Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Neutronenradiographie und Computertomographie biologischer Proben unter Verwendung eines Hochfluss-Isotopenreaktors (HFIR) CG-1D-Beamlines zur Messung eines Metallimplantats in einem Rattenoberschenkelknochen, einer Mauslunge und einem krautigen Pflanzenwurzel-/Bodensystem.

Neutronen wurden in der Vergangenheit für eine breite Palette biologischer Anwendungen verwendet, bei denen Techniken wie Neutronenkleinwinkelstreuung, Neutronenspinecho, Beugung und inelastische Streuung zum Einsatz kamen. Im Gegensatz zu Neutronenstreutechniken, die Informationen im reziproken Raum erhalten, misst die auf Abschwächung basierende Neutronenbildgebung ein Signal im realen Raum, das in der Größenordnung von zehn Mikrometern aufgelöst ist. Das Prinzip der Neutronenbildgebung folgt dem Beer-Lambert-Gesetz und basiert auf der Messung der Neutronenabschwächung durch eine Probe. Eine stärkere Dämpfung weisen einige leichte Elemente (vor allem Wasserstoff) auf, die Hauptbestandteile biologischer Proben sind. Kontrastmittel wie Deuterium-, Gadolinium- oder Lithiumverbindungen können verwendet werden, um den Kontrast auf ähnliche Weise zu verbessern, wie dies in der medizinischen Bildgebung der Fall ist, einschließlich Techniken wie optischer Bildgebung, Magnetresonanztomographie, Röntgenstrahlen und Positronen-Emissions-Tomographie. Für biologische Systeme werden Neutronenradiographie und Computertomographie zunehmend eingesetzt, um die Komplexität des unterirdischen Wurzelnetzwerks von Pflanzen, seine Wechselwirkung mit Böden und die Dynamik des Wasserflusses in situ zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Bemühungen, Kontrastdetails in Tierproben, wie Weichteilen und Knochen, zu verstehen, untersucht. Dieses Manuskript konzentriert sich auf die Fortschritte in der Neutronenbiobildgebung, wie z. B. Probenvorbereitung, Instrumentierung, Datenerfassungsstrategie und Datenanalyse mit der CG-1D-Neutronenbildgebungs-Beamline des Hochflussisotopenreaktors. Die genannten Fähigkeiten werden anhand einer Auswahl von Beispielen aus der Pflanzenphysiologie (krautiges Pflanzen-Wurzel-Boden-System) und biomedizinischen Anwendungen (Ratten-Femur und Mauslunge) veranschaulicht.

Das Prinzip der Neutronenradiographie (nR) beruht auf der Abschwächung von Neutronen durch die Materie, die sie durchqueren. Im Gegensatz zu Röntgenstrahlen, die von der Elektronenwolke eines Atoms gestreut werden, können Neutronen von seinem Atomkern absorbiert oder gestreut werden. Neutronen sind empfindlich gegenüber leichten Elementen wie Wasserstoff (H) und können daher zur Röntgenaufnahme biologischer Anwendungen wie Tier 1,2,3,4,5,6,7 oder menschlichem Gewebe ^8,9 und unterirdischen Boden-/Wurzelsystemen 10,11,12,13,14 verwendet werden ^,15. Die Neutronenbildgebung ist eine komplementäre Technik zur Röntgenbildgebung, die in der Lage ist, schwere Elemente zu detektieren^16,17,18. Die dämpfungsbasierte nR wird durch die linearen Dämpfungskoeffizienten der Materialien innerhalb der Probe und durch die Dicke der Probe bestimmt, wie sie durch das Beer-Lambert-Gesetz beschrieben wird, das besagt, dass der transmittierte Strahl direkt proportional zur Materialmenge und der Weglänge durch das Material ist. Somit kann der Transmissionsgrad T wie folgt berechnet werden:

(1)

wobei I ₀ bzw. I die einfallenden bzw. transmittierten Strahlintensitäten sind; μ und x sind der lineare Abschwächungskoeffizient bzw. die Dicke einer homogenen Probe. Der Dämpfungskoeffizient μ ist gegeben durch:

(2)

wobei σ der Neutronendämpfungsquerschnitt der Probe (sowohl Streuung als auch Absorption), ρ ihre Dichte, N_A die Avogadro-Zahl und M ihre Molmasse ist.

Der Kontrast in der Radiographie biologischer Proben mit niederenergetischen Neutronen (d. h. Energien unter 0,5 eV) ist hauptsächlich auf eine Änderung der Dichte von H (für eine feste Probendicke) zurückzuführen. Dies liegt an der Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung eines Neutrons mit dem H-Kern, die größer ist als bei anderen Kernen, die in biologischen Proben vorhanden sind, und an der Tatsache, dass die Dichte des H-Atoms von größter Bedeutung ist, da es das am häufigsten vorkommende Atom in biologischen Proben ist.

Seit ihren Anfängen werden die nR- und Neutronen-Computertomographie (nCT) in großem Umfang für Materialien und technische Anwendungen eingesetzt 19,20,21,22,23. Die ersten Demonstrationsexperimente zur Neutronenempfindlichkeit gegenüber H in biologischen Proben begannen Mitte der 1950er Jahre²⁴ mit den Messungen von Pflanzenproben. Die Arbeit wurde bis in die 1960er Jahre fortgesetzt, z. B. mit der Röntgenaufnahme einer menschlichen Brust²⁵ oder einer Ratte²⁶, in der der Einsatz von Kontrastmitteln wie Gadoliniumoxid (Gd₂O₃) erforscht wurde. Darüber hinaus wurde die Hypothese aufgestellt, dass der Kontrast zwischen menschlichem Tumorgewebe und normalem Gewebe auf einen lokalen Anstieg des H-Gehalts zurückzuführen ist. Während dieser ersten Versuche kam man zu dem Schluss, dass ein erhöhter Neutronenfluss und eine höhere räumliche Auflösung die Qualität von nR verbessern und wahrscheinlich seine Popularität als ergänzende Technik für industrielle oder biomedizinische Anwendungen erhöhen würden. Die jüngsten Studien umfassen nR- und nCT-Messungen an Krebsgewebeproben¹ und Schnitten tierischer Organe ^2,3,27 für biomedizinische und forensische Anwendungen.

Der High Flux Isotope Reactor (HFIR) befindet sich am Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee, und ist eine leistungsstarke Neutronenquelle, die Neutronen durch Spaltreaktion erzeugt. Diese Neutronen haben Energien in der Größenordnung von 2 MeV und werden im Reaktorbecken durch kinetische Reaktionen mit schwerem Wasser "gekühlt", um Energien in der Größenordnung von 100-300 eV zu erreichen. Die Optimierung eines Neutronenexperiments, ob Streuung oder Bildgebung, beginnt mit dem Verständnis der Eigenschaften der Neutronenquelle und der Strahllinie wie ihrer Strahlintensität, Energieverteilung und der Wirkung des Hintergrunds (schnelle Neutronen, verzögerte Neutronen, Gammastrahlen). In der HFIR-Kälteleithalle, in der sich die abbildende Beamline befindet, werden die Neutronen durch kinetische Wechselwirkungen mit einem flüssigen H-Moderator weiter "gekühlt". Sie werden dann in einem gekrümmten Leitsystem von der Sichtlinie der Quelle weg transportiert, wodurch schnelle Neutronen und Gamma-Verschmutzung eliminiert werden. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ist die CG-1D-Neutronenabbildungsstrahllinie^28,29 auf einer kalten Führung platziert, was bedeutet, dass der Neutronenenergiebereich von einigen meV bis zu einigen Dutzend eV variiert (in diesem Fall reicht die entsprechende nutzbare Neutronenwellenlänge von ^0,8 bis 10 Å) mit einem Fluss im Bereich von 10⁷ n/(^cm2∙s) an der Probenposition. Ein motorisiertes Blenden-/Diffusorsystem definiert die Lochblendengeometrie des Bildgebungsinstruments. Neutronen legen eine Strecke von 6,59 m in einem mit Helium (He) gefüllten Flugrohr mit Aluminiumfenstern (Al) an jedem Ende zurück. Flugröhren werden verwendet, um Neutronen zu transportieren und gleichzeitig die Luftstreuung so zu begrenzen, dass der Verlust der Strahlintensität minimal ist. Für die in diesem Manuskript beschriebenen Messungen besteht der Diffusor aus einem 1 mm dicken 50 nm Aluminiumoxid (_Al2O₃) Nanopulver, das in einem Al-Behälter eingeschlossen ist. Der Diffusor reduziert die vom Neutronenleiter ausgehenden Strahlartefakte (die durch die Lochblendengeometrie einer abbildenden Strahllinie vergrößert werden), da sonst scharfe horizontale und vertikale Intensitätsschwankungen im Röntgenbild sichtbar sind und die Normalisierung der Daten schwierig wird.   Für die hier dargestellten Experimente werden Neutronen mit einem 25 μm dicken Lithium-6-Fluorid/Zinksulfid-Phosphor (⁶LiF/ZnS:Ag) in Licht umgewandelt.

Die Kollimationsoptimierung hängt von der Position der Probe zum Detektor, der erforderlichen räumlichen Auflösung und der Erfassungszeit ab. Wenn die Probe einige Zentimeter vom Szintillator entfernt sitzt, führen hohe Kollimationen (L/D über 800, wobei L der Abstand von der Lochblende des Durchmessers D und des Detektors ist) zu einer besseren räumlichen Auflösung auf Kosten des Neutronenflusses. Eine niedrige Kollimation (L/D unter 800) ist für dynamische In-situ-Studien vorzuziehen, bei denen die Zeitauflösung die räumliche Auflösung überwiegt. Für die in diesem Manuskript beschriebenen Messungen betrug L/D und räumliche Auflösung etwa 355 bzw. 75 μm. Die zeitliche Auflösung variierte je nach Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Die Probe wurde so nah wie möglich am Szintillator positioniert, um geometrische Verzerrungen wie Unschärfen zu reduzieren. Translations- und Rotationstische stehen zur Verfügung, um die Probe in die Nähe der Detektoren zu bringen und eine Computertomographie (CT) durchzuführen. CG-1D bietet drei Arten von Detektoren: ein ladungsgekoppeltes Gerät (CCD) mit 2048 Pixeln x 2048 Pixeln mit einem Pixelabstand von 13,5 μm, einen wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiter (sCMOS)-Detektor mit 2560 Pixeln x 2160 Pixeln mit einem Pixelabstand von 6,5 μm und einen Micro-Channel-Plate-Detektor (MCP)^30,31 mit 512 Pixeln x 512 Pixeln mit einer Pixelgröße von 55 μm. Gestreute Neutronen werden mit ~5 mm dickem Borkautschuk absorbiert, um den Detektorchip vor Neutronen zu schützen. Diese Absorption erzeugt Gammastrahlen, die durch Blei (Pb) gestoppt werden können, das zwischen dem Borkautschuk und dem Detektor platziert wird. Jeder Detektor ist für ein anderes Sichtfeld (FOV) sowie für räumliche und zeitliche Auflösungen optimiert. Für die Messungen des Oberschenkelknochens der Ratte und der Lunge der Maus wurde der CCD-Detektor aufgrund seines großen Sichtfelds (~ 7 cm x 7 cm) und seiner angemessenen räumlichen Auflösung von ca. 75 μm verwendet. Die nCT des Wurzel-Boden-Systems der Pflanze wurde mit dem sCMOS durchgeführt, da das Ziel darin bestand, nCTs so schnell wie möglich auf Kosten des FOV (das auf ~ 5 cm x 4,2 cm begrenzt war) zu erhalten. Die räumliche Auflösung hat also offensichtlich gelitten. In diesen Detektoren werden Neutronen zu Detektionszwecken entweder in Licht oder ein Alpha-Teilchen umgewandelt. Die Drehung der Probe um ihre vertikale Achse und die Aufnahme von Röntgenaufnahmen bei aufeinanderfolgenden Drehwinkeln ermöglicht die Aufnahme von nCT. Das 3-dimensionale volumetrisch gerenderte Modell der untersuchten Probe wird durch die Verwendung des hauseigenen iMARS3D-Python-basierten Jupyter-FBP-Notebooks (Filtered-Back-Projection), pyMBIR oder einer kommerziellen Software erhalten, die im Folgenden beschrieben wird.

Schließlich werden Neutronen, die nicht mit der Probe oder dem Detektor interagiert haben, in einer Strahlstoppposition ca. 1 m stromabwärts des Detektorsystems gesammelt, um das Hintergrundrauschen zu minimieren. Der Strahlanschlag CG-1D ist 0,75 m breit, 0,5 m hoch und 35 mm dick und besteht aus B₄C in Epoxidharz. Der Strahlanschlag ist mit 10 mm 95% angereichertem Lithiumcarbonat (6 Li₂CO₃) in einem feuerfesten Epoxidharz verstärkt, wo der Neutronenstrahl auftrifft, mit einem Hohlraum, der mit ⁶Li, Blei (Pb) und Stahl ausgekleidet ist, um die hohe Rate der sekundären Gammastrahlen einzudämmen. Der Trägeranschlag wird direkt an der Stahlabschirmwand des Strahlrohrs befestigt. Ein Foto des CG-1D-Strahlrohrs ist in Abbildung 2 dargestellt.

Es wurden jeweils drei Rekonstruktionsprogramme verwendet, um die drei experimentellen Daten in 3D zu rekonstruieren. Die Rekonstruktion der Lungenprobe der Maus wurde mit Octopus³² durchgeführt, einer kommerziellen Rekonstruktionssoftware, die FBP verwendet. Die Octopus-Software befindet sich auf einem Server-PC und kann verwendet werden, um die an der Beamline gesammelten Daten zu rekonstruieren. Eine Rekonstruktionssoftware namens iMARS3D ist unter CG-1D verfügbar. Es basiert auf dem Open-Source-Code TomoPY³³ mit zusätzlichen Funktionen wie automatischer Neigungskorrektur, Nachbearbeitungsfiltern usw. iMARS3D umfasst die Vorverarbeitung der Daten (Subtraktion des Hintergrunds und des Rauschens), das Zuschneiden, die Medianfilterung (zur Korrektur von Gammaschlägen und toten Pixeln), die automatische Korrektur von Schwankungen der Strahlintensität und die Korrektur der Probenneigung. Sobald Sinogramme erstellt sind, ist eine weitere Datenverarbeitung wie das Entfernen von Ringartefakten und das Glätten möglich. Die verschiedenen Schritte der Rekonstruktion werden auf dem Analyseserver gespeichert (und später in den freigegebenen Vorschlagsordner verschoben), während die endgültigen 2D-Schichten sofort im freigegebenen Vorschlagsordner gespeichert werden. Der Oberschenkelknochen der Ratte wurde mit iMARS3D rekonstruiert. Die Pflanzenwurzel-/Bodenprobe wurde durch Medianfilterung der Daten mit TomoPY vorverarbeitet, gefolgt von einer Neigungsachsenkorrektur mit der SciPy-Bibliothek von Python.  Die Rekonstruktion wurde unter Verwendung eines intern entwickelten Python-Pakets mit dem Namen pyMBIR (erstellt unter Verwendung von Kernen aus der ASTRA-Toolbox³⁴) durchgeführt, das eine Reihe von tomographischen Algorithmen vom Basis-FBP bis hin zu fortgeschrittenen modellbasierten iterativen Rekonstruktionstechniken³⁵ implementiert, die qualitativ hochwertige Rekonstruktionen aus extrem spärlichen und verrauschten Neutronendatensätzen erhalten können. Alle gerenderten Volumina, die auf den oben genannten Rekonstruktionswerkzeugen basieren, werden im Dämpfungskontrast dargestellt. Die gesamte Visualisierung erfolgte mit dem kommerziellen Visualisierungs-, Segmentierungs- und Datenanalyse-Softwarepaket AMIRA³⁶.

Ziel dieses Manuskripts ist es, das Verfahren der Neutronenbildgebung (nR und nCT) an der HFIR CG-1D-Beamline zu demonstrieren. Diese Studie veranschaulicht auch den aktuellen Stand der Technik der nR- und nCT-Fähigkeiten für biologische Proben, insbesondere für eine Mauslunge, einen Rattenknochen und pflanzliche Wurzel-/Bodensysteme. Die Mauslunge wurde ausgewählt, um die Komplementarität von Neutronen zur Messung des Lungengewebes zu veranschaulichen, während Röntgenstrahlen hauptsächlich empfindlich für Knochen sind. Die Knochenprobe, ein Oberschenkelknochen einer Ratte, war mit einem Titan (Ti)-Implantat versehen, was den Kontrast zwischen Knochen und Metall veranschaulichte und die Möglichkeit bot, die Grenzfläche zwischen Knochen und Metall zu sehen (die mit Röntgenstrahlen schwer zu messen ist, da Metalle sie stark abschwächen⁴). Schließlich veranschaulicht das Pflanzen-Wurzel-Wassersystem die dreidimensionale (3D) Fähigkeit von nCT, Wurzel-/Bodensysteme in situ zu messen. Darüber hinaus werden die Vor- und Nachteile der Verwendung von nR für biologische Proben aufgezeigt. Offensichtlich kann diese Methode sicher verwendet werden, um die Wasserdynamik in einem Pflanzen-Wurzel-System zu messen, kann aber aufgrund der mit der Strahlenbelastung verbundenen Risiken nicht als lebendes Tier- oder menschliches Bildgebungsverfahren betrachtet werden, so dass Studien entweder auf (tote) Mäuse oder pathologieähnliche Messungen beschränkt sind, bei denen beispielsweise eine Gewebeprobe von einem Patienten (Tier oder Mensch) entnommen und durch Fixierung präpariert wird, bevor sie in einem Neutronenstrahl gemessen wird.

1. Geräteeinrichtung (siehe Abbildung 3, Abschnitt 3)

1. Öffnen Sie auf dem Beamline-Computer ein Terminalfenster, geben Sie css ein, und drücken Sie dann die Eingabetaste , um die Benutzeroberfläche zu starten.
2. Wenn diese Option nicht standardmäßig geöffnet ist, wählen Sie auf der Registerkarte Menü die Option Benutzerstartseite, um die Bildgebungsschnittstelle für Experimentalphysik und industrielles Steuerungssystem (EPICS) zu öffnen.
3. Wählen Sie auf der ersten Registerkarte (genannt Vorschlag/Kamera/ SE-Gerät) der Benutzeroberfläche die Beamline-Optik aus, indem Sie auf die Schaltfläche Optik neben Kamera/Detektoren klicken, d.h. die Lochblendenöffnungsgröße und die Öffnung des Spaltsystems durch Klicken auf die Schaltfläche Schlitze .
4. Schrauben Sie den Rotationstisch auf die XY-Tische, auf denen die Probe platziert werden soll, und positionieren Sie den Detektor (sCMOS oder CCD).
   1. Wählen Sie für den CCD oder den sCMOS-Detektor in Absprache mit dem Geräteteam das Objektiv mit der gewünschten Vergrößerung aus, die die gewünschte räumliche Auflösung und Brennweite bietet. Fokussieren Sie die Kamera zuerst mit Licht, indem Sie den Detektor entweder näher oder weiter vom Spiegel wegbewegen oder das Objektiv manuell auf eine feste Detektorposition einstellen. Fokussieren Sie das Bild auf die Stelle des Neutronenszenzillators.
   2. Für den CCD- oder den sCMOS-Detektor ist die Feinabstimmung des Linsenfokus mit Neutronen unter Verwendung einer neutronenabsorbierenden Auflösungsmaske³⁷ vorzunehmen, die gegen den Detektorszintillator angebracht ist. Erfassen Sie aufeinanderfolgende Röntgenbilder mit unterschiedlichen Einstellungen (d. h. unterschiedliche Detektorpositionen vom Spiegel, die durch Bewegen des Detektormotors in EPIC automatisiert werden).
   3. Vergleichen Sie Röntgenaufnahmen, indem Sie Linienpaare in ImageJ/Fiji³⁹ oder einer ähnlichen Bildsoftware auswerten.
5. Befestigen Sie die Probe gegebenenfalls in einem geeigneten Behälter (Al-Behälter und/oder Al-Schwerlastfolie) und platzieren Sie die Probe so nah wie möglich am Detektor auf dem Rotationstisch. Schirmen Sie den Detektor und die Ausrüstung mit Neutronen- (Borkautschuk) und Gamma-Abschirmung (Pb-Ziegel) ab.
6. Messen Sie den Abstand zwischen Probe und Detektor und entnehmen Sie die Probe. Ersetzen Sie sie durch die Auflösungsmaske, um die Pixelgröße an der Abtastposition in dieser Beamline-Konfiguration auszuwerten. Werten Sie anhand einer bekannten Feature-Dimension die Anzahl der Pixel im Feature aus, um die Pixelgröße zu bestimmen.
7. Positionieren Sie die Probe auf dem Rotationstisch neu.
8. Richten Sie die Probe mithilfe der EPICS-Schnittstelle und der Registerkarte "Probe ausrichten " auf den Neutronenstrahl aus, indem Sie aufeinanderfolgende schnelle (ms bis 1 s) Röntgenaufnahmen machen, während sich die Probe bewegt, bis sie vollständig vom Detektor aus sichtbar ist. Speichern Sie die Probenausrichtungsdatei als .csv Datei, die vor dem Start des CT-Scans wiederverwendet wird.
9. Bevor Sie mit dem CT-Scan beginnen, verwenden Sie die Option "Automatische CT-Ausrichtungsprüfung " (auf der Registerkarte "Ausrichtung "), um zu überprüfen, ob die Probe in verschiedenen Winkeln im Sichtfeld bleibt, indem Sie Röntgenbilder bewerten, die in unterschiedlichen Probenausrichtungen mit dem Strahl erstellt werden.

2. Probenvorbereitung und Datenerfassungsstrategie

HINWEIS: Die Tierprobenprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Tennessee für die Mauslunge und dem Rush University Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee für den Oberschenkelknochen der Ratte genehmigt.

1. Oberschenkelknochen der Ratte
   1. Implantieren Sie Ti₆Al₄V-Stäbe (1,5 mm Durchmesser und 15 mm Länge) in die Femure männlicher Sprague-Dawley-Ratten und platzieren Sie sie durch die distalen Femurkondylen im intramedullären Raum.
   2. Opfern Sie die Ratten nach 12 Wochen und ernten Sie die Oberschenkelknochen. Entfernen Sie sämtliches Weichgewebe (das zur Neutronendämpfung beiträgt) und frieren Sie die Oberschenkelknochen mit Implantaten in salzhaltiger Gaze ein. Tauchen Sie 2-Zoll-Mullschwämme mit quadratischer Gaze vollständig in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein und wickeln Sie jede Probe vollständig in diese getränkten Schwämme ein (siehe Materialtabelle).
   3. Tauen Sie die Oberschenkelknochen für röntgenbasierte Mikro-CT-Scans³⁸ auf Raumtemperatur auf, bevor Sie sie in gefrorenem Zustand zum HFIR transportieren.
      1. Tauen Sie die Probe vor der nCT wieder auf und bringen Sie sie im HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2)-Labor in der Nähe der CG-1D-Neutronenbildgebungs-Beamline auf Raumtemperatur. Sobald die Probe Raumtemperatur erreicht hat, wickeln Sie sie in strapazierfähige Al-Folie ein und legen Sie sie in einen Al-Zylinder.
      2. Positionieren Sie den Zylinder senkrecht auf dem Rotationstisch an der Beamline und scannen Sie den Femur an der Beamline bei Raumtemperatur von 0 bis 360° mit einem Schrittwinkel von 0,25°. Erfassen Sie jedes Röntgenbild für 50 Sekunden.
         HINWEIS: Unter Berücksichtigung der Totzeit für die Bewegung des Rotationstisches und die Übertragung jedes Röntgenbildes vom CCD zum Datenerfassungscomputer betrug die Gesamtzeit des Scans ca. 24 Stunden.
   4. Sobald die nCT abgeschlossen ist und die Probe aus der Beamline entnommen werden darf, bringen Sie die Probe zurück in das BSL2-Labor, entfernen Sie das Containment und frieren Sie die Probe wieder ein, um sie für weitere experimentelle Messungen zu konservieren.
2. Lungen von Mäusen
   1. Resektion von Lungengewebe aus einer toten Maus, die für Experimente verwendet wurde, die nichts mit dieser Studie zu tun haben. Fixieren Sie die Probe vor den Neutronenexperimenten in einer Lösung aus 70%igem Ethanol.
   2. Wickeln Sie das Gewebe in strapazierfähige Al-Folie ein und transportieren Sie es vom BSL2-Labor direkt zur CG-1D-Beamline. Legen Sie die Probe in einen Al-Zylinder ein, um sie doppelt einzuschließen und die Probenposition im Strahl während des nCT-Scans beizubehalten.
   3. Positionieren Sie die Probe in der Nähe des CCD und führen Sie den Scan über Nacht bei Raumtemperatur durch.
      HINWEIS: Jede Röntgenaufnahme betrug 150 s und der Drehschrittwinkel betrug 0,5°, von 0 bis 182°. Die Gesamtzeit für den Scan betrug ca. 16 h.
3. Krautiges Wurzel-/Bodensystem
   HINWEIS: Wie bei anderen biologischen Proben sind Pflanzen-Boden-Systeme aufgrund der starken Abschwächung von Wasserstoff, insbesondere Wasser im Boden oder in den Pflanzenwurzeln, in ihrer Größe begrenzt. Samen oder Ramets können in Gefäße gepflanzt werden (Al oder Quarz - beide mit niedrigen Neutronendämpfungsquerschnitten), oder eine reifere Pflanze kann in einen Behälter verpflanzt werden.
   1. Graben Sie vorsichtig aus und verpflanzen Sie ein lokales Kraut, das vor Ort wächst (hier Maulbeerkraut (Fatoua villosa (Thunb.) Nakai) in einen Al-Behälter mit einem Querschnitt von 2,38 cm x 2,58 cm, einer Höhe von 6,3 cm, einer Wandstärke von 0,055 cm und reinem Sand (_SiO2) gefüllt.
   2. Spülen Sie die Pflanzenwurzeln mit deionisiertem Wasser ab und stellen Sie sie vorsichtig im Al-Behälter aus, während Sie den Behälter mit einer Aufschlämmung aus nassem Sand füllen.
      Anmerkungen: Beim Befüllen von Behältern mit Erde ist es wichtig, nasse Erde zu verwenden, da sich trockene Erde nach Partikelgröße trennt und Texturartefakte in den Behältern^{erzeugt 12,13}.
   3. Messen Sie nach dem Pflanzen das gesättigte Gewicht des Pflanzensystems und wiegen Sie das Pflanzensystem jeden Tag, um den Wasserverbrauch zu beurteilen. Tragen Sie Wasser entweder auf die Oberseite der Erde oder durch einen Anschluss oder ein Loch am Boden des Behälters mit einem Schlauch oder einer Spritze auf.
      HINWEIS: Hier wurde das Pflanzensystem auf eine Waage gelegt und jeden Tag Wasser auf die Oberseite aufgetragen, um den täglichen Wasserverbrauch auf der Grundlage des Gewichts zu ersetzen. Das Wasser kann vor der Bildgebung zurückgehalten werden, um den Wassergehalt des Bodens zu verringern und den Kontrast in den Wurzeln zu erhöhen.
   4. Vermehren Sie das Pflanzensystem in einer Wachstumskammer vor Ort mit kontrollierter Temperatur und Licht¹². Bewahren Sie das Pflanzensystem vor der Bildgebung 1 Woche lang auf, damit sich die Pflanzenwurzeln an den Al-Behälter gewöhnen können.
      Anmerkungen: Sobald die Bildgebung beginnt, gießen Sie die Pflanze nicht.
   5. Führen Sie die nCT-Scans jeweils in ~1,75 h durch und scannen Sie kontinuierlich über einen Zeitraum von 2,5 Tagen, um dynamische 3D-Veränderungen des Boden- und Pflanzenwassergehalts abzubilden. Verringern Sie für diese Messungen die räumliche Auflösung auf einige hundert μm zugunsten der Zeitauflösung (d. h. schnellere Erfassungszeit für jede Projektion).
      HINWEIS: Jeder CT-Scan wurde mit einem Drehwinkel von 0,93° und einer Aufnahmezeit von 10 s pro Projektion durchgeführt. Für dieses Manuskript wird nur der erste CT-Scan vorgelegt.

3. Datenerfassung

HINWEIS: Das Datenerfassungssystem bei CG-1D verwendet die EPICS-Software⁴⁰. EPICS wurde entwickelt, um das experimentelle Protokoll zu leiten und menschliche Fehler zu minimieren. Diese Schnittstelle führt die verschiedenen erforderlichen Schritte vor dem Messen einer Probe logisch durch, wie in Abbildung 3 dargestellt.  Das EPICS-Datenerfassungsprotokoll sieht wie folgt aus (Abbildung 3). Der linke Abschnitt enthält den Status des laufenden Experiments sowie motorische Positionen und Experimentdetails (Probeninformationen, Vorschlagsnummer und Teammitglieder). Jedes Experiment ist mit einer Vorschlagsnummer und einer oder mehreren Stichproben verknüpft. Vorschlagsinformationen wie Teammitglieder und ausgewählte Beispielnamen sind ebenfalls auf der rechten Seite verfügbar (erste Registerkarte mit dem Namen "Vorschlag/Kamera/Beispielumgebungsgerät"). Der mittlere Teil umfasste das aktuelle Röntgenbild mit einer seitlichen Skala für den Dynamikbereich sowie Status- und Protokollinformationen unterhalb des Bildes.

1. Wählen Sie die erste EPICS-Registerkarte mit dem Titel Proposal/Camera/SE Device (Vorschlag/Kamera/SE-Gerät) aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Vorschlag oder Muster wechseln. Wählen Sie die Projektnummer und die Stichproben-ID# aus, die in der Liste der Vorschläge (links) und der Stichprobe (rechts) gemessen werden sollen, die die vorherige Registerkarte ersetzt haben.
2. Verwenden Sie den Zurück-Pfeil , um zur EPICS-Hauptschnittstelle zurückzukehren. Wählen Sie den zu verwendenden Detektor (sCMOS oder CCD) aus, indem Sie einen der vier verfügbaren Detektoren (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD oder MCP) in der Optionsliste Kamera/Detektor auswählen.
   HINWEIS: Der SBIG-CCD wird zum Testen durch das Gerät verwendet und kann für das vorliegende Manuskript ignoriert werden.
3. Wählen Sie die Rotationsstufe aus, die im Abschnitt " Sample Environment Device" verwendet werden soll.
   1. Klicken Sie zunächst auf Rotationstisch (CT-Scan) in der Liste Sample Environment Device . Wählen Sie dann eine der Rotationsstufen aus (die der zu scannenden Probe entspricht).
4. Wählen Sie schließlich unten auf der Registerkarte den Datenerfassungsmodus aus. Wählen Sie in diesem Fall die erste Option, White Beam.
   HINWEIS: Der Aufnahmemodus ist entweder ein weißer Strahl (der den gesamten Bereich der Neutronenwellenlänge einnimmt) oder monochromatisch an der CG-1D-Strahllinie.
5. Wählen Sie die zweite EPICS-Registerkarte mit dem Titel Probe ausrichten. Geben Sie einen Beispieldateinamen ein, und drücken Sie die Eingabetaste. Wiederholen Sie den Vorgang für den Namen des Unterordners.
   HINWEIS: Die EPICS-Schnittstelle ist so programmiert, dass sie automatisch Daten in den richtigen experimentellen Verzeichnissen speichert, die die hauseigene Rekonstruktionssoftware verwendet, um 2-dimensionale (2D) Schichten des zu untersuchenden 3D-Objekts zu erstellen. Die zweite Registerkarte, Probe ausrichten, ermöglicht die Ausrichtung der Probe anhand von Röntgenaufnahmen, die nur wenige Sekunden dauern, da diese Röntgenaufnahmen später nicht für die Datenverarbeitung und -analyse verwendet werden. Sobald alle Motoren richtig positioniert sind, können ihre Positionen in einem .csv Dateiformat gespeichert werden. Daher verfügt jede Probenausrichtung über eine entsprechende .csv Datei, die aufgerufen werden kann, um die Proben zu einem späteren Zeitpunkt für CT-Scans zu positionieren.
6. Überspringen Sie die Ausrichtung der drei Motoren, d. h. gehen Sie davon aus, dass die Probe ausgerichtet und bereit für die CT ist. Wählen Sie eine gewünschte Aufnahmezeit aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Schnellbilder aufnehmen . Sammeln Sie eine Reihe von Röntgenbildern mit unterschiedlichen Erfassungszeiten, um das SNR zu bewerten.
8. Wenn mehrere Samples auf dem XY-Tisch eingestellt sind (mehrere Rotationsstufen, jeder für ein Sample), zeichnen Sie jede Sample-Position nach dem Alignment auf und speichern Sie die Daten als .cvs-Datei, indem Sie auf die Schaltfläche In einer Datei speichern klicken.
9. Wählen Sie die dritte EPICS-Registerkarte mit dem Titel Daten erfassen , um die CT-Scan-Parameter einzurichten. Geben Sie einen Dateinamen in die erste beschreibbare Zeile ein, und drücken Sie die Eingabetaste. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Namen des Unterordners.
   HINWEIS: Das Layout der Registerkarte " Daten erfassen" hängt von der Auswahl einer Reihe von Röntgenaufnahmen (keine SE) oder CT-Scans (Auswahl einer Rotationsstufe) auf der ersten Registerkarte ab.
10. Wählen Sie im Abschnitt "Sample mit gespeicherter Datei ausrichten " die Datei aus, in der zuvor die Positionen des Sample-Motors aufgezeichnet wurden (Schritt 1.8). Verwenden Sie die zuletzt gespeicherten Dateien , um die zuletzt gespeicherten Beispielausrichtungsdateien zu durchsuchen. Klicken Sie auf Mit Datei ausrichten , um die Probe wieder in Position im Neutronenstrahl zu bringen.
11. Berechnen Sie die Anzahl der Projektionen, die für den CT erforderlich sind, basierend auf dem Sampling-Theorem von Nyquist. Berechnen Sie die Anzahl der Pixel über die horizontale Dimension der Stichprobe und multiplizieren Sie sie mit 1,5, um die Anzahl der Projektionen zu erhalten, die zum Ausführen der Nyquist-Stichprobe erforderlich sind.
12. Geben Sie den Rotationsstartwinkel (in der Regel 0°), den Rotationsendewinkel (normalerweise 180°), die Rotationsschrittgröße, die Anzahl der Bilder pro Schritt (normalerweise auf 1 eingestellt) und die Belichtungszeit für jedes Bild ein. Starten Sie den CT-Scan, indem Sie auf die Schaltfläche Daten sammeln klicken.

4. Volumenrekonstruktion und Datenverarbeitung/-analyse

HINWEIS: Alle CG-1D-Softwaretools für die Normalisierung, Rekonstruktion und Analyse von Daten sind im Python-Repository der ORNL-Einrichtung und auf den Analyseservern der Einrichtung verfügbar. Für 2D-Messungen kann die Vorverarbeitung mit Jupyter Python Notebooks⁴¹ erfolgen. Eine Abbildung eines Notizbuchs ist in Abbildung 4 dargestellt. Man kann ihre Daten laden und in der Vorschau anzeigen, bevor man einen Bereich von Interesse außerhalb der Probe auswählt, der verwendet wird, um jede Strahlfluktuation auf 1 (oder 100%) zu normalisieren. Diese Notizbücher können an jede Messung angepasst werden, was die Vorverarbeitung zu einem einfachen Aufwand macht. Darüber hinaus können 2D-Analysen im selben Notebook durchgeführt werden, z. B. kinetische Änderungen (d. h. die Wasseraufnahme in einer Probe) in einer Probe im Laufe der Zeit.

1. Melden Sie sich mit dem Benutzernamen und dem Kennwort am Linux-Analyseserver an. Öffnen Sie den Webbrowser und geben Sie jupyter.sns.gov ein.
2. Öffnen Sie das Python-Jupyter-Notebook mit dem Namen iMARS3D. Führen Sie die ersten Zeilen des Codes aus (der die zum Ausführen von iMARS3D erforderlichen Tools lädt). Laden Sie Daten, flache und dunkle Felder. Stellen Sie sicher, dass alle drei Datensätze ordnungsgemäß geladen sind.
3. Fahren Sie mit dem Zuschneiden der Daten, dem Filtern (nach Bedarf), der Normalisierung (mit automatischer Korrektur der Probenneigung) und der volumetrischen Rekonstruktion (ein langwieriger Prozess) fort. Speichern Sie die Daten im Projektnummernordner mit dem Namen Freigegeben. Nachdem Sie AMIRA³⁶ aktiviert haben, das auch auf den Anlagenanalyseservern verfügbar ist, laden Sie die rekonstruierten Schichten in die Software und fahren Sie mit der Visualisierung, weiteren Filterung und Analyse fort.

Abbildung 5A ist ein Foto eines repräsentativen Oberschenkelknochens einer Ratte von ähnlicher Größe wie der gemessene; Abbildung 5B,C stellt die nCT des Oberschenkelknochens einer Ratte mit dem Ti-Implantat dar. Abbildung 5B zeigt die auf Falschfarbendämpfung basierende nCT des Femurs, während Abbildung 5C einen diagonalen Schnitt durch den Knochen mit der gleichen Ausrichtung wie in Abbildung 5B darstellt, um das Ti-Implantat (in Graustufen) zu enthüllen, das einem medizinischen Röntgen-CT ähnelt. Dieses Implantat interagiert nicht so stark mit Neutronen wie das Knochenmaterial; Daher ist seine Dämpfung minimal und er erscheint dunkler (d. h. weniger dämpfend) als der umgebende Knochen. Trabekelknochen, der sich im Markraum des Femurs befindet, ist am proximalen Ende der Probe deutlich sichtbar (rote Pfeile in Abbildung 5B).

Abbildung 6A,B zeigt repräsentative Fotografien der ethanolfixierten Mauslunge in zwei verschiedenen Positionen, die für die nCT verwendet werden, um die Fähigkeit von Neutronen zum Nachweis von Weichteilproben zu demonstrieren. Das rekonstruierte Volumen der Mauslunge, das aus nCT gewonnen wurde, ist in Abbildung 6C,D dargestellt, die in ähnlicher Weise wie Abbildung 6A,B positioniert ist. Ein Schnitt durch den rechten Lungenlappen ist in Abbildung 6E dargestellt. Trotz der relativ geringen Größe der Probe wird die Neutronensensitivität durch den Nachweis der Struktur der Lunge mit einer räumlichen Auflösung von ~75 μm deutlich demonstriert. Wie erwartet, ist der Dämpfungsbereich recht breit, wobei ein großer Teil einer niedrigen bis mittleren Neutronendämpfung entspricht, da die Lunge eine schwammartige Struktur hat, die Luft enthält.

Abbildung 7A zeigt ein Foto der Pflanzenprobe, während Abbildung 7B die volumetrische Falschfarbenwiedergabe des Wurzel-Boden-Systems der Pflanze in einem rechteckigen Al-Behälter darstellt (der nicht sichtbar ist, da Al für Neutronen größtenteils transparent ist). Im Vergleich zu den bisherigen Datensätzen ist das SNR erwartungsgemäß schlechter, da die Daten schneller erfasst wurden, um die dynamischen Bewegungen der Wasseraufnahme in der Wurzel in 3D über 2,5 Tage zu verfolgen. Daher wurde jeder CT-Scan so optimiert, dass er innerhalb eines Zeitfensters von ~1,75 h gemessen werden kann. Trotz des schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses ist das Wurzelsystem im Boden in den vertikalen Schnitten der in Abbildung 7C,D in Falschfarben dargestellten Probe deutlich sichtbar.

Abbildung 1: Schematische Zeichnung der HFIR CG-1D Neutronen-Imaging-Beamline. Der Abbildungsstrahl wird durch das Blendensystem definiert, das eine Kegelstrahlgeometrie definiert. Der Strahl wird über ein He-gefülltes Flugrohr mit Strahlabstreifern transportiert, um unerwünschte Streuneutronen zu entfernen. Eine geborgene Gummiauskleidung im Inneren des Flugrohrs verringert den Hintergrund benachbarter Strahlrohre. Abkürzungen: HFIR = High Flux Isotope Reactor; Er = Helium; L = Abstand von der Lochblende des Durchmessers D und des Detektors. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Die CG-1D-Neutronenbildgebungsanlage am High-Flux-Isotopenreaktor. Das Foto zeigt von rechts nach links die Flugröhren, den Probenbereich und den Strahlanschlag. Der Neutronenstrahl kommt von der rechten Seite des Fotos. Das Flugrohr wurde von den wissenschaftlichen und industriellen Forschungsgemeinschaften, die das Instrument verwenden, signiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: EPICS-Schnittstelle. Die Benutzeroberfläche des CG-1D EPICS ist in drei Bereiche unterteilt: den Statusbereich (links), den Anzeigebereich (in diesem Beispiel eine rohe Röntgenaufnahme einer nautischen Sonnenuhr aus Messing) und die Parametereingabe für die 2D- und 3D-Bildgebung. Abkürzungen: EPICS = Experimental Physics and Industrial Control System; 2D = zweidimensional; 3D = dreidimensional. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Ein Screenshot eines Jupyter-Notebooks. Dieses Notizbuch wird verwendet, um eine Vorschau einer Reihe von Röntgenbildern anzuzeigen, bevor sie normalisiert werden. In diesem Beispiel wird die gleiche nautische Sonnenuhr aus Messing visualisiert, die in Abbildung 3 gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Oberschenkelknochen der Ratte mit Titanimplantat. (A) Foto eines repräsentativen Oberschenkelknochens der Ratte. (B) 3D-gerendertes Volumen des Femurs der Ratte, das mit nCT gewonnen wurde. (C) Diagonale Scheibe, die den Titanstab im Femur zeigt. Rote Pfeile zeigen den trabekulären Knochen. Die Maßstabsleisten werden durch die x- bzw. y-Achse dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: nCT der Mauslunge. (A) und (B) Repräsentative Fotografien der Mauslunge. (C) und (D) Dämpfungsbasiertes 3D-gerendertes Volumen der Maus mit der gleichen Positionierung wie (A) und (B). (E) Repräsentativer Schnitt durch den rechten Lappen der Mauslunge (D), der eine Lungenstruktur zeigt, die mit einem anderen Gradienten der Neutronendämpfung (meist geringe Dämpfung) erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Neutronen-Computertomographie und Schnitte durch das Wurzel-Boden-System der Pflanze . (A) Foto der Pflanzenprobe. (B) 3D-gerendertes Volumen aus der Neutronen-Computertomographie der Pflanze, die den oberirdischen Stamm und das Bodensystem mit Wasser (in rot) zeigt. (C) und (D) werden schräg durch die Probe geschnitten, um den Stamm und die Wurzeln im Boden zu zeigen (rote Pfeile). Dunklere blaue Bereiche im Boden deuten auf das Vorhandensein von Wasser hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Neutronenröntgen und CT biologischer Proben sind vielversprechende bildgebende Verfahren, die die Röntgenbildgebung oder die Magnetresonanztomographie ergänzen. Die entscheidenden Schritte bei der Durchführung eines Neutronenbildgebungsexperiments einer biologischen Probe beziehen sich auf ihre Präparation und ihren Einschluss an der Beamline. Die Optimierung eines Experiments wird durch die zu beantwortende wissenschaftliche Fragestellung vorangetrieben. Wenn die wissenschaftliche Fragestellung eine hohe räumliche Auflösung erfordert, um ein Phänomen zu beobachten, dann sind lange Aufnahmezeiten erforderlich, und der Nachteil der nCT (mit cm-großem Sichtfeld) besteht darin, dass es Stunden dauert, einen Scan durchzuführen. Dies ist vor allem auf den Unterschied im gesamten Neutronenfluss zurückzuführen, der an einem Reaktor im Vergleich zu einer Synchrotronquelle verfügbar ist, wo Röntgen-CT-Scans Sekunden bis Minuten für ein Sichtfeld von wenigen mm² dauern können. Obwohl die Methode auf Ex-vivo-Gewebeproben angewendet werden kann, die von Tieren entnommen wurden, kann sie in vivo aufgrund des Strahlenexpositionsrisikos (z. B. Gammastrahlen, die von Neutronen erzeugt werden, und Neutronenwechselwirkungen mit den Atomen in der Probe) nicht auf lebende Tiere oder Menschen ausgedehnt werden. Es eignet sich jedoch gut für die Abbildung von Interaktionen zwischen Pflanzenwurzeln und Boden (Abbildung 7), wie z. B. der Dynamik der Wasseraufnahme.

Der Vorteil der schnellen nCT für die Pflanzendynamik ist die Empfindlichkeit gegenüber H im Wasser und das Fehlen von Strahlenschäden an der Pflanze, im Gegensatz zur Röntgen-CT. Darüber hinaus kann ein einzigartiger Kontrast durch die Verwendung von Neutronen in Knochen-Metall-Proben wie einem Ratten-Femur beobachtet werden, bei dem das Metall im Vergleich zum umgebenden Gewebe relativ transparent ist (Abbildung 5), wodurch möglicherweise Metallartefakte vermieden werden, die durch Röntgen-CT³⁹ induziert werden. Tierische Gewebe, wie z. B. die Lunge der Maus (Abbildung 6), zeigen einen beeindruckenden Nachweis der Weichteilstruktur, da Neutronen empfindlich auf H reagieren, aber die räumliche Auflösung ist bei diesen Messungen etwas der limitierende Faktor. Der Kontrast wird durch die in biologischen Proben vorhandenen H-Atome gewährleistet^19,39.

Mit den Fortschritten neuartiger Techniken wie der Neutronengitterinterferometrie und der Verbesserung der räumlichen Auflösung (einige Mikrometer wurden kürzlich berichtet^42,43) könnte die Neutronenbildgebung noch neue Kontrastmechanismen für biologische Gewebe mit verbesserter räumlicher Auflösung bieten. Die Erforschung von Neutronen höherer Energie (um die Messung dicker Proben zu ermöglichen) verspricht auch die Möglichkeit, größere Ausschnitte eines tierischen Gewebes wie einer intakten Maus zu vermessen und bietet damit noch neue Möglichkeiten für die biomedizinische Forschung.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Ein Teil dieser Forschung nutzte Ressourcen des Hochfluss-Isotopenreaktors, der vom ORNL betrieben und vom U.S. Department of Energy, Office of Science, User Facilities, im Rahmen des Vertrags DE-AC05-00OR22725 mit UT-Battelle, LLC gesponsert wurde. Ein Teil dieser Forschung wurde vom ORNL durch das Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship-Programm unterstützt. Diese Forschung wurde auch vom DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research gesponsert. Die Oberschenkelproben von Ratten stammen aus Experimenten, die in Zusammenarbeit mit Dr. Rick Sumner am Rush University Medical Center mit Mitteln des NIH (R01AR066562) und des Orthopedic Research and Education Foundation-Smith and Nephew Award durchgeführt wurden. Das Team bedankt sich bei den HFIR-Support-Teams, die die Nutzung der Strahlrohre zur Neutronenstreuung ermöglichen.