Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.

Pulldown ist ein einfacher und weit verbreiteter Protein-Protein-Interaktions-Assay. Es hat jedoch Einschränkungen bei der Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht effektiv zusammensetzen. Solche Komplexe können eine kotranslationale Assemblierung und das Vorhandensein von molekularen Chaperonen erfordern; Entweder bilden sie stabile Oligomere, die in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können, oder sie sind ohne Bindungspartner instabil. Um diese Probleme zu überwinden, ist es möglich, eine Methode zu verwenden, die auf der bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren basiert, gefolgt von den herkömmlichen Pulldown-Techniken. Der Workflow ist im Vergleich zum herkömmlichen Pulldown zeiteffizienter, da ihm die zeitaufwändigen Schritte der getrennten Aufreinigung interagierender Proteine und ihrer anschließenden Inkubation fehlen. Ein weiterer Vorteil ist eine höhere Reproduzierbarkeit aufgrund einer deutlich geringeren Anzahl von Schritten und einer kürzeren Zeitspanne, in der Proteine, die in der In-vitro-Umgebung existieren, einer Proteolyse und Oxidation ausgesetzt sind. Die Methode wurde erfolgreich zur Untersuchung einer Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet, wenn sich andere In-vitro-Techniken als ungeeignet erwiesen haben. Die Methode kann für die Chargenprüfung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. Repräsentative Ergebnisse werden für Studien zu Wechselwirkungen zwischen BTB-Domäne und intrinsisch ungeordneten Proteinen sowie zu Heterodimeren von Zinkfinger-assoziierten Domänen gezeigt.

Konventioneller Pulldown wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen¹. Gereinigte Proteine interagieren jedoch oft nicht effektiv in vitro^2,3, und einige von ihnen sind ohne ihren Bindungspartner ^4,5 unlöslich. Solche Proteine könnten eine co-translationale Assemblierung oder das Vorhandensein von molekularen Chaperonen 5,6,7,8,9 erfordern. Eine weitere Einschränkung des konventionellen Pulldowns ist die Prüfung möglicher Heteromultimerisierungsaktivität zwischen Domänen, die als stabile Homo-Oligomere existieren können, die kotranslational zusammengesetzt sind ^8,10, da viele von ihnen während der Inkubationszeit in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können. Die Koexpression erwies sich als nützlich bei der Überwindung solcher Probleme ^3,11. Die Koexpression unter Verwendung kompatibler Vektoren in Bakterien wurde erfolgreich zur Aufreinigung großer makromolekularer Komplexe mit mehreren Untereinheiten eingesetzt, einschließlich des Polycomb-Repressionskomplexes PRC2 12, des RNA-Polymerase-II-Mediatorkopfmoduls¹³, der Bakteriophagen-T4-Grundplatte¹⁴, des SAGA-Komplex-Deubiquitinylase-Moduls 15,16 und des Ferritins ¹⁷. Replikationsursprünge, die üblicherweise für die Koexpression verwendet werden, sind ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ und RSF²⁰. Im kommerziell erhältlichen Duet-Expressionssystem werden diese Ursprünge mit verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen und geeigneten multiplen Klonierungsstellen kombiniert, um polycistronische Vektoren zu erzeugen, die die Expression von bis zu acht Proteinen ermöglichen. Diese Ursprünge haben unterschiedliche Kopienzahlen und können in unterschiedlichen Kombinationen verwendet werden, um ausgewogene Expressionsniveaus von Zielproteinen^{zu erreichen 21}. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu testen, werden verschiedene Affinitäts-Tags verwendet; die gebräuchlichsten sind 6xHistidin, Glutathion-S-Transferase (GST) und Maltose-bindendes Protein (MBP), von denen jedes eine spezifische Affinität zum entsprechenden Harz aufweist. GST und MBP verbessern auch die Löslichkeit und Stabilität von markierten Proteinen²².

Es wurde auch eine Reihe von Methoden entwickelt, die die Koexpression von Proteinen in eukaryotischen Zellen beinhalten, von denen die bekannteste der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Y2H) ^ist23. Der Y2H-Assay ist kostengünstig, einfach und ermöglicht das Testen mehrerer Interaktionen. Der Workflow dauert jedoch mehr als 1 Woche. Es gibt auch einige weniger häufig verwendete Säugetierzell-basierte Assays, z. B. den Fluoreszenz-Zwei-Hybrid-Assay (F2H)²⁴ und den Zellarray-Protein-Protein-Interaktions-Assay (CAPPIA)²⁵. Der F2H-Assay ist relativ schnell und ermöglicht die Beobachtung von Proteininteraktionen in ihrer nativen zellulären Umgebung, erfordert jedoch die Verwendung teurer Bildgebungsgeräte. Alle diese Methoden haben einen Vorteil gegenüber der prokaryotischen Expression, die die native eukaryotische Translations- und Faltungsumgebung bereitstellt. Sie erkennen jedoch indirekt eine Interaktion, entweder durch transkriptionelle Aktivierung oder durch Fluoreszenzenergietransfer, wodurch häufig Artefakte entstehen. Eukaryotische Zellen können auch andere Interaktionspartner von Proteinen von Interesse enthalten, die das Testen binärer Wechselwirkungen zwischen Proteinen höherer Eukaryoten stören können.

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen, gefolgt von konventionellen Pulldown-Techniken. Die Methode ermöglicht es, Wechselwirkungen zwischen Zielproteinen zu untersuchen, die eine Koexpression erfordern. Es ist im Vergleich zu herkömmlichem Pulldown zeiteffizienter und ermöglicht das Testen mehrerer Ziele, was es in den meisten Fällen vorteilhaft macht. Die Koexpression mit kompatiblen Vektoren ist bequemer als die polycistronische Co-Expression, da sie keinen mühsamen Klonschritt erfordert.

Die schematische Darstellung des Methodenworkflows ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Co-Transformation von E. coli

1. Bereiten Sie Expressionsvektoren für Zielproteine mit Standard-Klonierungsmethoden vor.
   HINWEIS: In der Regel ist es ein guter Ausgangspunkt, konventionelle pGEX/pMAL-Vektoren zu verwenden, die ein Ampicillin-Resistenzgen und ColE1-Ursprung für die Expression von GST/MBP-markierten Proteinen und einen kompatiblen Vektor mit p15A- oder RSF-Ursprung und Kanamycin-Resistenz tragen, um 6xHis-markierte Proteine zu exprimieren, in einigen Fällen kombiniert mit Thioredoxin oder SUMO-Tag, um die Löslichkeit zu erhöhen. In der Regel müssen vor dem Experiment mehrere Kombinationen von Tags getestet werden. Das beschriebene Verfahren selbst eignet sich für die Batch-Prüfung der Expressionsbedingungen von Zielproteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die meisten Rosetta-Stämme bereits das Plasmid mit p15A-Ursprung für die Expression der tRNAs für seltenes Codon enthalten, daher sollten die p15A-Plasmide vermieden werden, wenn die Verwendung solcher Stämme eine mögliche Option ist. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle .
   1. Züchtung von Bakterien eines geeigneten Stammes in Luria-Bertani (LB)-Medien bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,1-0,2. Der Stamm BL21(DE3) wurde in dieser Studie beispielhaft verwendet.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, frisch präparierte kompetente Zellen zu verwenden, um eine effiziente Co-Transformation mit zwei Vektoren zu erreichen. Wenn mehr als zwei Vektoren gemeinsam transformiert werden müssen, ist es besser, sie nacheinander zu transformieren, um eine gute Transformationseffizienz zu erreichen. Die Elektroporation ist eine gute Alternative.
   2. 1,0 ml der Bakteriensuspension werden 1 min lang bei 9.000 x g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
   3. Fügen Sie 0,5 ml eiskalten Puffertransformationspuffer (TB) hinzu (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 und 15 mM CaCl₂) und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis.
   4. 30 s bei 8.000 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   5. Fügen Sie 100 μl TB-Puffer hinzu, fügen Sie 100 ng von jedem Vektor hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Separate Transformation einzelner Vektoren, um das Proteinverhalten ohne Co-Expression zu untersuchen. Darüber hinaus können Co-Expressionsvektoren paarweise mit leeren Co-Expressionsvektoren für unspezifische Bindungssteuerelemente co-transformiert werden.
      HINWEIS: In den in dieser Studie vorgestellten Beispielen wurden pGEX/pMAL-Vektoren mit entsprechenden cDNAs, die mit GST/MBP-cDNAs fusioniert waren, in Kombination mit kompatiblen pACYC-abgeleiteten Vektoren verwendet, die cDNA-kodierende Partnerproteindomänen trugen, die mit Thioredoxin-cDNA fusioniert waren.
   6. 150 s auf 42 °C erhitzen, dann 1 min auf Eis kalt stellen.
   7. 1 ml flüssiges LB-Medium ohne Antibiotika zugeben und bei 37 °C 90 min inkubieren. Platte auf LB-Agar-Platten, die 0,5% Glucose und entsprechende Antibiotika enthalten (übliche Konzentrationen sind: 50 mg/L Ampicillin; 20 mg/L Kanamycin; 50 mg/L Streptomycin; 35 mg/L Chloramphenicol). Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.

2. Ausdruck

1. Spülen Sie die Zellen von der Platte mit 2 ml flüssigem LB-Medium in 50 ml LB-Medien mit entsprechenden Antibiotika (übliche Konzentrationen sind: 50 mg/l Ampicillin; 20 mg/l Kanamycin; 50 mg/l Streptomycin; 35 mg/l Chloramphenicol). Fügen Sie Metallionen oder andere bekannte Co-Faktoren hinzu (in den Beispielen in dieser Studie wurden 0,2 mM ZnCl₂ zu den Medien gegeben). Lagern Sie ein Aliquot mit 20% Glycerin bei -70 °C für eine anschließende Wiederholung des Experiments.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, mehrere Kolonien direkt von der Platte zu spülen, um die Möglichkeit einer schlechten Expression in einem einzelnen isolierten Klon aufgrund gelegentlicher Rekombinationsereignisse zwischen zwei Plasmiden auszuschließen.
2. Züchten Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U/min bei 37 °C bis zu einem Außendurchmesser von 0,5-0,7, kühlen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ab und fügen Sie Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu 1 mM hinzu. Bewahren Sie ein 20-μl-Aliquot der Zellsuspension als Kontrolle der nicht induzierten Probe auf.
3. Inkubieren Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U/min bei 18 °C über Nacht.
   HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit und -temperatur kann variieren. 18 °C über Nacht funktionieren am besten für die meisten Proteine und es wird empfohlen, es standardmäßig zu versuchen. Reduzieren Sie die Inkubationszeit auf 2-3 Stunden, wenn eine starke unspezifische Bindung beobachtet wird.
4. Teilen Sie die Bakteriensuspension in zwei Teile (oder mehr, wenn mehr als zwei verschiedene Tags verwendet wurden) und lagern Sie ein 20-μl-Aliquot der Zellsuspension, um die Proteinexpression zu bestätigen. Bei 4.000 x g 15 min zentrifugieren.
   HINWEIS: Pausenpunkt: Bakterienpellets können mindestens 6 Monate bei -70 °C gelagert werden.

3. Pulldown-Assay

HINWEIS: Die detaillierten Verfahren werden für Proteine beschrieben, die entweder mit 6xHis oder MBP/GST markiert sind. Alle Eingriffe werden bei 4°C durchgeführt.

1. Resuspendieren Sie die bakteriellen Pellets in 1 ml eiskaltem Lysepuffer mit Proteasehemmern und Reduktionsmitteln (siehe unten), die unmittelbar vor dem Experiment hinzugefügt wurden. Vermeiden Sie Dithiotreitol (DTT), wenn Sie metallchelatbildende Harze verwenden, da es Metallionen entfernt. Passen Sie die Pufferzusammensetzung für die getesteten Proteine an. Die gebräuchlichen Rezepturen von Lysepuffern, die für die meisten Proteine geeignet sind, sind:
   1. 6xHis-Pulldown: Mischen Sie 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] Glycerin, 5 mM Beta-Mercaptoethanol, 1 mM Phenylmethylsfulfonylfluorid (PMSF) und eine 1:1.000-Verdünnung des Proteasehemmer-Cocktails (siehe Materialtabelle).
   2. GST- oder MBP-Pulldown: Mischen Sie 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1 % NP40, 10 % [w/w] Glycerin, 5 mM DTT, 1 mM PMSF und eine 1:1.000-Verdünnung des Proteasehemmer-Cocktails (siehe Materialtabelle).
2. Stören Sie die Zellen durch Beschallung auf Eis. Lagern Sie ein 20 μl Aliquot für die Elektrophorese.
   HINWEIS: In der Regel sind pro Probe 20-25 Impulse von 5 s mit 15-s-Intervallen mit 20 W Ausgangsleistung erforderlich. Die entsprechende Beschallungsleistung sollte für jedes Instrument eingestellt werden, um eine Überhitzung zu vermeiden und eine vollständige Zellstörung zu gewährleisten. Um eine bessere Leistung zu erzielen, wird dringend empfohlen, Multi-Tip-Ultraschallsonden mit hohem Durchsatz zu verwenden.
3. Zentrifugieren bei 20.000 x g für 30 min. Sammeln Sie 20 μl des geklärten Lysats für die anschließende SDS-PAGE-Analyse.
4. Das Harz (50 μl für jede Probe) wird 10 min lang mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer äquilibriert, 30 s lang bei 2.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
5. Zelllysate (Gesamtproteinkonzentration: 20-50 mg/ml) in das Harz geben, 10 min bei konstanter Rotation von 15 U/min inkubieren, bei 2.000 x g 30 s zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Sammeln Sie 20 μl der ungebundenen Fraktion für die anschließende SDS-PAGE-Analyse.
6. Fügen Sie 1 ml eiskalten Waschpuffer hinzu und inkubieren Sie 1 Minute lang. Bei 2.000 x g 30 s zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Die gebräuchlichen Rezepte für Waschpuffer sind:
   1. 6xHis-Pulldown: Mischen Sie 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [w/w] Glycerin und 5 mM Beta-Mercaptoethanol.
   2. GST- oder MBP-Pulldown: Mischen Sie 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1% NP40, 10% [w/w] Glycerin und 5 mM DTT.
7. Führen Sie zwei lange Wäschen durch: Fügen Sie 1 ml eiskalten Waschpuffer hinzu, inkubieren Sie 10-30 Minuten lang mit einer konstanten Drehung von 15 U / min, zentrifugieren Sie es bei 2.000 x g für 30 s und entsorgen Sie den Überstand.
8. 1 ml eiskalten Waschpuffer zugeben, 1 Minute inkubieren, 30 s bei 2.000 x g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
9. Die gebundenen Proteine werden mit 50 μl des Elutionspuffers in einem Shaker bei 1.200 U/min für 10 min eluiert. Die gebräuchlichen Rezepte von Elutionspuffern sind:
   1. 6xHis-Pulldown: Mischen Sie 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol und 5 mM Beta-Mercaptoethanol.
   2. GST-Pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathion (eingestellt auf pH 7,5 mit basischem Tris) und 5 mM DTT.
   3. MBP-Pulldown: Mischen Sie 20 mM Tris (pH 7,5 bei 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM Maltose und 5 mM DTT.
10. Analysieren Sie die eluierten Proteine mit SDS-PAGE.
    HINWEIS: Der prozentuale Anteil an Acrylamid sollte an die Größe der Proteine angepasst werden. In den in dieser Studie bereitgestellten Beispielen wurden 12% Acrylamidgele verwendet, die in Tris-Glycin-SDS-Puffer (2 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,1% SDS) bei konstanter Spannung von 180 V liefen. Gele wurden durch Kochen in 0,2% Coomassieblau R250, 10% Essigsäure und 30% Isopropanol gefärbt und durch Kochen in 10% Essigsäure entfärbt. Die Menge an beladenem Protein sollte nicht gleich sein, da verschiedene Mengen an interagierenden Proteinen in verschiedenen Experimenten heruntergezogen werden können.

Die beschriebene Methode wurde routinemäßig mit vielen verschiedenen Zielen angewendet. Hier werden einige repräsentative Ergebnisse vorgestellt, die mit herkömmlichen Pulldown-Techniken wahrscheinlich nicht erzielt werden können. Die erste ist die Untersuchung der spezifischen ZAD-Dimerisierung (Zinc-finger-associated domain)¹¹. ZADs bilden stabile und spezifische Dimere, wobei Heterodimere nur zwischen eng verwandten Domänen innerhalb paraloger Gruppen möglich sind. Die von diesen Domänen gebildeten Dimere sind stabil und dissoziieren mindestens einige Tage lang nicht. Somit erzeugt das Mischen von gereinigten ZADs keine nachweisbare Bindung. Gleichzeitig zeigt die Koexpression von MBP- und Thioredoxin-6xHis-fusionierten ZADs eine gute und reproduzierbare Homodimerisierungsaktivität (Abbildung 2A), die als zusätzliche Bande in den SDS-PAGE-Ergebnissen des MBP-Pulldown-Assays erscheint. Ein kleiner Teil der Heterodimere kann mit M1BP koexprimiert mit einer anderen Domäne beobachtet werden; Diese Wechselwirkung wurde mit Y2A nicht bestätigt und ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer unspezifischen Assoziation aufgrund der hohen Proteinkonzentration, da diese Domänen Cysteinreich und extrem aggregationsanfällig sind. Bemerkenswert ist, dass in diesem Fall ein 6xHis-Pulldown ungeeignet ist, da ZADs metallkoordinierende Domänen sind, die unspezifisch an das metallchelatbildende Harz binden. Eine solche Aktivität sollte in einem parallelen Experiment sorgfältig untersucht werden.

Ein weiteres Beispiel ist der Konkurrenztest zwischen dem ENY2-Protein und seinen Bindungspartnern Sgf11 (1-83aa) und der Zinkfingerdomäne (460-631 aa) des CTCF-Proteins²⁶. Wenn es allein exprimiert wird, bildet das ENY2-Protein Dimere, die es daran hindern, mit seinen nativen Bindungspartnern zu interagieren. Vermutlich binden sowohl das Sgf11- als auch das CTCF-Protein an dieselbe molekulare Oberfläche von ENY2, wodurch sich ihre Wechselwirkung gegenseitig ausschließt. Im Co-Expressions-Assay interagierte 6xHis-markiertes ENY2 sowohl mit GST-markiertem Sgf11 als auch mit MBP-CTCF, aber bei MBP-Pulldowns war kein GST-Sgf11 vorhanden und umgekehrt (Abbildung 2B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kein dreifacher Komplex gebildet werden kann und sich Wechselwirkungen gegenseitig ausschließen. Diese Daten wurden unabhängig voneinander mit anderen Assays bestätigt und unterstützen die unterschiedlichen funktionellen Rollen von ENY2 in diesen Komplexen. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass große Affinitäts-Tags selbst sterische Hindernisse darstellen können, wodurch die Bildung komplexer Faktoren verhindert wird. Daher sollte die Schlussfolgerung nicht ausschließlich auf Daten zur Koexpression beruhen.

Ein Schritt-für-Schritt-Vergleich der Arbeitsabläufe von konventionellen und gekoppelten Co-Expression-Pulldowns ist in Abbildung 3A dargestellt. Der Co-Expression-gekoppelte Pulldown ist selbst bei einer kleinen Anzahl von Stichproben mindestens doppelt so zeiteffizient und ermöglicht eine gute Skalierbarkeit. Die Ergebnisse der Verwendung beider Techniken zur Untersuchung der gleichen Wechselwirkung zwischen der BTB-Domäne des CP190-Proteins (1-126aa) und der GST-markierten C-terminalen Domäne (610-818aa) des Drosophila-CTCF-Proteins (dCTCF) sind in Abbildung 3B dargestellt. Beide Methoden zeigen eine gute Effizienz und Reproduzierbarkeit (Assays wurden in drei Wiederholungen durchgeführt); Für diesen Fall zeigte der Co-Expressions-gekoppelte Pulldown eine geringere unspezifische Bindung, wie in den Kontrollproben mit GST-Protein allein zu sehen ist.

Abbildung 1: Die schematische Darstellung des Protokolls. Das Schema zeigt den in dieser Studie verwendeten Methodenablauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse . (A) Untersuchung der Zinkfinger-assoziierten Domäne (ZAD) Homodimerisierung in MBP- und 6xHis-Pulldown-Assays. ZADs, die entweder mit MBP (40 kDa) oder mit 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) fusioniert wurden, wurden in Bakterienzellen koexprimiert und die Affinität mit Amyloseharz (bindet MBP-markierte Proteine) oder mit Ni-NTA-Harz (bindet 6xHis-markierte Proteine) gereinigt. Co-gereinigte Proteine wurden mit SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von einer Coomassie-Färbung. Die MBP-Pulldown-Ergebnisse sind in den oberen Panels dargestellt, die 6xHis-Pulldown-Ergebnisse in den unteren Panels (nur als Proteinexpressionskontrolle verwendet, da viele ZADs unspezifisch an Ni-NTA binden). (B) Untersuchung der sich gegenseitig ausschließenden Wechselwirkungen zwischen ENY2- und Sgf11/CTCF-Proteinen. GST-markierte Sgf11 (1-81aa), MBP-markierte CTCF-Zinkfingerdomäne (460-631aa) und 6xHis-markierte ENY2-Proteine wurden in verschiedenen Kombinationen koexprimiert und mit Amyloseharz, Glutathionharz (bindet GST-markierte Proteine) oder mit Ni-NTA-Harz gereinigt. Co-gereinigte Proteine wurden mit SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von einer Coomassie-Färbung. Die Abbildung in den Tafeln A und B wurde mit Genehmigung von Bonchuk et ^al.11 und Bonchuk et ^al.26 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Vergleich der Arbeitsabläufe von konventionellen und gekoppelten Co-Expressions-Pulldown-Assays. (A) Schritt-für-Schritt-Vergleich der erforderlichen Zeitintervalle im Arbeitsablauf des konventionellen Pulldown-Assays im Vergleich zum Pulldown gekoppelt mit Co-Expression. (B) Vergleich zweier verschiedener Pulldown-Techniken bei der Untersuchung der Interaktion zwischen der dCTCF-C-terminalen Domäne (610-818aa) und der BTB-Domäne des CP190-Proteins (1-126aa) in GST-Pulldown-Assays. dCTCF (610-818aa), fusioniert mit GST (25 kDa) oder GST allein, wurden entweder in Bakterienzellen koexprimiert oder in vitro mit Thioredoxin-6xHis-markiertem CP190 BTB inkubiert und mit Glutathionharz affinitätsgereinigt. Es werden drei unabhängige Replikate jedes Assays gezeigt. Co-gereinigte Proteine wurden mit SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von einer Coomassie-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die beschriebene Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in vitro nicht effizient zusammengesetzt werden können und eine Koexpression erfordern. Die Methode ist einer der wenigen geeigneten Ansätze zur Untersuchung heterodimerisierender Proteine, die ebenfalls zur Homodimerisierung fähig sind, da solche Proteine, wenn sie getrennt gereinigt werden, stabile Homodimere bilden, die während des Experiments meistens nicht dissoziieren und reassoziieren^{können 3,11}.

Der Arbeitsablauf der beschriebenen Methode ist im Vergleich zum herkömmlichen Pulldown zeiteffizienter, da die zeitaufwändigen Schritte der separaten Aufreinigung interagierender Proteine und ihrer anschließenden Inkubation fehlen. Ein weiterer Vorteil ist eine höhere Reproduzierbarkeit aufgrund einer deutlich geringeren Anzahl von Schritten und einer kürzeren Zeitspanne, in der Proteine in einer künstlichen In-vitro-Umgebung existieren, während sie Proteolyse und Oxidation ausgesetzt sind. Die Methode wurde erfolgreich zur Untersuchung mehrerer Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet, wenn sich andere In-vitro-Techniken als ungeeignet erwiesen ^3,11,27. Die parallele Co-Präzipitation mit unterschiedlichen Affinitäts-Tags ermöglicht die Kontrolle des Proteinexpressionsniveaus. Da die Methode einfacher und schneller ist als herkömmlicher Pulldown, kann sie stattdessen verwendet werden, auch wenn die Co-Expression nicht unbedingt erforderlich ist. Die Geschwindigkeit des Zellaufschlusses ist ein nicht offensichtlicher Engpass, der die Gesamtzeit erheblich verlängern und zu einer Abweichung der Ergebnisse führen kann, da zwischen der ersten und der letzten Probe, die In-vitro-Bedingungen und Proteolyse ausgesetzt sind, unterschiedlich viel Zeit vergeht. Daher wird die Verwendung von Multi-Tip-Ultraschallsonden mit hohem Durchsatz dringend empfohlen. Beispiele finden Sie in der Materialtabelle.

Die Verwendung von Magnetkügelchen könnte die unspezifische Bindung verringern und das Verfahren weiter beschleunigen, wodurch die für die Waschschritte erforderliche Zeit reduziert wird. Die Verwendung von Vektoren mit kompatiblem Ursprung hat einen Vorteil gegenüber der polycistronischen Expression, da sie einen bequemen kombinatorischen Ansatz zum Testen mehrerer Proteininteraktionen mit demselben Ziel bieten und nicht für jede Kombination einen neuen Vektor erzeugen müssen.

Ein Nachteil der Methode ist die relativ hohe Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Ergebnisse, da Proteine in Bakterien in hohen Konzentrationen koexprimiert werden. Daher sollten unerwartete Wechselwirkungen, die mit dieser Methode entdeckt werden, mit Vorsicht behandelt und mit einem unabhängigen Assay getestet werden, wie z. B. dem Y2A oder zellulären Techniken²⁴, die ebenfalls die Koexpression ^3,11,28 verwenden. Bioinformatische Hochdurchsatzansätze können auch zur Analyse und Validierung komplexer Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke verwendet werden²⁹. Ein weiteres besonderes Hindernis besteht darin, dass Proteinkomplexe im Vergleich zu separaten Proteinen völlig unterschiedliche biochemische Eigenschaften aufweisen können. Der Komplex kann unlöslich sein, während seine Bestandteile in der Lösung vorhanden sind. Dieses Problem kann typischerweise gelöst werden, indem die Proteine mit dem entsprechenden Löslichkeitstag fusioniert werden. MBP ist am effektivsten, während NusA eine weitere gute Allround-Alternative²² ist. GST-Tag erwies sich bei vielen Zink-koordinierenden Domänen als effizient, obwohl es bei der Arbeit mit oligomeren Domänen vermieden werden sollte, da es dimer ist. Im Gegensatz dazu funktionieren kleine monomere Domänen wie Thioredoxin und SUMO gut mit multimeren Proteindomänen.

Kritische Schritte der beschriebenen Methode sind der richtige Zeitpunkt der Proteinexpression (eine kürzere Zeit ist erforderlich, wenn eine unspezifische Bindung beobachtet wird, während längere Inkubationszeiten erforderlich sein können, um eine schlechte Proteinexpression zu verbessern), ein schneller Zellaufschluss, die richtige Wahl der Puffer und die Aufrechterhaltung der konstanten Temperatur während des Protokolls. Übermäßige Inkubationszeiten nach der Induktion können zu einer Proteinaggregation in Bakterien führen, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Auf der anderen Seite benötigen einige Proteine mehr Zeit, um in ausreichenden Mengen exprimiert zu werden. Temperaturschwankungen während der Beschallungs- und Waschschritte können zu Änderungen des pH-Werts des Puffers und der Proteinausfällung führen. Eine unsachgemäße Pufferwahl kann auch zu einer unspezifischen Proteinaggregation führen.

Im Falle einer schlechten Proteinexpression sollten verschiedene Löslichkeitsmarkierungen sowie eine erhöhte Inkubationszeit nach der Induktion versucht werden. Wenn eine starke unspezifische Assoziation beobachtet wird, sollten alle notwendigen Negativkontrollen durchgeführt werden, um die mögliche unspezifische Assoziation von Proteinen mit dem Harz oder dem Affinitätstag zu bestimmen. Falls die Steuerelemente nicht funktionieren, sollten verschiedene Kombinationen von Affinitäts-Tags ausprobiert und verschiedene Puffer verwendet werden. Viele Proteine neigen dazu, unspezifisch an die in diesem Artikel erwähnten metallchelatbildenden harzartigen ZADs zu binden; In solchen Fällen wäre ein MBP/GST-Pulldown im Allgemeinen ohne ein reziprokes Experiment, das nur zur Kontrolle der Proteinexpression verwendet werden kann, ausreichend. Wenn Negativkontrollen gut funktionieren, sollte die Proteinexpressionszeit verringert und das Puffersystem und das Reduktionsmittel geändert oder die Reduktionsmittelkonzentration erhöht werden, insbesondere bei der Arbeit mit Cystein-reichen Proteinen. Bei schlechter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sollte auf den Zellaufschlussschritt geachtet werden, der schnell, aber ohne Überhitzung durchgeführt werden sollte. Die Temperatur sollte während des gesamten Experiments überwacht werden.

Diese Methode kann leicht modifiziert werden, um Multiproteinkomplexe oder Ribonukleoproteine zu untersuchen. Eine weitere mögliche Anwendung ist die Chargenprüfung der Proteinkomplexexpression und der Aufreinigungsbedingungen für nachfolgende Studien.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Diese Arbeit wurde durch die Projekte 19-74-30026 (Methodenentwicklung und -validierung) und 19-74-10099 (Protein-Protein-Interaktionsassays) der Russischen Wissenschaftsstiftung unterstützt. und vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation-Zuschuss 075-15-2019-1661 (Analyse repräsentativer Protein-Protein-Wechselwirkungen).