Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Die mitochondriale Isolierung wird seit Jahrzehnten praktiziert, nach Verfahren, die von Pionieren auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Biochemie entwickelt wurden, um metabolische Beeinträchtigungen und Krankheiten zu untersuchen. Eine gleichbleibende mitochondriale Qualität ist notwendig, um die mitochondriale Physiologie und Bioenergetik richtig zu untersuchen; Für Forschende stehen jedoch viele verschiedene veröffentlichte Isolationsmethoden zur Verfügung. Obwohl unterschiedliche experimentelle Strategien unterschiedliche Isolationsmethoden erfordern, sind die Grundprinzipien und Verfahren ähnlich. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die in der Lage ist, gut gekoppelte Mitochondrien aus einer Vielzahl von Gewebequellen, einschließlich Kleintieren und Zellen, zu extrahieren. Zu den skizzierten Schritten gehören die Organdissektion, die mitochondriale Reinigung, die Proteinquantifizierung und verschiedene Qualitätskontrollen. Die primäre Qualitätskontrollmetrik zur Identifizierung hochwertiger Mitochondrien ist das Respiratory Control Ratio (RCR). Die RCR ist das Verhältnis der Atemfrequenz während der oxidativen Phosphorylierung zur Rate in Abwesenheit von ADP. Alternative Metriken werden diskutiert. Während mit diesem Protokoll hohe RCR-Werte im Verhältnis zu ihrer Gewebequelle erzielt werden, können mehrere Schritte optimiert werden, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden. Dieses Verfahren ist robust und hat durchweg zu isolierten Mitochondrien mit überdurchschnittlichen RCR-Werten in Tiermodellen und Gewebequellen geführt.

Mitochondrien sind subzelluläre Organellen, die zytoplasmatische energetische Bedingungen schaffen, die für bestimmte Zellfunktionen optimiert sind. Während Studien auf Zell-, Gewebe- und Organismusebene Einblicke in die mitochondriale Funktion geben können, bietet die Isolierung der Organellen ein Maß an experimenteller Kontrolle, das sonst nicht möglich wäre. Mitochondriale Isolierungen werden seit den 1940er Jahren durchgeführt, was mechanistische Untersuchungen des Stoffwechsels und der Atmung in einer Vielzahl von Zellen und Geweben ermöglicht ^1,2. Die historische Bedeutung der Mitochondrien ist ebenfalls gut dokumentiert³. Als Hauptproduzenten von ATP spielen die Mitochondrien viele Schlüsselrollen, die für eine optimale Zell- und Organfunktion von entscheidender Bedeutung^{sind 4}. Innerhalb der mitochondrialen Matrix werden Substrate durch den TCA-Zyklus oxidiert, wodurch reduzierende Äquivalente und mobile Elektronenträger wie NADH und UQH₂ ^5,6 entstehen. Cytochrom C ist der dritte mobile Hauptelektronenträger im mitochondrialen biochemischen Reaktionsnetzwerk⁷. Diese Moleküle werden dann durch die Transmembrankomplexe des Elektronentransportsystems (ETS) oxidiert, die in die innere Mitochondrienmembran^{eingebettet sind 8}. Redoxreaktionen des ETS sind gekoppelt mit der Protonentranslokation von der Matrix in den Intermembranraum. Diese Prozesse etablieren einen elektrochemischen Protonengradienten, der verwendet wird, um ADP mit Pi durch F₁F₀ ATP-Synthase zu phosphorylieren und ATP ^9,10 zu produzieren. Die einzelnen Prozesse, die an jedem Komplex ablaufen, können mit hochauflösender Respirometrie unter Verwendung von Clark-Elektroden oder Mikrotiterplatten-Sauerstoffverbrauchsassays untersucht werden^11,12. Darüber hinaus können Krankheitsmodelle und Behandlungen mit isolierten Mitochondrien den Einfluss oder die Bedeutung der Mitochondrienfunktion beim Fortschreiten bestimmter Pathologien bestimmen. Dies hat sich im Bereich der Kardiologie als fruchtbar erwiesen, wo Veränderungen in der Kraftstoff- und Substratzufuhr verwendet wurden, um aufzuklären, wie mitochondriale Dysfunktion die Herzinsuffizienz beeinflusst 13,14,15,16. Es ist auch bekannt, dass Mitochondrien die Entwicklung anderer Krankheitszustände wie Diabetes, Krebs, Fettleibigkeit, neurologische Störungen und Myopathien beeinflussen^17,18. Daher ermöglicht die Verwendung von isolierten oder gereinigten Mitochondrien mechanistische Untersuchungen des oxidativen Stoffwechsels und der ATP-Produktion im Ausgangsgewebe.

Es gibt keinen Mangel an mitochondrialen Isolationsprotokollen, da sie für die bioenergetische Forschung wichtig sind. Darüber hinaus finden sich hochspezifische Methoden, die auf Subpopulationen von Mitochondrien in Geweben und Zellen zugeschnitten sind^19,20. Die grundlegenden Verfahrensschritte sind bei den Isolierungsmethoden ähnlich, aber es können Variationen an der Pufferzusammensetzung, den Homogenisierungsschritten und den Zentrifugationsdrehungen vorgenommen werden, um die Menge und Qualität der Mitochondrien zu verbessern. Änderungen dieser Aspekte beruhen auf dem metabolischen Bedarf des Gewebes, der allgemeinen Organfunktion, der mitochondrialen Dichte und anderen Faktoren. In Geweben wie der Leber und der Skelettmuskulatur werden tragbare Homogenisatoren verwendet, um die mitochondriale Integrität zu erhalten und die Schädigung der mitochondrialen Membranen zu begrenzen²¹. Bei der Isolierung aus der Niere wird jedoch in einigen Protokollen die Verwendung einer manuell angetriebenen Homogenisierung oder kommerzieller Kits empfohlen, um bessere Ergebnisse zu erzielen²². Obwohl beide Methoden funktionelle Mitochondrien liefern, kann die Qualität der Organellen durch die zusätzliche Zeit, die für die Durchführung der Isolierungen mit diesen Protokollen benötigt wird, beeinträchtigt werden. Die Zentrifugation ist auch für die Extraktion von mitochondrialem Protein von entscheidender Bedeutung, da sie zelluläre Bestandteile wie Zellkerne und andere Organellen von den Mitochondrien trennt²³. Während des Isolierungsprozesses wird diskutiert, ob eine differentielle oder eine dichtebasierte Zentrifugation durchgeführt werden sollte, um reinere Isolate^{zu erhalten 24}. Während die Dichtezentrifugation Mitochondrien von Organellen mit ähnlichem spezifischem Gewicht, wie z. B. Peroxisomen, trennen kann, ist es nicht gut etabliert, ob Mitochondrien aus diesen Methoden die In-situ-Organellenfunktion besser repräsentieren als Mitochondrien, die durch differentielle Zentrifugation isoliert wurden. Im Bereich der mitochondrialen Physiologie wird die dichtebasierte Zentrifugation bevorzugt und kann leicht verändert werden, um die Reinheit des Isolats zu erhöhen. Ob Änderungen der g-Kräfte, der Zentrifugationsdauer und der Anzahl der Zentrifugationsumdrehungen berücksichtigt werden, sollte aufgrund ihres Einflusses auf die mitochondriale Reinigung vor dem Versuch berücksichtigt werden. Darüber hinaus unterscheidet sich die mitochondriale Resuspension, der wohl wichtigste Schritt während der Isolierung, stark zwischen den Studien, wobei Schaben, wirbelbasiertes Mischen oder Homogenisieren verwendet werden 23,25,26. Eine mechanische Resuspension dieser Art kann zu abrasiv sein und die Membranintegrität der Mitochondrien beeinträchtigen. Aus diesem Grund sollte eine schonende Wäsche durchgeführt werden, um dies zu korrigieren. Trotz der Fülle an Modulationen und vorgeschlagenen Methoden gibt es weniger umfassende Protokolle mit hoher Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit für Nagetiermodelle.

Die hierin beschriebenen Verfahren skizzieren ein detailliertes, robustes und hochgradig reproduzierbares Protokoll, das gereinigte, gut gekoppelte Mitochondrien aus kleintierischem Herzgewebe liefert. Wie gezeigt, kann diese Methode leicht an die spezifischen Anforderungen jedes Experiments und/oder jeder Laborumgebung angepasst werden, um Mitochondrien aus Nieren, Leber und kultivierten Zellen zu isolieren. Weitere Modifikationen können vorgenommen werden, um Mitochondrien aus Geweben und anderen Tieren zu isolieren, die hier nicht aufgeführt sind. Pufferrezepte, die für alle Isolationen verwendet werden, werden bereitgestellt und können bei Bedarf geändert werden. Ähnlich wie bei anderen veröffentlichten Protokollen werden die motorisierte Homogenisierung und die differentielle Zentrifugation implementiert; Je nach Isolationsquelle werden jedoch sowohl die Scherzeit als auch die Kraft, mit der die Proben zentrifugiert werden, angepasst, um gleichbleibend hochwertige mitochondriale Isolate zu liefern. Bemerkenswert ist, dass sich dieses Protokoll von anderen durch sanftes Waschen durch Pipettieren unterscheidet, um pelletierte Mitochondrien zu resuspendieren, was dazu beiträgt, die Integrität der Mitochondrienmembran zu erhalten und die Gesamtfunktionalität der Organellen zu erhalten. Die Quantifizierung des mitochondrialen Proteins erfolgt entweder durch Bestimmung des Gesamtproteins oder durch Messung der Citratsynthase-Aktivität. Der Nutzen und die breite Anwendbarkeit dieser Isolationsmethode werden durch die Werte der Atemkontrollverhältnisse (RCR) unterstützt, die über verschiedene Organismen und Gewebequellen hinweg erreicht wurden.

Die Verwendung und Behandlung aller Wirbeltiere erfolgte in Übereinstimmung mit genehmigten Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Michigan State University überprüft und akzeptiert wurden. Dieses Protokoll wurde sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Hartley-Albino-Meerschweinchen und Sprague Dawley (SD)-Ratten entwickelt. Für die Isolierung von Herzmitochondrien aus Meerschweinchen wurden Tiere im Alter zwischen 4 und 6 Wochen (300-450 g) getötet. Herzmitochondrien von SD-Ratten beiderlei Geschlechts wurden im Alter von 10-13 Wochen (250-400 g) gewonnen. Rezepte für Puffer sind in Tabelle 1 beschrieben und sollten im Voraus vorbereitet werden. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Bevor Sie mit der Isolierung beginnen, beschriften Sie zwei 50-ml-Zentrifugationsröhrchen mit "Spins 1 und 2" und "Spin 3".
2. Legen Sie die Röhrchen, den frisch aufgetauten Isolationspuffer (IB), die scharfe Hackschere, die zusammengebaute Homogenisierungssonde und ein 5-ml-Becherglas oder einen Behälter gleicher Größe auf Eis.
3. Legen Sie den frisch aufgetauten Respirationspuffer (RB) in einen Inkubator, um ihn für nachfolgende Atemuntersuchungen zu erwärmen.
4. Eine gekühlte Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
5. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte angeordnet sind und 20 μl 7-15 U/mg Protease aus Bacillus licheniformis in das Röhrchen mit der Bezeichnung "Spins 1 und 2" gegeben wurden.
6. Richten Sie ein schwerkraftabhängiges Drucksystem für die Perfusion durch Kanülierung mit Kardioplegiepuffer (CB, Tabelle 1), Glaskanüle und Kunststoffschlauch mit angeschlossenem Absperrhahnventil ein.
7. Ordnen Sie chirurgische Instrumente an und fügen Sie eine geeignete Schere und Pinzette für die Dissektion und Kanülierung des Herzens hinzu.
   HINWEIS: Das gesamte Wasser sollte von reiner Qualität sein (18,2 MΩ cm)

2. Dissektion des Gewebes

1. Injizieren Sie Tieren steriles Heparinsulfat intraperitoneal in einer Dosis von 500 U/kg.
2. Lassen Sie das Tier nach der Heparinverabreichung 15 Minuten in der Induktionskammer sitzen. Während dieser Zeit ist 2 l/min reines_O2-Gas zuzuführen, um die Tiere vollständig mit Sauerstoff zu versorgen, sie zu beruhigen und Stress zu minimieren, der nachteilige Auswirkungen auf das interessierende Gewebe haben kann.
3. Beginnen Sie die Anästhesieeinleitung mit einem kontinuierlichen Fluss von Isofluran bei 0,5%. Nach 1 Min. auf 1% erhöhen. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit jede Minute um 1 %, bis 5 % erreicht sind. Sobald Sie bei 5 % sind, warten Sie 1 Minute und überwachen Sie das Atemmuster des Tieres.
4. Sobald sich die Atmung verlangsamt hat und mühsam wird (ungefähr bei der 6,5-Minuten-Marke), schalten Sie den Isofluran- und Sauerstofffluss aus.
5. Nehmen Sie das Tier schnell aus der Induktionskammer und prüfen Sie, ob die Anästhesietiefe angemessen ist, indem Sie eine Pfote zusammendrücken und auf den Hornhautreflex prüfen. Wenn das Tier auf einen der beiden Reize reagiert, setzen Sie es zurück in die Induktionskammer, verabreichen Sie die Anästhesie und wiederholen Sie die Narkosetiefenkontrolle.
6. Sobald die richtige Narkosetiefe erreicht ist, enthaupten Sie schnell mit einer Guillotine, um die Halswirbelsäule zu belasten und den liegenden Körper auf Eis zu legen.
7. Machen Sie zwei parallele vertikale Schnitte von den Schlüsselbeinen, die entlang des lateralen Brustkorbs über die Länge des Brustkorbs verlaufen. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte tief genug sind, um die Rippen am lateralen Thorax zu durchschneiden, aber vermeiden Sie es, intrathorakale Strukturen wie das Herz oder große Gefäße zu beschädigen.
   HINWEIS: Die Größe der vertikalen Schnitte hängt vom verwendeten Tier ab. Bei Verwendung von Meerschweinchen und Ratten bis zum Zwerchfell schneiden (ca. 6,35 cm bei Ratten und 11 cm bei Meerschweinchen). Wenn Sie Mäuse verwenden, führen Sie eine Standard-Thorakotomie^{durch 27}.
8. Legen Sie das Herz mit einem Blutstiller frei, um den vorderen Thorax zu verlagern, und füllen Sie die freiliegende Brusthöhle mit Eis. Dieser Schritt minimiert die warme Ischämiezeit und verbessert die Lebensfähigkeit der isolierten Organellen.
9. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Thymus und das Perikard stumpf zu zerlegen und das Herz vollständig freizulegen.
10. Üben Sie mit einer Pinzette einen sanften Zug auf das Herz aus, um die Aorta freizulegen und zu identifizieren. Die Aorta ist das dickste große Gefäß, das sich von der Basis des Herzens verzweigt. Andere große Gefäße, wie zum Beispiel die Lungenvene, sind deutlich durchsichtiger als die Aorta.
11. Schneiden Sie die Aorta etwa 4-6 mm oberhalb der Aortenwurzel, aber unterhalb der Verzweigungspunkte der Halsschlagadern ab.
12. Die Aorta wird kanüliert und das Herz^28,29 mit eiskalter Kardioplegielösung (CB) unter Verwendung eines schwerkraftabhängigen Druckkopfes perfundiert, bis die Koronararterien vom Blut befreit sind und das Organ blanchiert erscheint.
    HINWEIS: Für große Nagetiere eignet sich ein Kanülendurchmesser von 1,8-2,2 mm gut, während für kleinere Nagetiere ein Durchmesserbereich von 1,4-1,8 mm empfohlen wird. Die Retroperfusion sollte nicht länger als 15-30 s dauern, bis sich die Herzkranzgefäße vom Blut befreit haben.
13. Isolieren Sie das ventrikuläre Myokard, indem Sie die Vorhöfe, das knorpelige Klappengewebe und das Fettgewebe präparieren.
14. Legen Sie die Ventrikel in ein vorgekühltes 10-ml-Becherglas mit 0,1-0,2 mL eiskaltem IB.
15. Schneiden Sie das Gewebe mit einer scharfen chirurgischen Schere bis zu einer Größe von ca. 1 mm³.

3. Mitochondriale Reinigung und Proteinquantifizierung

1. Das zerkleinerte Gewebe wird in das vorgekühlte Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Spins 1 und 2" überführt, das die Proteaselösung enthält.
2. Fügen Sie eiskaltes IB zu einem Endvolumen von 25 mL hinzu.
3. Dispergieren Sie das Gewebe mit einem motorisierten tragbaren Rotor-Stator-Homogenisator bei 18.000 U/min für 20-25 s auf Eis.
4. Zentrifugieren Sie homogenisiertes Gewebe in einem Röhrchen mit der Bezeichnung "Spins 1 und 2" bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C.
5. Entsorgen Sie den Überstand (der Protease enthält), indem Sie ihn in die Ballonflasche gießen, und spülen Sie das Pellet vorsichtig mit 5 ml IB aus, um die verbleibende Protease zu entfernen.
6. Nachdem Sie die Spülung verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet mit frischem eiskaltem IB durch sanften Vortex auf ein Endvolumen von 25 mL.
7. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 10 min bei 4 °C.
8. Entfernen Sie den Überstand (enthält Mitochondrien), indem Sie ihn vorsichtig in ein vorgekühltes 50-ml-Röhrchen mit der Aufschrift "Spin 3" gießen. Achten Sie beim Gießen darauf, dass sich der lose obere Teil des Pellets nicht löst. Alternativ kann eine Transferpipette oder Stripette verwendet werden, um den Überstand aufzufangen.
9. Der Überstand wird bei 8000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
10. Entsorgen Sie den entstandenen Überstand und behalten Sie das mitochondrienhaltige Pellet.
11. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um überschüssigen Überstand von der Innenwand des Rohrs aufzusaugen, und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Bewahren Sie das Pellet so weit wie möglich bei 4 °C auf Eis auf.
12. Um die Mitochondrien zu resuspendieren, geben Sie 80 μl eiskaltes IB auf den Boden des Röhrchens. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie wiederholt IB über das Pellet waschen.
13. Um Blasenbildung zu vermeiden, stellen Sie eine Mikropipette so ein, dass sie aspiriert und zwischen 40 und 60 μl Volumen abgibt.
14. Wenn sich das mitochondriale Pellet dispergiert, vergrößern Sie das Volumen der Mikropipette, um die pelletierten Mitochondrien effizient zu resuspendieren. Vermeiden Sie es, das Pellet mit der Pipettenspitze zu berühren und Blasen zu bilden.
15. Nach der Resuspendierung werden die Mitochondrien in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und als Stammmitochondrien gekennzeichnet. Notieren Sie sich die Gesamtlautstärke der Aufwirbelung.
16. Um die mitochondriale Proteinkonzentration in der Probe zu bestimmen, führen Sie einen Gesamtprotein-Assay unter Verwendung der bekannten BCA- oder Bradford-Protein-Assays durch, wie in den Anweisungen des Herstellers definiert.
    HINWEIS: Eine alternative oder ergänzende Strategie zur Beurteilung der Ausbeute besteht darin, die Citratsynthase-Aktivität zu bestimmen. Als Referenz kann der mitochondriale Gehalt quantifiziert werden, indem das in Vinnakota et ^al.30 beschriebene Protokoll befolgt wird.

4. Qualitätskontrollen

1. Verdünnen Sie den mitochondrialen Stamm in einem vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen auf die gewünschte Arbeitskonzentration mit IB.
   HINWEIS: Mitochondriale Stämme werden auf 40 mg/ml verdünnt, um bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml für Respirometrie-Assays zu arbeiten, wenn Isolate aus Herzgewebe verwendet werden.
2. Spülen Sie Oxygraphenkammern, Stopfen und Mikroliterspritzen zehnmal mit destilliertem Wasser, um sie zu reinigen, bevor Sie sie in Respirometrie-Assays verwenden.
3. Um die Lebensfähigkeit und Qualität von mitochondrialen Isolaten zu testen, laden Sie 2,3 ml Respirationspuffer (RB) in die Oxygraphenkammern und lassen Sie das Sauerstoffverbrauchssignal bei 37 °C für etwa 10 Minuten oder wenn die Rate nahe 0 liegt, äquilibrieren.
4. Sobald das Signal ausgeglichen ist, drücken Sie die Stopper nach unten und saugen Sie den überschüssigen Puffer an, der aus der Kapillare des Stoppers austritt.
5. Fügen Sie 1 mM EGTA mit einer Mikroliterspritze hinzu, um das restliche Calcium in den Puffern oder der mitochondrialen Probe zu chelatisieren.
6. Um die Atmung anzukurbeln, fügen Sie 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat hinzu.
7. Nach der Zugabe von Substraten fügen Sie einen Bolus aus verdünnten Mitochondrien hinzu, um eine Arbeitskonzentration zu erreichen, und lassen Sie die Atmung 5 Minuten lang erfolgen. Dieser Zeitraum wird als LEAK oder Beatmung des Zustands 2 bezeichnet.
8. Fügen Sie bei der 5-Minuten-Marke einen Bolus von 500 μM ADP hinzu, um die Atmung des Zustands 3 zu initiieren, auch OXHPOS genannt, und lassen Sie die Mitochondrien bis zur Anoxie atmen.
9. Berechnen Sie das Respiratory Control Ratio (RCR), indem Sie die maximale Rate des Sauerstoffverbrauchs während Zustand 3 durch die Rate des Sauerstoffverbrauchs kurz vor der Zugabe von ADP in Zustand 2 dividieren (siehe Abbildung 1).
   HINWEIS: Ein alternativer RCR-Ausdruck von 1 - 1/RCR kann auch als Qualitätsmetrik verwendet werden, die zwischen 0 und 1 begrenzt ist. Es ist jedoch schwierig, die Qualität anhand dieser Metrik zu unterscheiden, wenn die RCR 10 > (siehe Abbildung 2).
10. Spülen Sie Kammern und Stopfen 10 Mal mit reinem Wasser, um den Oxygraphen für nachfolgende Assays zu reinigen. Wenn die Respirometrie abgeschlossen ist, füllen Sie die Kammern mit 70 % Ethanol und setzen Sie die Stopfen bis zur nächsten Verwendung in die Kammern.

Nach Abschluss der mitochondrialen Isolierung sollte die Qualität und Funktionalität der Isolate durch Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs (J_O2) mittels hochauflösender Respirometrie getestet werden. Zu diesem Zweck wurden die mitochondrialen Stämme auf 40 mg/ml verdünnt, um Arbeitskonzentrationen von 0,1 mg/ml in 2 ml RB für alle Respirometrie-Assays mit isolierten kardialen Mitochondrien zu ermöglichen. Die Atmung wurde durch 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat in Gegenwart von 1 mM EGTA, einem Calciumchelator, angeheizt und 5 Minuten lang ausgeglichen, um die Atmung des Zustands 2 zu etablieren. Während dieses Zustands sollte der Sauerstoffverbrauch durchschnittlich 45-55 pmol/ml/s oder 27-33 nmol/mg/min betragen. Achten Sie auf den elektrodenabhängigen Sauerstoffverbrauch und führen Sie bei Bedarf die entsprechenden Hintergrundkorrekturen durch. Die oxidative Phosphorylierung (Zustand 3) wird bei der 5-Minuten-Marke durch einen Bolus von 500 μM ADP eingeleitet. Die Substratzugabe und die repräsentative Nachzeichnung sind in Abbildung 1 dargestellt. Funktionelle Mitochondrien haben nach der Zugabe von ADP einen sofortigen Anstieg von J_O2 , der je nach Gewebequelle variiert, wie in Abbildung 2 gezeigt. Ohne die Verwendung von EGTA hat Restcalcium unterschiedliche Auswirkungen auf die maximalen Raten von J_O2 während OXPHOS, abhängig von der mitochondrialen Konzentration, der Substratverfügbarkeit und anderen Umweltfaktoren. Die Zusammensetzung des Puffers ist wichtig für die Erhaltung der Integrität und Funktionalität der mitochondrialen Membran. Alle Pufferrezepte, die in dem Protokoll erwähnt werden, sind in Tabelle 1 weiter detailliert beschrieben und können für alle hierin beschriebenen mitochondrialen Zubereitungen verwendet werden.

Eine erfolgreiche Isolierung von Mitochondrien wird durch die Ermittlung von RCR-Werten gekennzeichnet, die innerhalb des gegebenen Bereichs für jede Spezies und Gewebequelle liegen, wie in Tabelle 2 gezeigt. Basierend auf den mit diesem Protokoll gesammelten Daten sollten bei der Isolierung von Herzmitochondrien aus Meerschweinchen, Ratten oder Mäusen die RCRs ≥16, ≥8 bzw. ≥5 betragen. Bei der Isolierung aus Rattenleber oder -niere sollten die RCRs ≥6 betragen, während RCRs aus Zellen als akzeptabel angesehen werden, wenn sie über 3,8 liegen. Wenn die RCR-Werte unter diese Bereiche fallen oder wenn es qualitative Unterschiede in den Respirometrie-Tracings gibt, wird empfohlen, einen zusätzlichen Assay mit neuen RB und Substraten durchzuführen, um Probleme durch Kontamination auszuschließen. Obwohl die 1-1/RCR-Transformation Werte zwischen 0 und 1 begrenzt, wird diese Metrik beim Vergleich der mitochondrialen Qualität zwischen Geschlechtern oder Spezies nicht empfohlen, wenn der RCR-Wert größer als 10 ist. Aus diesem Grund wurden bei allen Experimenten die Standard-RCR-Werte (Zustand 3/Zustand 2 oder OXPHOS/LEAK) quantifiziert. Informationen zu Modulationen, die an diesem Protokoll vorgenommen werden können, um Mitochondrien aus Herzen, Leber, Nieren und Zellen von Mäusen besser zu isolieren, sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Abbildung 1: Regions of Interest für Qualitätskontrollkontrollen mittels hochauflösender Respirometrie. Die Atemkammern wurden mit 2 mL RB beladen und bei 37 °C äquilibriert, bis die Rate des Sauerstoffverbrauchs nahe 0 lag. Nach der Äquilibrierung wurde 1 mM EGTA, ein Calciumchelator, zusammen mit 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat zugegeben. Nach der Zugabe dieser Substrate wurden Mitochondrien in der gewünschten Arbeitskonzentration (0,1 mg/ml) zugegeben und 5 Minuten lang atmen gelassen, um die Atmung des Zustands 2 (gelb) zu erreichen. Nach 5 Minuten wurden 500 μM ADP hinzugefügt, um die Atmung in Zustand 3 zu initiieren (rot). Die RCRs wurden durch Zeitmittelung der durch die roten und gelben Felder gekennzeichneten Sauerstoffverbrauchsraten bestimmt, um den Zustand 3 mit dem Zustand 2 zu vergleichen. Zustand 4 wird durch das grüne Kästchen gekennzeichnet und stellt den Zeitraum der extramitochondrialen ATPase-Hydrolysierung von ATP dar und kann zur Beurteilung der Integrität der äußeren Membran in Cytochrom-C-Assays verwendet werden. Die angezeigten Daten wurden mit Hilfe von SD-Herzmitochondrien der Ratte gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative J_O2-Spuren und Atemkontrollverhältnisse über tierische und Gewebequellen. Die Qualität der isolierten Mitochondrien wurde durch Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs mittels hochauflösender Respirometrie getestet. Die Atmung wurde durch 5 mM Natriumpyruvat und 1 mM L-Malat in Gegenwart von 1 mM EGTA angeheizt. Mitochondrien und Substrate wurden 5 Minuten lang atmen gelassen, damit sich die Atmung des Zustands 2 stabilisieren konnte. Die maximalen Raten des Sauerstoffverbrauchs nach der Zugabe von ADP wurden mit den Raten des Sauerstoffverbrauchs in Zustand 2 vor ADP verglichen, um die Atemkontrollverhältnisse (RCRs) für jedes Gewebe zu berechnen. Die mitochondriale Qualität wurde weiter bewertet, indem die 1-1/RCR-Werte berechnet wurden, wie sie durch P-L-Kontrolleffizienzstandards charakterisiert wurden. Balkendiagramme rechts neben jeder Nachzeichnung zeigen die durchschnittlichen RCR-Werte für Männer (blau) und Frauen (grün) und 1-1/RCR-Werte ± SD für ein bestimmtes Gewebe an. (A), (B) und (C) beziehen sich auf Daten, die mit Meerschweinchen, Sprague Dawley (SD)-Ratten bzw. Friend-Leukämievirus B (FVB)-Mausherzen gesammelt wurden. (D) und (E) beschreiben die Ergebnisse von SD-Leber und -Niere von Ratten, während (F) sich auf HEK293-Zellen bezieht. Die drei größeren Leberlappen wurden entnommen, während beide Nieren zur Isolierung verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Puffer-Rezepte. Karoplegiepuffer (CB), Isolationspuffer (IB) und Atmungspuffer (RB), die während des gesamten Isolationsprozesses verwendet werden, sind im Voraus gemäß den aufgeführten Anweisungen vorzubereiten. CB kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden, während IB und RB 4 Monate bei -80 °C gelagert werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Analyse des Atmungskontrollverhältnisses. Die mitochondriale Isolierung für funktionelle Analysen wurde an einer Vielzahl von Spezies und Gewebequellen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Nagetieren sowie bei HEK293-Zellen durchgeführt. Die Stichprobengröße jedes Geschlechts, jeder Gewebequelle und jeder Spezies wird zusammen mit den durchschnittlichen RCR- und 1-1/RCR-Werten ± SD detailliert beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Empfohlene Modulationen des mitochondrialen Isolationsprotokolls für unterschiedliche Gewebe zur Erhöhung der Proteinausbeute. Änderungen der Proteasemengen und Zentrifugationen werden je nach Gewebequelle angezeigt. Die durchschnittlichen Mengen an Gesamtprotein (mg) wurden aus den Ergebnissen des BSA-Proteinassays und dem Resuspensionsvolumen des endgültigen mitochondrialen Pellets berechnet. Die Werte werden als Mittelwert ± SD angegeben. Fettgedruckte Anweisungen in der Zentrifugationsspalte geben an, ob der Überstand verworfen, zurückbehalten oder gepoolt werden soll. Unter Verwerfen versteht man die Entsorgung des Überstands in einem Behälter für biologische Abfälle, während sich Retention und Pooling auf das Umfüllen des Überstands in das folgende Zentrifugationsröhrchen bzw. das Sammeln für die letzte Schleuderung beziehen. Weitere Details zu Änderungen des Protokolls finden Sie im Diskussionsbereich. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Einhaltung der in diesem Protokoll kurz beschriebenen Methoden wird die Isolierung gut gekoppelter Mitochondrien aus dem Herzgewebe kleiner Nagetiere sowie anderer Gewebetypen und -quellen gewährleisten. Insgesamt sollte der Prozess 3-3,5 Stunden dauern, während derer alle tierischen Gewebe, Proben und Isolate so weit wie möglich auf Eis bei 4 °C verbleiben sollten, um den Abbau zu begrenzen. Dieses Verfahren ist robust und kann auf verschiedene Weise geändert werden, um die experimentellen Ziele und verwendeten Modelle besser anzupassen. Eine Modulation, die während des Gewebedissektionsprozesses vorgenommen werden kann, ist der Ausschluss von Heparin. Heparin wird verabreicht, um die Bildung von Blutgerinnseln^{zu verhindern 31} , ist aber nicht notwendig, wenn das Herz schnell genug (innerhalb von 1,5 Minuten nach der Enthauptung) kanüliert und perfundiert wird. Darüber hinaus wird bei größeren Nagetieren eine Perfusion des Herzens mit CB empfohlen, daher wird bei der Arbeit mit Mäuseherzen oder anderen Organen empfohlen, vor dem Zerkleinern und der anfänglichen Homogenisierung IB-Waschungen einzuschließen. Dieser Schritt ermöglicht es, Blut, das aus dem Sezierprozess mitgenommen wurde, zu entsorgen. Zu den weiteren Änderungen gehören Änderungen an der Homogenisierungs- und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die mitochondriale Proteinausbeute zu erhöhen. Die oben beschriebenen dienen zur Isolierung von Herzmitochondrien aus Meerschweinchen und Ratten. Wichtig ist, dass dieses Protokoll angepasst werden kann, um Mitochondrien aus Nagetierleber, Nieren, Mausherzen und -zellen zu isolieren. Empfohlene Änderungen des Proteasevolumens, der Homogenisierung und der Zentrifugation auf der Grundlage spezifischer Gewebetypen und Tiere sind in Tabelle 3 näher beschrieben.

Nach der Bildung des gereinigten mitochondrialen Pellets aus dem letzten Zentrifugationsschritt sollen die Mitochondrien in vorgekühltem IB resuspendiert werden. Das Volumen des zugesetzten IB hängt von der Größe des mitochondrialen Pellets ab, beträgt jedoch bei Meerschweinchen und Ratten etwa 80 μl. Bei der Isolierung aus Mausherzen werden 60 μl IB zur Resuspension hinzugefügt. Bei der ersten Isolierung von Mitochondrien wird empfohlen, kleinere Mengen IB hinzuzufügen, um die Stammlösung nicht zu verdünnen. Aufgrund der Konsistenz der mitochondrialen Pellets, die nach der Reinigung von Proben aus Leber und Nieren gebildet werden, muss viel weniger IB (20 μl) zur Resuspension hinzugefügt werden. Andere Verfahren schlagen die Verwendung einer mechanischen Resuspension durch Schaben vor, die für die Mitochondrienmembranen abrasiv sein und die Gesamtintegrität verringern kann^32,33. Bei der Verwendung dieses Protokolls wird empfohlen, das Pellet vorsichtig mit IB zu waschen, um die Qualität der Mitochondrien zu verbessern. Achten Sie bei diesem Vorgang darauf, dass keine Blasen entstehen oder das Pellet mit der Pipettenspitze gestört wird, da dies zu Membranrissen und Proteinfehlfaltungen führen kann³⁴. Nur das Drücken bis zum ersten Anschlag der Pipette kann dazu beitragen, die Wahrscheinlichkeit der Blasenbildung zu verringern. Die Pipette muss schonend gewaschen werden, bis das gesamte Pellet in Suspension ist. Die Gesamtresuspensionsausbeute sollte 150-200 μl für Herzmitochondrien von Meerschweinchen und Ratten betragen und eine hellbraune Farbe haben. Konzentriertere Proben haben einen dunkleren Braunton und können verdünnt werden, um dem gewünschten Arbeitskonzentrationsbereich nach der Quantifizierung des mitochondrialen Proteins zu entsprechen.

Standardproteinassays mit BSA sind optimal für die Quantifizierung mitochondrialer Proteine³⁵. Proteinassays sollten verzögert und für die empfohlenen Dauern und Temperaturen inkubiert werden, die im Protokoll des Herstellers definiert sind. Bei isolierten Mitochondrien ermöglicht die Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten eine gut verteilte Farbentwicklung und eine genaue Proteinquantifizierung. Bei der Quantifizierung der Gesamtproteinmenge wird empfohlen, die resuspendierten Mitochondrien und IB zunächst in einem Verhältnis von 1:50, 1:100 und 1:200 zu verdünnen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse des Proteinassays innerhalb des Kalibrierungsbereichs liegen. Weitere Einzelheiten zur Durchführung von Proteinassays unter Verwendung von BSA als Standard sind im Kit des Herstellers enthalten, so dass die hierin aufgeführten Empfehlungen möglicherweise nicht anwendbar sind. Es sollte auch ein CS-Assay durchgeführt werden, um den mitochondrialen Gehalt in jeder Probe zu bestimmen. Dieser Assay ist gut etabliert und ermöglicht eine weitere Normalisierung bei der Untersuchung biologischer Unterschiede zwischen den mitochondrialen Subtypen³⁶.

Nach der Proteinbestimmung sollte der mitochondriale Stamm verdünnt werden, um die gewünschte endgültige Arbeitskonzentration für Respirometrie-Assays zu erreichen. Mitochondrien, die aus Meerschweinchen und Rattenherzen isoliert wurden, werden auf 40 mg/ml verdünnt, und 5 μl dieser Brühe werden in die Atemkammer gegeben, um eine Arbeitskonzentration von 0,1 mg/ml zu erhalten. Bei der Isolierung aus einzelnen Mausherzen oder aus Nieren und Leber ist eine Verdünnung des mitochondrialen Stammes möglicherweise nicht erforderlich. Es können auch größere Volumina an Mitochondrien hinzugefügt werden, um die gewünschten Konzentrationen zu erhalten. Raten des Sauerstoffverbrauchs während des Zustands 2, die zwischen 35 und 55 pmol/ml/s liegen, sind für die meisten Respirometrie-Analysen akzeptabel²⁸. Einzelheiten zur Durchführung und Analyse von RCRs sind in Abbildung 1 und im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" erläutert. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Atmung durch Pyruvat und Malat angeheizt wird. Andere Substratbedingungen wie Succinat und Rotenon führen zu unterschiedlichen RCR-Werten, da das P/O-Verhältnis und andere bioenergetische Variablen unterschiedlich sind³⁷. Durch die Verwendung von Pyruvat und Malat als Atemwegskraftstoffe wird ein nahezu maximaler TCA-Zyklusumsatz und die Produktion von Reduktionsäquivalenten erreicht. Die maximale TCA-Zyklusaktivität und die gekoppelte ETS-Funktion werden jedoch mit 5 mM Pyruvat, 1 mM L-Malat und 20 mM Succinat erreicht. Bei der Stimulierung der oxidativen Phosphorylierung zur Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs während des Zustands 3 wird ADP in Konzentrationen zugegeben, die mindestens das 10-fache des geschätzten K_D für ADP des Adenin-Nukleotid-Translokators³⁸ betragen. Dies kann durch Boli mit mehr als 350 μM ADP erreicht werden, weshalb in allen experimentellen Assays 500 μM verwendet wurden. Wenn die Dauer von Zustand 3 zu kurz ist, können niedrigere mitochondriale Konzentrationen verwendet werden, um sie zu verlängern. Für eine weitere Analyse der Atmung können Modulationen an der Konzentration von ADP vorgenommen werden, die in das System eingebracht wird, um die experimentellen Parameter^{besser anzupassen 39}. Bei der ersten Entwicklung dieses Protokolls wurde ein Cytochrom-C-Assay verwendet, um die Integrität der äußeren Membran der mitochondrialen Isolate^{zu beurteilen 40}. Wenn die RCR-Werte unter den erwarteten Bereichen liegen, führen Sie den Cytochrom-C-Test durch, um zu beurteilen, ob die Schädigung der äußeren Membran signifikant ist. Geben Sie dazu 10 μM Cytochrom C in die Atemkammer und bestätigen Sie, dass die Zunahme der Atmung unter 5 oder 10 % der Rate von Zustand 4 liegt. Die erwarteten Bereiche stammen aus bereits veröffentlichten Studien und sind spezies-, gewebe- und substratspezifisch. Wenn die Zugabe von Cytochrom c die Atmung des Zustands 4 um mehr als 10 % stimuliert, kann der letzte Spin von 8.000 x g wiederholt werden, um beschädigte Mitochondrien zu entfernen. Allerdings kann die Schädigung der äußeren Membran Teil eines Krankheitsphänotyps sein, und daher sollte der Cytochrom-C-Test in diesem Sinne interpretiert werden⁴¹. Sobald konstant hohe RCR-Werte mit niedrigen (<10%) Cytochrom C-stimulierten Effekten erreicht werden, wird dieser Test nur dann notwendig und empfohlen, wenn die RCR-Werte außerhalb akzeptabler Bereiche liegen. Wenn der Cytochrom-C-Test <10 % beträgt und die RCR-Werte außerhalb des erwarteten Bereichs liegen, wie in Tabelle 2 beschrieben, wiederholen Sie den Respirometrie-Assay mit neuem RB, nachdem Sie 10 Mal mit destilliertem Wasser gewaschen haben. Wenn immer noch verringerte Raten beobachtet werden, müssen neue Reagenzien (Pyruvat, Malat, EGTA und ADP) hergestellt werden, um das Problem zu diagnostizieren. Darüber hinaus können Cytochrom-C-Assays mittels ELISAs und unter Verwendung von mitochondrialen Farbstoffen wie TMRE^33,42 durchgeführt werden. Je nach Gewebetyp und -quelle können diese Optionen besser geeignet sein, um die Integrität der äußeren Membran zu bestimmen.

Obwohl es keine wesentlichen Einschränkungen bei der Verwendung dieses Protokolls zur Isolierung von Herzmitochondrien gibt, ist es wichtig zu beachten, dass bei der Anwendung dieser Methoden bestimmte Überlegungen angestellt werden sollten. Die Qualität der mitochondrialen Isolate wird stark von der Temperatur und der Zeit beeinflusst, die benötigt wird, um sowohl das Herz zu perfundieren als auch das gereinigte Pellet wieder zu resuspendieren. Daher kann eine Vertrautheit mit diesen Prozessen erforderlich sein, um RCRs zu erhalten, die mit den hier berichteten vergleichbar sind. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Puffer und Lösungen, die während des Isolierungsprozesses verwendet werden, wichtig, da sie die Integrität und Funktion der Mitochondrien direkt beeinflusst⁴³. Die in Tabelle 1 aufgeführten Puffer werden als Referenz angegeben und haben die Isolierung von gut gekoppelten Mitochondrien über eine Vielzahl von Gewebequellen ermöglicht, aber es können Änderungen vorgenommen werden, um die Chloridmenge in der Atmungsanalyse zu begrenzen, da dies die Adenin-Nukleotid-Translokation und die ETS-Funktion beeinträchtigen kann²⁸. Die Pufferzusammensetzung kann auch verändert werden, um die Lebermitochondrien besser zu isolieren. Da die Leber hohe Fettsäurekonzentrationen aufweist, wird empfohlen, das Organ und das zerkleinerte Gewebe mit einem Puffer zu waschen, der erhöhte BSA-Konzentrationen enthält, wenn RCRs außerhalb des erwarteten Bereichs beobachtet werden. Obwohl die Qualität der mitochondrialen Isolate, die aus Leberschnitten gewonnen werden, gut gekoppelt und konsistent ist, könnte diese Veränderung zu einer verbesserten Organellenfunktion führen. Es sollte auch anerkannt werden, dass die Isolierung von Mitochondrien aus Zellen, die diese Methoden anwenden, eine große Menge an kultivierten Zellen erfordert, was eine potenzielle Einschränkung darstellt. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht speziell für zelluläre Isolate konzipiert, hat sich aber bei der Implementierung als erfolgreich erwiesen. Daher können gezielte Isolierungsmethoden für kultivierte Zellen von besserem Nutzen sein. Alternativ können sich Forscher zur Beurteilung der mitochondrialen Qualität für Fluoreszenzsonden entscheiden, um RCRs zu berechnen. Spektrofluorometrische Methoden sind eine beliebte Wahl, insbesondere wenn geringere Mengen an Protein extrahiert werden^44,45.

Insgesamt kann dieses Protokoll verwendet werden, um gut gekoppelte kardiale Mitochondrien von Kleintieren wie Meerschweinchen und Ratten konsistent zu isolieren. Es kann leicht modifiziert werden, um die Proteinausbeute zu erhöhen, indem die Homogenisierungsgeschwindigkeiten, Zentrifugationszeiten und die Anzahl der Umdrehungen geändert werden, um eine mitochondriale Isolierung aus Herzen, Leber, Nieren und Zellen von Mäusen zu ermöglichen. Darüber hinaus ist dieses Protokoll allgemein und robust genug, dass es zur Untersuchung der Mitochondrienfunktion von Nicht-Säugetierarten wie dem Meerneunauge⁴⁶ sowie zur Durchführung von Strukturanalysen mit klassischer und Kryo-Elektronenmikroskopie ^40,47 verwendet wurde. Während sich viele neuere Studien auf die Erforschung des mitochondrialen Verhaltens in intakten Zell- und Gewebesystemen konzentrieren, zeigen die Breite und Tiefe der Informationen, die mit diesen Methoden aus isolierten Mitochondrien extrahiert werden, Auswirkungen auf die Metabolomik, den oxidativen Stress und die ATP-Produktion, die nie ohne Wert sein werden. Die Isolierung gut gekoppelter Mitochondrien ermöglicht es den Forschern, Schlüsselaspekte der Krankheitsentstehung und des Krankheitsverlaufs zu untersuchen, die sonst in Ganzzellmodellen nicht möglich wären. Aufgrund der Vielseitigkeit dieses Protokolls können Veränderungen der mitochondrialen Energie, die bei Pathologien wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und neurologischen Störungen beobachtet werden, mit der hier beschriebenen Methodik untersucht werden.

Die Autoren erklären, dass es nichts offenzulegen gibt.

Wir möchten Daniel A. Beard und Kalyan C. Vinnakota für ihre grundlegenden Beiträge zu diesem Protokoll danken. Diese Arbeit wurde durch das NSF CAREER-Stipendium MCB-2237117 finanziert.