Wir danken Anthony J. Koleske, PhD für die Bereitstellung der YFP Mäusen.

Teil 1: MICROPRISMEN Optik und Mikroskop-Setup <ol><li> Die Mikroprismen wir benutzen, sind 1-mm, Winkel-Prismen aus BK7 Glas aus dem Optosigma Corporation (Abbildung 1) erworben haben. Mikroprismen behandelt werden mit einer Pinzette, wenn möglich. </li><li> Die Hypotenuse des Mikroprismas ist mit erhöhter Silber beschichtet, um eine Reflektivität von mehr als 97% von 400 liefern - 2000 nm. Dies bietet interne Reflexion sowohl der Laser-Anregung Licht und die emittierte Fluoreszenz. </li><li> Mikroprismen sind immer behandelt mit einer Pinzette, wenn möglich. Handschuhe sind zu allen Zeiten getragen zu halten das Prisma sauber. </li><li> Wir verwenden eine custom-built Zwei-Photonen-Mikroskop in der Lage Kleintier-Bildgebung. Das Tier, an der stereotaktischen Gerät basiert auf einem 3-Achsen motorisierten Bühne platziert. </li><li> Das Mikroskop ist auf einem Windows-PC läuft scanimage-Software verbunden. Scanimage ist Bildaufnahmesoftware in Matlab durch Pologruto et al 1 geschrieben. </li><li> Für Mikroprismenring Bildgebung, sammeln wir Bilder mit einer Auflösung von 1024 x 1024 oder 512 x 512 Pixel. Darüber hinaus haben wir in der Regel bei 2 ms / Zeile oder 4 ms / Zeile zu scannen. </li><li> Zwei Arten von Zielen werden in den Experimenten verwendet: <ul><li> Ein niedrigerer numerischer Apertur (NA) Luft Ziel für weite Feld-of-view-Tomographie (siehe Tabelle der Reagenzien und Geräte). </li><li> Eine höhere NA Luft-Objektiv mit einem Glas Korrektur Kragen Lage Minimierung sphärischer Aberrationen durch 0 induzierte - 2 mm aus Glas (siehe Tabelle der Reagenzien und Geräte). </li></ul></li><li> Wenn das Tier bereit für die Bildgebung unter einer niedrigen Vergrößerung Ziel ist, richten Sie den quadratischen Rastern Muster des Lasers mit der Spitze des Mikroprismas. Dies wird dazu beitragen orientieren das Bild und machen die effiziente Nutzung der Laserleistung. </li><li> Mit einem höheren NA-Objektiv mit einem Glas Korrektur Kragen, setzen Sie die Korrektur Kragen für etwa 1 mm von Glas zu korrigieren. Sobald ein fluoreszierendes Bild erscheint während des Experiments kann man sorgfältig im Innern des Mikroskops zu erreichen, um die Korrektur Kragen zu optimieren, um die Bildauflösung zu optimieren. </li></ol> Teil 2: Nicht-Überleben Tiere Chirurgie und MICROPRISMEN Insertion <ol><li> Die gesamte Prozedur Länge, vom ersten Schnitt bis zum Abschluss der Bildgebung, hängt von den Zielen des Experiments. Allerdings kann die Nicht-Überleben chirurgischen Eingriff und Mikroprismenring Platzierung erwartet, dass etwa 30 nehmen - 40 Minuten dauern. </li><li> Mäuse (P30-P60) werden gewogen und anästhesiert entsprechend mit einer IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) auf eine Ebene, geeignet für chirurgische Eingriffe. </li><li> Während des gesamten Experiments, sollte das Tier alle 15-20 Minuten auf das Niveau der Anästhesie zu beurteilen überprüft werden. Wenn das Tier reagiert auf einen festen Fuß-und Zuziehen, eine zusätzliche Dosis von Ketamin / Xylazin ist nicht erforderlich. Typischerweise wird eine zusätzliche Dosis von einem Drittel der ursprünglichen Dosis und kann vor der Zeit in eine Spritze für den sofortigen IP Injektion vorbereitet werden, wenn nötig. </li><li> Sobald die Maus richtig betäubt, ist die Mehrheit der Haare auf dem Kopf des Tieres aus mit einem Trimmer mit einem # 40 Klinge rasiert. </li><li> Nair ® ist es, die verbleibenden Haare auf dem Kopf, zum Aufbau einer Oberfläche frei von Haaren, die im Wege des Mikroprismas während der Bildgebung bekommen kann angewendet werden. Nach 5 Minuten wird die Nair ® off ​​mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen gereinigt. </li><li> Die narkotisierten Tier richtig in eine Maus stereotaktische Gerät platziert. Während des chirurgischen Eingriffen und Imaging-Sitzungen das Tier befindet sich auf einem mit Wasser gefüllten Heizkissen bei 36 Grad Celsius eingestellt gehalten. </li><li> Mit dem Kopf des Tieres richtig fixiert, ist eine saubere Schnitt erfolgt mit einem Skalpell auf der Mittellinie des Schädels, um die Haut zu trennen. </li><li> Eine kleine Menge von 3% Wasserstoffperoxid basiert auf einem Wattestäbchen Wattestäbchen platziert und auf den Schädel zu beseitigen Membranen zwischen dem Schädel und der Haut. </li><li> Das Wasserstoffperoxid hilft auch Bregma, ein Meilenstein in weiß, wo man die Kraniotomie durchführen und legen Sie die Mikroprismenring offenbaren. </li><li> Vor der Kraniotomie gestartet wird, werden die Ohren Bars und beißen bar richtig eingestellt, um die exponierte Schädel, so dass es im Grunde Ebene mit der Tabelle ist zu kippen. Dies bietet eine bessere Plattform für die Kraniotomie. Darüber hinaus macht das die Oberfläche des Prismas senkrecht mit dem eingehenden Anregungslicht. Dies wird dazu beitragen minimieren optische Aberrationen, während Bildgebung. </li><li> Eine kleine Zahn-Grat (~ 0,8 mm Kopfgröße) wird an einen Dremel ®-Tool mit Hilfe eines flexiblen Ausleger verbunden. Für Kraniotomien, setzen wir die Geschwindigkeit auf etwa 7.000 bis 10.000 rpms. </li><li> Die zahnärztliche Grat entlang des Schädels Magermilch, bis eine viereckige Nut in den Knochen hergestellt wird. Die Seiten des Quadrats sind ca. 2-3 mm in der Länge und zentriert 1,5 mm caudal und 1 mm lateral Bregma. </li><li> Continuing Ausdünnung der Knochen, bis eine kleine Öffnung durch den Schädel gemacht wird. Eine Pinzette ca.n Heben Sie den Knochendeckel vom Schädel. </li><li> Die Dura muss entfernt werden, bevor die Mikroprismen in die Rinde eingesetzt werden kann. Blutungen sind am besten, indem man das Blut an der Oberfläche für einige Minuten gerinnen gesteuert. Danach wird das geronnene Blut entfernt mit einem chirurgischen Schwamm vor dem Einsetzen der Mikroprismenring. </li><li> Um sie für die Unterstützung der Ausrichtung des Prismas mit der Hirnrinde, ist die vertikale Fläche des Mikroprismas up parallel an den Griffen an der Zange gefüttert. </li><li> Mit dem Prisma richtig gehalten wird, ist die gesamte Mikroprismenring eingeführt, bis die Spitze des Prismas ist bündig mit der Oberfläche Neokortex. </li><li> Wenn richtig eingesetzt, sollte die Mikroprismen in die richtige Position zu bleiben. Jede Blutung, die Ergebnisse ist minimal und kann mit einem kleinen chirurgischen Schwamm aufgenommen werden. Sobald das Prisma anstelle des Tieres ist bereit für die Bildgebung. </li><li> Nach einer Mikroprismenring hat in einem Tier verwendet wurde, kann es sein, mehrere Male wieder verwendet werden. Allerdings braucht es für richtig gereinigt werden, um alle verbleibenden biologischen Material zu entfernen. Dies kann durch Eintauchen des Prismas in einem kleinen Volumen HCl Säure, durch einen Sprung in Methanol erreicht werden. Das gereinigte Mikroprismenring können dann in der Linse Papier bis die zukünftige Verwendung gewickelt werden. </li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Die Bilder des rechten Winkels Mikroprismenring. Prismen in diesem Experiment verwendet werden einen Millimeter, BK7 Glasprismen mit einer verbesserten Silberschicht auf der Hypotenuse die interne Reflexion der Anregungs-und Emissions Licht zu ermöglichen. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Bild der Schicht V YFP Pyramidenneuronen. Weitfeld-of-view-Bildgebung mit der Mikroprismenring zeigt eine große Population von pyramidenförmigen Zellkörper ~ 800 bis 900 um tief aus der kortikalen Oberfläche. Darüber hinaus apikalen Dendriten sich bis zur Schicht kann ich auch gelöst werden. Maßstab = 200 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Eine höhere numerische Apertur Ziel in Verbindung mit dem Mikroprismenring bietet räumliche Auflösung ausreicht, um dendritischen Dornen auf der apikalen Dendriten auf der Schicht V Pyramidenneuronen lösen verwendet. Balken = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Ein Bild unter Verwendung des Mikroprismenring und einen Schwanz-Injektion von Fluoreszenzfarbstoff. Das Bild zeigt vertikale, großkalibrige Gefäße, die sich von tiefen Hirnregionen und kleineren Kapillaren abzweigen durch die kortikale Volumen. Maßstab = 200 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Mit einer höheren numerischen Apertur Ziel, kann das Netzwerk von Kapillaren in den Neocortex mit detaillierter abgebildet werden. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: Mikroprismen ermöglicht auch für die Bildgebung roten Blutkörperchen (Erythrozyten) fließen durch die Gefäße. Erythrozyten nicht absorbieren den Fluoreszenzfarbstoff und werden daher als dunkle Streifen auf dem Schiff gesehen. Durch Online-Scannen über das Schiff, bekommt man Messungen von RBC Fluss und die Geschwindigkeit. Balken = 10 um (horizontaler Balken oben und unten, Bild) und 250 ms (vertikaler Strich in Bild unten).

<ol>
	<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Yale University IACUC gesetzt durchgeführt.

Mit einem Mikroprismenring in einem bildgebenden Experiment ist relativ einfach und bietet viele Vorteile für in-vivo-Studien auf dem Neocortex. Repräsentative Beispiele mit dieser Technik gehören Bilder von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Schicht V kortikalen Neuronen übernommen. Mit Mikroprismen kann man sehen, eine Sammlung von großen Pyramidenzellen Zellkörper in Schicht V, fast 1 mm unterhalb der kortikalen Oberfläche. Ebenfalls zu sehen sind die apikalen Dendriten, dass durch all die oberflächlichen Schichten zu erweitern, bevor divergierenden in Büscheln (Bild 2). Die Mäuse für diese Experimente verwendet werden transgene Tiere entwickelt, um YFP nur in Schicht V Neuronen (YFP-H 2) zum Ausdruck bringen. Mit diesen YFP-H-Mäuse und eine höhere numerische Apertur Ziel mit einem Glas Korrektur Kragen ist es auch möglich, Bild der Dendriten mit mehr Details und lösen dendritischen Dornen (Abbildung 3). Man kann auch Etikett der kortikalen Blutgefäße mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie Fluorescein-Dextran mit etablierten tail-Vene Injektionstechniken. Typischerweise für erwachsenen Mäusen eine 100 ul Bolus-Injektion von Fluoreszein-Dextran bei 20 mg / ml in physiologischer Kochsalzlösung ist angemessen. Die besten Ergebnisse kommen aus einer Injektion des Farbstoffes nach der Mikroprismenring hat in den Neocortex eingefügt worden (nach Schritt 2,16). Mit dieser Technik kann man die größeren Kaliber Schiffe aus tiefen Schichten Erweiterung auf die pia und Abzweigung zum Netzwerk der Mikrokapillaren (Abbildung 4) zu bilden. Dieses komplizierte Netz von Mikrokapillaren in den Neocortex ist am besten geschätzt mit einer hohen numerischen Apertur Ziel (Abbildung 5). Darüber hinaus ist es möglich, roten Blutkörperchen Geschwindigkeit und Fluß von tiefen neokortikalen Kapillaren Maßnahme Line-Scan entlang der Länge eines Schiffes (Abbildung 6, rote Linie im oberen Bild). Da rote Blutkörperchen nicht nehmen den Fluoreszenzfarbstoff, werden sie als dunkle Streifen erscheinen. Bilder, die sich aus einer Zeilenkamera eine räumliche Dimension in einer Achse und eine zeitliche Dimension in den anderen Achsen (Abbildung 6, Bild unten) haben. Aus diesen Bildern kann man den Fluss und die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen durch die Kapillare zu berechnen. Im Falle der Abbildung 6 wurde die RBC Fluss gemessen bis 36 Erythrozyten / Sekunde mit einer Geschwindigkeit von 0,45 mm / Sekunde. Dies ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen aus der Literatur 3.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td>
<td>055-0010</td>
<td>With enhanced silver reflective coating-(R77)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescein-dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>FD70</td>
<td>70 kDa </td>
</tr>
<tr>
<td>0.28 NA, 4x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>XLFLUOR 4x/340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.60 NA, 40x air objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>LUCPLFLN</td>
<td>With 0-2 mm coverglass correction</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging of deep cortical layers using a microprism

Wir präsentieren ein Protokoll für die in-vivo-Bildgebung der kortikalen Gewebe mit einem tiefen bildgebenden Sonde in der Form eines Mikroprismenring. Mikroprismen sind 1-mm groß und haben eine reflektierende Beschichtung auf der Hypotenuse die interne Reflexion der Anregungs-und Emissions Licht zu ermöglichen. Die Mikroprismen Sonde gleichzeitig Bilder multiple kortikale Schichten mit einer Perspektive in der Regel nur in Scheiben Vorbereitungen gesehen. Die Bilder werden mit einem großen gesammelt field-of-view (~ 900 um). Darüber hinaus bieten wir Informationen über die Nicht-Überleben chirurgischen Eingriff und Mikroskop-Setup. Repräsentative Ergebnisse sind Bilder von Schicht V Pyramidenneuronen von Thy-1 YFP-H-Mäuse zeigen ihre apikalen Dendriten, die sich durch die oberflächliche Rindenschicht und sich in Büscheln. Resolution war ausreichend, um Bild dendritischen Dornen in der Nähe des Soma der Schicht V Neuronen. Ein tail-Injektion von Fluoreszenzfarbstoff zeigt die komplizierte Netzwerk von Blutgefäßen in der Hirnrinde. Line-Scan von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) fließt durch die Kapillaren zeigt RBC Geschwindigkeit und Flussraten erreicht werden kann. Dieser Roman Mikroprismenring Sonde ist ein elegantes und dennoch leistungsfähige neue Methode zur Visualisierung tiefe Zellstrukturen und kortikale Funktion in vivo.

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In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Rechtwinklige Mikroprismen in die Maus gesteckt Neokortex ermöglicht tiefe Bildgebung von mehreren kortikalen Schichten mit einer Sicht in der Regel in Scheiben gefunden. Ein-Millimeter-Mikroprismen bieten ein weites Feld-of-view (~ 900 um) und räumliche Auflösungen ausreichen, um dendritischen Dornen zu lösen. Wir zeigen, Schicht V neuronalen Bildgebung und Neokortex Gefäßdarstellung mit Mikroprismen.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

11.3K Aufrufe.  Yale University. Rechtwinklige Mikroprismen in die Maus gesteckt Neokortex ermöglicht tiefe Bildgebung von mehreren kortikalen Schichten mit einer Sicht in der Regel in Scheiben gefunden. Ein-Millimeter-Mikroprismen bieten ein weites Feld-of-view (~ 900 um) und räumliche Auflösungen ausreichen, um dendritischen Dornen zu lösen. Wir zeigen, Schicht V neuronalen Bildgebung und Neokortex Gefäßdarstellung mit Mikroprismen.

Serie: In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Forschung

Biologie

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Calcium Imaging von kortikalen Neuronen mit Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...