Wir danken unseren Mitarbeitern für die wertvolle Protein-Proben, die einige unserer Methoden bezogenen Erfahrungen und Beobachtungen beigetragen. Günther Schmalzing freundlicherweise die Möglichkeit, FR, dieses Projekt beizutreten. Barbara Armbruster, Jacob Brink und Deryck Mills sind bekannt für ihre hervorragende Hilfe und Eingang am Gerät dankte. Die Finanzierung wurde von NIH HL090630 zur Verfügung gestellt.

1. Grid Vorbereitung der 2D-Kristallisation Trials <ol><li> Carbon-beschichtete 400-Mesh-Kupfer EM Gitter sind durch negative Färbung vorbereitet. Uranylacetat wird häufig verwendet und bietet einen lang anhaltenden im Hinblick auf die Lagerung der Lösung Fleck für mehrere Monate vor dem Einsatz sowie die Eignung für die langfristige Speicherung von Grids. Im Gegensatz dazu benötigen andere negative Flecken wie Uranyl Formiat, bei gleichzeitig ausgezeichneter Färbung frisch hergestellt werden 1. Für die schnelle Herstellung einer großen Anzahl von Netzen, um für das Screening von 2D-Kristallisation Studien verwendet werden, ist eine modifizierte Version von negativen Färbung verwendet. Ein Volumen von 2 ul der Probe wird auf eine Kohlenstoff-bedeckten EM Gitter pipettiert und 60 s. Diese durch Blotten von der Kante mit einem zerrissenen Stück Whatman Nr. 4 Filterpapier (Abbildung 1; Video) gefolgt wird, und dann 2 ul 1% Uranylacetat werden sofort angewendet werden, die wiederum vertilgt von der Kante des Gitters nach 30 s. Durch Berühren des Rasters auf die Felge mit den zerrissenen Rand des Filterpapiers sorgt für eine optimale Entfernung von Flüssigkeit ohne Entfernung der Proteoliposomen. Darüber hinaus sorgt Trocknen an der Kante des Gitters verbessert Erhaltung des Kohlenstoff-Film. Es muss in der Vorbereitung und Abwicklung der Netze getroffen werden, zB Bruch der empfindlichen Carbon Folie verhindert Probe Haftung und kann in eine ungenaue Darstellung der Probe führen. Während traditionell größere Probenvolumina von 5 ul wurden und werden routinemäßig für die Grid-Herstellung verwendet werden, können wertvolle Proben durch die Reduzierung der Lautstärke um 2 ul oder weniger 2 gespeichert werden. </li><li> Zur Herstellung der größtmöglichen Membranen erfordern einige unserer Proben hohe Konzentrationen von Glycerin oder Saccharose (10-20%) anwesend zu sein in der Dialyse-Puffer. Dies kann sich negativ auf die Grid-Erstellung, wie Glycerin oder Saccharose ist hochviskos und verhindert Uranylacetat aus richtig Eindringen in die Puffer, und damit unvollständig Färbung der Membranen. Folglich wird eine mögliche Gitter wird verdeckt werden. Entweder kann der Puffer durch Zentrifugation der Proben und Ersatz durch Glycerin / Saccharose-freiem Puffer (nicht dargestellt), oder die Netze ausgetauscht werden können mit Puffer oder Glycerin / Saccharose-freiem Puffer in einem bis zu mehreren Zyklen vor negativen Färbung ähnlich gewaschen werden eine Technik für die Kryo-EM 3,4 verwendet. </li></ol> 2. Die Beurteilung 2D-Kristallisation Trials durch EM <ol><li> Je nach Art des Probenhalters, sind entweder ein oder mehrere Gitter geladen. Eine Vergrößerung von 2-10K, die hier als Zwischenprodukt Vergrößerung bezeichnet werden, können für einen ersten Eindruck des durchschnittlichen Verteilung und den Umfang der Dispersion von Membranen, Morphologie und Größe, die Kenntnis der Laborjournal 5 aufgenommen ist. Geeignete Flächen sind als Vertreter Übersichten mit Hilfe einer CCD-Kamera aufgenommen oder, wenn eine CCD-Kamera zur Verfügung steht, auf dem Film. </li><li> Geringer Vergrößerung im Bereich von etwa 400-800x ist manchmal verwendet, wenn ein Überblick über die gesamte Probe / grid gewünscht ist. Zwar nicht mit jedem Netz eingesetzt, gibt geringer Vergrößerung wertvolle Informationen helfen bei der Auswertung des Grid Vorbereitung im Hinblick auf mehrere Aspekte: sowohl negative Färbung und potenziellen teilweisen Bruch der Kohlenstoff-Film, Probe die Konzentration auf das Gitter, und möglicherweise ungleichmäßige Verteilung proteoliposome. Individuelle Planquadrate könnte mit dem Fernglas oder CCD-Kamera betrachtet werden. Mit einigen EMs ist es möglich, Positionen von besonderem Interesse, die für die spätere Inspektion bei höheren Vergrößerungen abgerufen werden retten können. </li><li> Einmal im Netzgebiet von Interesse ist, und zwar geringe oder mittlere Vergrößerung identifiziert worden, ist die Vergrößerung auf ca. 50K-60K verändert. Je nach Membran, Kristall und Elementarzelle Größe, sofern bekannt, Vergrößerungen so niedrig wie 30K und so hoch wie 80K verwendet werden. Der Vergrößerungsbereich von 30-80K wird als hoher Vergrößerung für den Zweck des Screenings für 2D-Kristalle bezeichnet werden. Die Fokussierung erfolgt entweder in den Fokus Einstellung der low-dose-Setup, mit anschließender Umstellung auf Bild / Foto-Einstellung oder in der Nähe des Gebietes von Interesse. <ol class="lalpha"><li> In Fällen von Mehrdeutigkeit in, ob der Bereich von Interesse ist in der Tat eine Membran, wird die Probe für die Kohlenstoff-Film in der Größe der Proteoliposomen, Glimmer oder andere Artefakte untersucht. Zu diesem Zweck zeigen Kanten typischen Falten und Morphologie. </li><li> Jetzt den Bereich von Interesse ist mit einem CCD-Kamera inspiziert. Ein CCD-Bild wird in 30K-80K Vergrößerung gesammelt, je nach Größe Membran, Protein-oder Elementarzelle Größe oder bekannten kristallinen Bereich. Der Verband der kleineren und / oder überwiegend hydrophobe Membran-Protein ist nicht unbedingt sichtbar durch visuelle Beurteilung der CCD selbst. Entweder das gesamte Bild ist für eine Online-Fourier-Transformation (FT, oder schnelle FT-FFT) eingesetzt. Das FT enthält eine erhebliche Menge an Lärm, aber wenn die bestellte Array ist klein. So wird eine reduzierte boxed Bildgröße für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis eines smal ermöglichenler Kristall und leichteren Identifizierung. Zu diesem Zweck wird die Box über das Bild bewegen und eine Live-FT ausgewertet wird. Die Intensität / Helligkeit der Strahl so eingestellt halten low-dose Bedingungen für die Probe sowie CCD-Kamera-Einstellungen im Blick. Abhängig von der CCD-Kamera verwendet wird, ist das Gamma des Live-FT für eine optimale Identifizierung der bestellten Arrays angepasst. Eine zu hohe Wert kann obskuren Flecken durch Lärm Beiträge und eine zu niedrige Gamma-Wert wird schwächer Spots aus identifiziert zu verhindern. Diese schwache Flecken könnte durch kleinere kristalline Arrays mit Spots in der FT knapp über den Geräuschpegel. Während die Daten in einer höheren Auflösung hat sich von einer kleinen Anzahl von Proben 6 gesammelt wurden, ist häufig die Auflösung von negativ gefärbten 2D-Kristalle beschränkt oder sollte nicht zu erwarten, besser zu sein als etwa 15a Auflösung. Mit einem von ca. -400 nm defocus, nicht mehr als 1-3 Bestellungen von Spots sollen leicht identifiziert werden. Die Proben werden in der Regel nicht für die Auflösung ausgewertet, wie Kryo-EM-Datenerhebung wird eine korrekte Angabe der höchste erreichbare Auflösung geben. Schärfe der Spots und mögliche Mosaizität sind zwar zur Kenntnis genommen. </li></ol></li><li> Unterschiedliche Membranen sowie Membran Morphologien sind für Ordnung bei hoher Vergrößerung ausgewertet. Dies ist besonders kritisch zu Beginn oder Zwischenstufen von 2D-Kristallisation Studien als eher kleiner als größer Proteoliposomen oder Membranflecken der vielversprechendsten Bereiche enthalten kann. Sehr geringe Anteile der 2D-Kristalle benötigen Bildaufnahme und FT, oder optische Beugung, der eine große Anzahl von Bildern seit der erstmaligen Ermittlung der geordneten Strukturen häufig auf eine rasche Verbesserung der Größe und Qualität 2,4,7 führen wird. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Idealerweise bestellt Proteoliposomen Display leicht erkennbar, scharfe Flecken. Große und gut geordneten Kristalle sind leicht durch Online-FT von CCD-Aufnahmen oder optische Beugung von Aufnahmen identifiziert. Das Beispiel zeigt, 2D-Kristalle von einer kleinen Membran-Protein von 18kDa, die bis zu mehrere Mikrometer groß. Spots auf dem FT sind leicht zu erkennen und scharf. Die Bewegung der Live-FT-Box zeigt, dass das Gitter kontinuierlich ohne Mosaizität ist. Das Gitter eines größeren Proteins mit einer umfangreicheren löslichen Domäne kann auf dem kleinen Bildschirm des EM identifiziert werden. CCD-Sammlung und FT ist notwendig, um ein Mittel zur besseren Einschätzung geben und Informationen über zB möglich Mosaizität (zeige FT) zu gewinnen. Bei der Berechnung eines FT eines proteoliposome, die nicht bestellt ist, können Geräusche zunächst für Flecken verwechselt werden. Während das Feld für die Live-FT verschoben wird, jedoch werden die Flecken verschwinden. Auf der anderen Seite, kleine Arrays, mit fragwürdigen Kristallinität, haben ihre Plätze stationär bleibt, wenn die Live-FT sogar leicht über dem Bild bewegt. Darüber hinaus können diese kleinen Kristalle durch in der Regel mit der gleichen Einheit Zellgrößen anerkannt zu werden, und Entfernungen zwischen den Spots in verschiedenen FTs kann auf verschiedene Weise, wie mit einem Kreis von einer bestimmten Größe gemessen werden. Lipid-Kristalle zeigen eine deutliche Gitterstruktur Morphologie und FT. Es ist nicht ungewöhnlich, dass Niederschläge in ersten Versuchen begegnen. Hier Proteinfällung ohne Rekonstitution Bedürfnisse von kleinen Lipidaggregate aber unterschieden werden. Die Proben, die bei geringer Vergrößerung werden Ausscheidungen erscheinen häufig entpuppen sich Lipidaggregate werden, wenn bei höherer Vergrößerung betrachtet. Nach Inspektion bei 30-50K, zeigen die Ränder dieser dunklen Strukturen sie von Membranen ohne Fällung des Proteins zusammengesetzt sein. Dies sind wichtige Beobachtungen wie die Lipid-Aggregate können in der Größe zu großen Membranen in den folgenden Experimenten erhöht werden. Schlechte Ergebnisse bei der Auswertung Proben werden manchmal auf eine niedrige Membran-Konzentration, die richtige und schnelle Screening verhindert verbunden. Dies kann häufig mit der Verwendung einer höheren Protein-Konzentration für 2D-Kristallisation durch Dialyse überwunden werden. Alternativ können die Eihülle verlassen, um für ein paar Tage an der Unterseite der Eppendorf-Röhrchen während der Lagerung zu begleichen. In einigen Fällen schneller, oder fast sofortige Absetzen von Membranen erfolgt und Pipettieren aus dem Boden des Röhrchens wird in einer höheren Dichte Membran auf das Gitter führen. Ein weiterer viel schneller Option Zentrifugation (bei 3000-8000 Umdrehungen pro Minute für 1-3 Minuten) von Proben mit anschließender Entnahme aus dem Boden des Röhrchens. Die Proben unter optimalen Bedingungen enthält einen großen Prozentsatz von 2D-Kristallen. Es ist nicht notwendig, für ein homogenes Erscheinungsbild von Membranen Ziel, als das größte und gut geordneten 2D-Kristalle sind optisch für Daten ausgewählte Sammlung. Diese Arten von Proben werden leicht erkannt werden, wenn die Kristallisation Studien als auch bei den Proben für die verwendet werden, sind wiederholtKryo-EM-Datenerfassung, was zu einer maximalen Anzahl von hochauflösenden Bildern. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Diese Abbildung zeigt Blotting den Rand des Gitters mit einem zerrissenen Stück Whatman Nr. 4 Filterpapier.

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Proper Auswertung von Proben erfordert eine sorgfältige Beurteilung einer ausreichenden Anzahl von Membranen. Zum Beispiel gab Proben mit so niedrig wie 2% kristallinen Arrays aus über 180 abgebildet Proteoliposomen wichtige Informationen für die schnelle Optimierung von 2D-Kristallisation Bedingungen 7. Wenn Fällung des Proteins auftritt, könnte ein Gitter von der weiteren Screening nach der Inspektion bei geringer Vergrößerung aufgegeben werden, obwohl gelegentliche partielle Fällung von Protein auftritt. Selbst sehr kleine Membranen von weniger als 100 nm können hilfreiche Informationen über Um aber zu geben, und Parameter, um die 2D-Kristall Größe zunehmen kann in den folgenden Dialyse Experimente umgesetzt werden. Laboratories sind in den Prozess der Einführung verschiedene Grade der vielversprechenden Automatisierung in den Prozess der Screening 8,9. Doch Proben werden noch benötigt Schritte der Bewertung und die Kenntnis der 2D-Kristall Größe, Morphologie und Ordnung, wie hier beschrieben. In Zukunft könnte es möglich sein, Daten von immer kleineren 2D-Kristallen um eine höhere Auflösung zu analysieren, so dass diese Screening-Schritte und desto schwieriger Auswertung der kleineren kristallinen Bereiche noch kritischer.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Electron Kristallographie als eine Methode, die entweder alternativ oder in Kombination mit dreidimensionalen Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse zu Struktur-Funktions-Anfragen von Membranproteinen sowie lösliche Proteine ​​Studie verwendet werden entwickelt. Screening für die zweidimensionale (2D) Kristalle mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) ist der kritische Schritt bei der Suche, Optimierung und Auswahl Proben für hochauflösende Datenerfassung durch Kryo-EM. Hier beschreiben wir die grundlegenden Schritte bei der Identifizierung von großen und bestellt, als auch kleine 2D-Arrays, die potenziell liefern können wichtige Informationen zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen. Durch die Zusammenarbeit mit unterschiedlichen Vergrößerungen an der EM werden die Daten über eine Reihe von kritischen Parametern erhalten. Lower Vergrößerung liefert wertvolle Daten über die Morphologie und Membran Größe. Bei höheren Vergrößerungen sind möglich, um-und 2D-Kristall Dimensionen ermittelt. In diesem Zusammenhang wird beschrieben, wie CCD-Kameras und Online-Fourier-Transformationen bei höheren Vergrößerungen werden verwendet, um Proteoliposomen für Ordnung und Größe zu beurteilen. Während 2D-Kristalle von Membranproteinen am häufigsten durch Rekonstitution durch Dialyse gewachsen sind, ist die Screening-Technik gleichermaßen für Kristalle mit Hilfe von Monoschichten, native 2D-Kristalle hergestellt und Anordnungen von löslichen Proteinen. Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Methoden für das Screening für 2D-Kristalle von noch kleineren als auch größeren Membranproteine, wo kleinere Proteine ​​erfordern die gleiche Sorgfalt bei der Identifikation wie unsere Beispiele und das Gitter von größeren Proteinen könnte besser erkennbar sein in früheren Stadien des Screenings.

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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

assessing-two-dimensional-crystallization-trials-small-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  Georgia Institute of Technology. Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Serie: Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...