen Sie die Herzen von Wachteln Embryonen im Stadium 14 - mit Nr. 55 Pinzetten, indem quer, wo der AV-Kanal und OFT Kontakt mit der Brustwand. Legen Sie die Herzen zusammen auf einer Seite der Petrischale. </li><li> Sammeln Sie die isolierten Herzen mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in eine neue 100 mm-Petrischale mit sterilem, eiskaltem EBSS gefüllt. </li><html><li> Schneiden Sie die OFTs und AV Kanälen quer aus dem Ventrikel mit Nr. 55 Pinzetten. </li><li> Section der übrigen AV Kanäle und / oder Abfluss Traktate (OFTs) in Längsrichtung. </li><li> Set einer Pipette auf ein Volumen von 20 uL. Mit dieser Pipette absaugen zu sechs längs geschnitten AV Kanäle und OFTs. </li><li> Vertreibt die AV Kanäle und OFTs auf die Kollagen-Gel. Absaugen überschüssigen EBSS von der Oberfläche des Gels. </li><li> Verwenden Sie # 55 Pinzetten zur Ausrichtung der Explantate, so dass sie flach sind und so das Lumen Seitenflächen der Kollagen-Gel. Versuchen Sie nicht, Punktion der Kollagen-Gel mit der Pinzette. </li><li> Nach 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, entfernen Sie das Myokard von der Explantate mit Nr. 55 Pinzetten. Die endokardiale Zellen sollten hinter der Oberfläche des Kollagen-Gel gelassen werden. Alternativ kann der Herzmuskel auf dem Explantat gelassen werden. Mit dem Myokard entfernt, durchlaufen die endokardiale Zellen mit nicht EMT ohne Intervention. Mit dem Myokard stellen eine Teilmenge der Endokard-Zellen werden in Mesenchym zu verwandeln, aber der Grad der Transformation moduliert werden kann mit externen Faktoren. Hinweis: Auch wenn das Myokard auf gelassen werden, das Explantat muss eine Frist von mindestens 2 Stunden, um das Gel zu befestigen, bevor Medium zugegeben. </li><li> Fügen Sie 0,4 ml M199 Medium in jede Vertiefung mit Explantaten. </li><li> Kultur der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2, und 100% Luftfeuchtigkeit. </li></ol> 3. Post-EMT AV Cushion mesenchymalen Zellen Isolation und Kultur <ol><li> Crack the Hühnerei auf eine scharfe, saubere Oberfläche und brechen das Ei in eine 100 mm Petrischale. Der Embryo ist auf der Oberseite des Eigelbs befinden. Nehmen Sie den Embryo mit Nr. 5 Pinzette durch Greifen der Membranen um den Embryo und dann den Embryo in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem, sterilen EBSS gefüllt. </li><li> Stufe die Embryonen nach den Kriterien der Hamburger und Hamilton 1. Merkmale einer Stufe 25 Embryos sind ausgeprägte Ellenbogen-und Kniegelenke und leichte Auge Pigmentierung. </li><li> Isolieren Sie die Herzen von allen HH25 Embryonen und legen Sie die Herzen zusammen auf einer Seite der Petrischale. </li><li> Sammeln Sie die isolierten Herzen mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in eine neue 100 mm-Petrischale mit sterilem, eiskaltem EBSS gefüllt. </li><li> Isolieren Sie die AV Region aus allen Herzen auf einmal. Legen Sie die AVs zusammen auf einer Seite der Petrischale. Vorsichtig geschwenkt, die AV-Region für alle Blut, das die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen können, zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie die isoliert AVs mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in eine neue 100 mm-Petrischale mit sterilem, eiskaltem EBSS gefüllt. </li><li> Sequenziell isolieren die Kissen aus dem AV. Stellen Sie sicher, es gibt keine Myokard auf dem AV Kissen. </li><li> Sammeln Sie die isoliert Kissen mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Drehen Sie das Kissen auf den Boden der Zentrifugenröhrchen bei 15 xg für 3 Minuten. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 1000 mL Spitze, so viel von der EBSS Überstand wie möglich, ohne die Kissen zu entfernen. </li><li> 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA, die auf 37 vorgewärmten ° C. Lassen Sie das Kissen in Trypsin inkubiert, bis sie vollständig gelöst sind, ist in der Regel ca. 3-5 Minuten. </li><li> Add 100 L Hühnerserum die Zentrifugenröhrchen, um das Trypsin zu stillen. </li><li> Pellet die Zellen bei 160 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen, 1000 ul Spitze. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 2 ml M199 Medium und durch Pipettieren gründlich mischen. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellsuspension auf Zählkammer zählen und bestimmen die Gesamtzahl der Zellen, die isoliert wurden </li><li> Ermitteln Sie, wie viele Kollagengelen basierend auf der Anzahl der Zellen isoliert gemacht werden. Zellen müssen bei einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / ml mit einer 250 ul Gelvolumen beschichtet werden. </li><li> Pellet die Zellen bei 160 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen, 1000 ul Spitze. </li><li> Mit dem Protokoll aufgeführten, fügen 3X M199, Wasser-, Hühner-Serum, Kollagen und 0,1 M NaOH, in dieser Reihenfolge, um das Zellpellet. Mix von sanften Pipettieren. </li><li> Add 250 ul jeder 1,9 cm 2 Wachstum Gegend sehr gut. </li><li> Lassen Sie die Kollagen-Lösung zum Gel für mindestens 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2, und 100% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Fügen Sie 0,4 ml Kulturmedium und Inkubation über Nacht. </li><li> Um weiterhin die Kultivierung der Gele in stressfreien Bedingungen, befreien die Gele von den Seiten der Kultur und mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze. Mechanisch eingeschränkt Kulturen sind Gele, die auf die Seiten der Kultur verbunden bleiben gut. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1:. Beispiele von Embryonen (A) HH14-Wachtel Embryo, und (B) HH25 Hühnerembryo werden hier gezeigt. fig2.jpg &quot;alt =&quot; Bild 2 &quot;/&gt; Abbildung 2: HH14-Ventil endokardiale Explantate nach 2 Stunden der Kultur (A) mit dem Myokard vorhanden ist, oder (B) mit dem Myokard entfernt.. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3:. HH14-Ventil endokardiale Explantate (A) Mit dem Myokard präsentieren, haben viele der Zellen endokardiale mesenchymale Transformation und haben einen spindelförmigen, mesenchymalen Phänotyp nach 48 Stunden Kultur. (B) Wenn der Herzmuskel ist alles von den Zellen entfernt halten einen Pflasterstein-förmig, endokardiale Phänotyp nach 48 Stunden in Kultur. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4:. HH25 Ventil mesenchymalen Zellen in einem Kollagen-Gel Zellen werden sofort nach der Aussaat abgerundet. <img src="/files/ftp_upload/2159/2159fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5:. HH25 mesenchymalen Zellen in Kultur (A) Nach 48 Stunden Kultur in einem eingeschränkten Kollagengel der HH25 mesenchymalen Zellen beginnen sich zu verbreiten. (B) HH25 Zellen in einer stressfreien Kollagengel 7 Tage nach der Aussaat und 6 Tage nach der Befreiung habe das Gel auf ca. 50% der ursprünglichen Fläche verdichtet.

<ol>
	<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+A+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: A regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Biology. 95, 108-108 (1983).</li><li>Butcher, J. T., Norris, R. A., Hoffman, S., Mjaatvedt, C. H., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periostin+promotes+atrioventricular+mesenchyme+matrix+invasion+and+remodeling+mediated+by+integrin+signaling+through+Rho/PI+3-kinase.">Periostin promotes atrioventricular mesenchyme matrix invasion and remodeling mediated by integrin signaling through Rho/PI 3-kinase.</a> Developmental Biology. 302, 256-256 (2007).</li></ol>

Das Verfahren zur Isolierung von Zellen aus endokardiale Bühne HH14 - hearts ursprünglich von Runyan und Markwald entwickelt eine kontrollierte, in vitro Umgebung, um die Faktoren, und initiieren modulieren embryonalen EMT-2-Studie. HH14 - endokardiale Explantate ohne Myokard kultiviert wird nicht unterziehen EMT ohne biomechanische oder biochemische Intervention. Wenn der Herzmuskel auf dem Explantat linken Seite ist es Signal eine Teilmenge von endokardiale Zellen mesenchymale Transformation unterziehen, sondern externe Faktoren können diesen Prozess zu regulieren. Isolating embryonalen Vorläuferzellen mesenchymalen Zellen aus HH25 AV Ventil Kissen mit der Methode von Butcher et al. Beschrieben bietet die Möglichkeit zu bestimmen, welche Signale treiben Differenzierung nach reifen valvular interstitiellen Zellen 3. Die Kultivierung der Zellen in mechanisch beanspruchte oder Stress-freien Bedingungen erlaubt dem Forscher, biomechanische Reize Sonde, und Faktoren hinzugefügt, um das Kulturmedium können biochemische Signale liefern. In-vitro-Modellen, die zu entschlüsseln Mechanismen, die EMT, Zelldifferenzierung zu helfen, und strukturellen Umbau kann verwendet werden, um ein besseres Verständnis der Ursachen von angeborenen Herzfehlern und könnte dazu beitragen, Wege festzulegen, um Stammzellen zu reifen Ventil Zellphänotypen für das Tissue Engineering-Anwendungen zu fahren.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Extra fine Bonn scissors, curved</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14085-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #55</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>14098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile transfer pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Samco Scientific </td>
<td>2041S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile disposable filter units, PES, 0.2 &mu;m pore size membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>566-0020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 15 mL centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>25384-342</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>89097-920</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat-tail collagen I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Earl's Balanced Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc.</td>
<td>119-064-131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31100-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41400-045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chicken serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16110-082</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide solution, 1.0 N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S2770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lake Cumberland Game Bird Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fertile chicken eggs (Gallus gallus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cornell University Poultry Farm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells

Korrekte Ausbildung und Funktion der embryonalen Herzklappen ist entscheidend für Entwicklungsfortschritt. Die frühe embryonale Herz ist ein U-förmiges Rohr von Endokard von Myokard umgeben. Der Herzmuskel sondert kardiale Gelee, ein Hyaluronan reichen gallertartige Matrix, in die atrioventrikulären (AV)-Übergang und Ausflusstrakt (OFT) Lumen. Im Stadium HH14 valvulogenesis beginnt, wenn eine Teilmenge von endokardiale Zellen Signale aus dem Myokard zu erhalten, unterziehen endokardiale mesenchymale Transformation (EMT) und dringen in das Herz-Gelee. Im Stadium HH25 die Klappen Kissen sind vollständig mesenchymalized, und es ist dieses Mesenchym, die schließlich bildet die Herzklappen und septalen Apparat des Herzens. Das Verständnis der Mechanismen, und initiieren modulieren den Prozess der EMT und Zelldifferenzierung sind wegen ihrer Verbindung zu schweren angeborenen Herzfehlern wichtig. In dieser Studie präsentieren wir Methoden vor, EMT endokardiale und post-EMT mesenchymalen Zellen, die die beiden verschiedenen Zell-Phänotypen der prevalvular Kissen sind zu isolieren. Pre-EMT endokardiale Zellen können mit oder ohne den Herzmuskel gezüchtet werden. Post-EMT AV Kissen mesenchymalen Zellen können in mechanisch eingeschränkt oder Stress-free Kollagengelen kultiviert werden. Diese 3D-in vitro-Modelle zu imitieren Schlüssel valvular morphogenic Veranstaltungen und sind für die Dekonstruktion der Mechanismen der Früh-und Spätstadium valvulogenesis nützlich.

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Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Dieser Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Wachteln oder Huhn HH14<sup&gt; -</sup&gt; Ventil endokardiale Zellen und HH25 Ventil Kissen mesenchymalen Zellen.

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

isolation-and-culture-of-avian-embryonic-valvular-progenitor-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Aufrufe.  Cornell University. Dieser Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Wachteln oder Huhn HH14 - Ventil endokardiale Zellen und HH25 Ventil Kissen mesenchymalen Zellen.

Serie: Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Forschung

Biologie

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...