Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Genetische Code-Erweiterung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um unnatürliche Aminosäuren (UAAs) in Proteine einzuführen, um ihre Eigenschaften zu verändern, um neue Proteinfunktionen zu untersuchen oder zu schaffen oder um Zugang zu Proteinkonjugaten zu haben. Stop Codon Suppression, insbesondere Bernstein Codon Unterdrückung, hat sich als die beliebteste Methode zur genetischen Einführung von UAAs an definierten Positionen. Diese Methode wird hierin auf die Herstellung eines Trägerproteins angewendet, das eine UAA enthält, die eine bioorthogonale funktionelle Gruppe beherbergt. Dieser reaktive Griff kann als nächstes verwendet werden, um ein synthetisches Oligosaccharid-Hapten gezielt und effizient zu transplantieren, um einen homogenen Glykonojugate-Impfstoff bereitzustellen. Das Protokoll beschränkt sich auf die Synthese von Glykonokjugaten in einem 1:1 Kohlenhydrat-Hapten-/Trägerproteinverhältnis, ist aber für zahlreiche Paare biorthogonaler funktioneller Gruppen geeignet. Die Homogenität von Glycococonjuggate-Impfstoffen ist ein wichtiges Kriterium, um eine vollständige physikalisch-chemische Charakterisierung zu gewährleisten und damit immer anspruchsvollere Empfehlungen der Arzneimittelregulierungsbehörde zu erfüllen, ein Kriterium, das durch klassische Konjugationsstrategien nicht erfüllt wird. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll eine feinabgestimmte Abstimmung der Struktur des tatsächlichen Konjugatimpfstoffs, wodurch Instrumente zur Bewältigung von Struktur-Immunogenitäts-Beziehungen entstehen.

Glycoconjugate-Impfstoffe sind wesentliche Bestandteile des Impfstoffarsenals, das für die prophylaktische Behandlung von Infektionskrankheiten zur Verfügung steht. Sie sind sicher, gut verträglich und effizient in einer breiten Altersgruppe, einschließlich Kleinkindern. Sie bieten den optimalen Schutz gegen Infektionen, die durch gekapselte Bakterien wie Meningokokken, Pneumokokken oder Haemophilus influenzae Typ b¹verursacht werden. Glycococonjugate-Impfstoffe bestehen aus gereinigten bakteriellen Polysacchariden, die die Kapseln von Bakterien oder synthetischen Oligosacchariden bilden, die diese oberflächenausgedrückten Polysaccharide²imitieren, die kovalent mit einem Trägerprotein verbunden sind. Das Vorhandensein eines Trägerproteins ist wichtig, um schützende humorale Immunantworten zu fördern, die gegen die antigene Determinante gerichtet sind, die durch die Kohlenhydrat-Antigene 3 ausgedrückt^wird. Abgesehen von einer sorgfältigen Selektion und Produktion des Kohlenhydratantigens sind die Merkmale, von denen bekannt ist, dass sie einen Einfluss auf die Wirksamkeit eines Glykonojugate-Impfstoffs ausüben,: die Art des Trägerproteins, die Konjugationschemie (einschließlich der Art und der Länge des Linkers, wenn sie verwendet werden) oder das Saccharid-Protein-Verhältnis³. Offensichtlich sind die Positionen, an denen das Saccharid mit dem Protein konjugiert wird, sowie die Anzahl der Konnektivitätspunkte für die Immunogenität relevant. Bis heute wurden diese beiden Parameter kaum untersucht, da die Herstellung der Glykonokjugate weitgehend empirisch bleibt. Ihre Synthese beruht in der Regel auf der Verwendung von Amin- oder Carbonsäurefunktionen von Lysin bzw. Aspartidazu/Glutaminsäure-Seitenkettenrückständen, die in der Trägerproteinsequenz vorhanden sind. Dies führt nicht zu einer einzigen, sondern zu einer heterogenen Mischung von Glykonokjugaten.

Das Spielen auf die Reaktivität, Zugänglichkeit oder Verteilung der Aminosäurerückstände im Protein führt zu stärker definierten Glykonokonjugaten, die zuverlässiger sind, um die Wirkung von Saccharid/Protein-Konnektivität zu dokumentieren⁴. Ein Schritt in Richtung dieses Ziels kann durch den Einsatz der Protein-Glykan-Kopplungstechnologie erreicht werden, einem rekombinanten Verfahren, das die Herstellung von kontrollierten Glykonojugat-Impfstoffen in Zellfabriken^5,6ermöglicht. Die Glykosylierung erfolgt jedoch ausschließlich bei einem Asparaginrückstand innerhalb von D/EXNYS/T-Sequonen (wobei X aus den 20 natürlichen Aminosäuren besteht), die nicht natürlich auf den Trägerproteinen vorhanden sind.

Standortselektive Mutagenese und insbesondere die Einbeziehung von Cysteins zur Ausnutzung ihrer hochgradig selektiven Reaktivität erscheint als Alternative^7,8. Die Herstellung von Trägerproteinen, die UAAs in ihrer Sequenz enthalten, kann noch mehr Flexibilität für die homogene Glykonojugat-Impfstoffzubereitung bieten. Mehr als 100 UAAs wurden entwickelt und in verschiedene Proteine^9,10integriert. Viele von ihnen enthalten bioorthogonale Funktionen, die in der Regel verwendet werden, um post-translationale Modifikationen^{durchzuführen 11} oder biophysikalische Sonden¹² oder Medikamente¹³ zu transplantieren, die aber ideale Griffe für die weitere Konjugation mit Kohlenhydratantigenen sind. Erfolgreiche Beispiele wurden von Biotech¹⁴ mit zellfreier Proteinsynthese¹⁵ behauptet, aber die Herstellung von Glykonojugate-Impfstoffen nach dieser Strategie wartet immer noch darauf, populär zu werden.

Die Anwendung der In-vivo-Strategie für die Herstellung von mutiertem Trägerprotein erfordert eine modifizierte translationale Maschinerie, die ein bestimmtes Codon, eine tRNA zur Erkennung des Codons und eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) umfasst, die speziell die Übertragung der UAA auf die tRNA katalysiert (Abbildung 1)¹⁶. Die Pyrrolysin Bernstein Stop Codon Unterdrückung ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um UAA zu integrieren, insbesondere das Propargyl-Lysin (PrK)¹⁷. Letztere können wiederum mit azido-funktionalisierten Kohlenhydrathapten reagieren, um vollständig definierte, homogene Glycococonjugate zu liefern. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir, wie man das Propargyl-L-Lysin, ein UAA mit einem Alkyngriff, synthetisiert, wie man es während seiner Übersetzung in ein Zielprotein in ein Bakterium einbaut und schließlich, wie man die Konjugation zwischen dem modifizierten Protein und einem Hapten, der eine Azidfunktion trägt, mittels Klickchemie durchführt.

1. Synthese der UAA: Propargyllysin (PrK)

1. Synthese von N^α-Boc-Propargyl-Lysin¹⁸
   1. 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) in einer Mischung aus wässrigen 1 M NaOH (5 ml) und THF (5 ml) in einem Kolben auflösen und den Kolben mit einem Siliziumseptum befestigen.
   2. Kühlen Sie den Kolben in einem Eisbad ab und fügen Sie dann 158 L Propargylchloroforat (1,62 mmol) tropfenweise (über einen Zeitraum von 2-3 min) mit einer Mikrospritze unter Rühren hinzu.
   3. Erwärmen Sie die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur und rühren Sie 10 h weiter.
   4. Abkühlen von Lösungen von 50 ml Diethylether, 50 ml wässriger 1 M Salzsäure und 60 ml Ethylacetat in einem Eisbad.
   5. Kühlen Sie das rohe Reaktionsgemisch in einem Eisbad und gießen Sie es in einen Trenntrichter. Extrahieren Sie die Mischung mit 50 ml Diethylether. Entsorgen Sie die organische Schicht.
   6. Vorsichtig wässrig 1 M Salzsäure in die wässrige Phase im Trenntrichter geben. Dann extrahieren Sie die wässrige Schicht zweimal mit 30 ml Ethylacetat. Überprüfen Sie das Vorhandensein von N-Boc-Propargyl-Lysin in der organischen Phase durch TLC mit CH₂Cl₂-methanol (9:1) als Eluent.
   7. Trocknen Sie die kombinierten organischen Schichten über MgSO₄, filtern Sie die Festphase ab und konzentrieren Sie das Filtrat unter reduziertem Druck auf einen Rotationsverdampfer.
   8. Lösen Sie eine Probe des rohölöligen N^α-Boc-Propargyl-Lysin in deuteriertem Chloroform (CDCl₃) und kontrollieren Sie seine Identität durch ¹H NMR.
      VORSICHT: Die Extraktion kann zu einer Druckbildung führen. Lösen Sie häufig Druckaufbau.
2. Synthese der unnatürlichen Aminosäure Propargyl-L-Lysin (PrK)
   1. N ^α-Boc-Propargyl-Lysin in einem runden Bodenkolben einführen, der mit einem Septum ausgestattet ist.
   2. 4 ml wasserfreies Dichlormethan (CH₂Cl₂) in den Kolben unter Argon geben, um den N-α-Boc-Propargyl-Lysinaufzulösen.
   3. 4 ml Trifluoressigsäure (TFA) tropfenweise unter Rühren mit einer Spritze hinzufügen.
   4. Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 1 h bei RT. Überwachen Sie die Reaktion von TLC mit CH₂Cl₂-methanol (9:1) als Eluent.
   5. Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck.
   6. Den Rohresten den Rthylether hinzufügen und bei 4 °C für 1 h inkubieren, um den PrK auszufällen. Wenn der PrK nicht vollständig ausgefällt wird, trituieren Sie bei höherer Skala, um ihn auszufällen und die Inkubationszeit bei Bedarf zu verlängern.
   7. Filtern Sie den PrK in Form eines weißen Festkörpers auf einem Fritted-Glas.
   8. Lösen Sie ein Aliquot des PrK in D₂O auf. Führen Sie dann NMR-Analysen durch, um ihre Identität und Reinheit zu kontrollieren.
   9. Zur weiteren Verwendung die unnatürliche Aminosäure PrK in destilliertem Wasser in einer Endkonzentration von 100 mM auflösen und bei -20 °C als 1 ml Aliquots lagern.

2. Herstellung des durch PrK modifizierten rekombinanten Proteins

1. Plasmid-Präparation
   1. Konstruieren Sie ein Expressionplasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH), das das Ziel-Reife-Pneumokokken-Oberflächenadhesin-A-Gen (pET24d-mPsaA-WT) enthält, gefolgt von einer Proteasesequenz des Tobacco Etch Virus (TEV), indem die Proteasesequenz zwischen bamHI und XhoI-Restriktionsstellen der PET24-Plasmid-Plasmen-Prämonie kloniert wird. Dies wird ein His₆ Tag am C-Terminus des Proteins einführen. Ersetzen Sie das Codon von Lysin-32 durch das Bernsteincodon (TAG) mit konventioneller, ortsgerichteter Mutagenese-Technik.
   2. Konstruieren Sie ein zweites Expressionsplasmid (pEVOL-MmPylRS), das zwei Kopien des Gens enthält, das für die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase aus Methanosarcina mazei (MmPylRS) und das Gen kodiert für den entsprechenden tRNA^Pyr, wie zuvor beschrieben¹⁹. Verwenden Sie diesen speziell entwickelten Plasmidvektor pEVOL für die effiziente Integration von UAAs.
      HINWEIS: Die detaillierten Plasmid-Informationen sind in der Ergänzenden Akte 1beschrieben.
2. Ko-Transformation von Plasmiden in den Expressionsstamm
   1. Tauen Sie eine 100 L aliquot der chemisch kompetenten Escherichia coli BL21(DE3) auf Eis für 5 min.
   2. Fügen Sie 1 l von jedem Plasmid (jeweils 50-100 ng) in die Zellen und inkubieren für 30 min auf Eis.
   3. Übertragen Sie das 1,5 ml Mikrorohr mit den aufgetauten, kompetenten Zellen bei 42 °C bei 45 s und bewegen Sie es dann für 2 min wieder auf Eis.
   4. Fügen Sie 900 l LB-Medium hinzu und brüten Sie unter Schütteln für 1 h bei 37 °C, um eine antibiotische Expression zu ermöglichen. Dann die Bakterien auf LB-Agar mit 25 g/ml Kanamycin und 30 g/ml Chloramphenicol aufteilen. Bakterienwachstum über Nacht bei 37 °C zulassen.
3. Expression von Proteinen, die mit PrK modifiziert wurden
   1. Inokulieren Sie eine einzelne kotransformierte Kolonie in 5 ml LB-Medium mit Antibiotika (25 g/ml Kanamycin und 30 g/ml Chloramphenicol). Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln inkubieren.
   2. Die Primärkultur (5 ml) in 500 ml Autoinduktionsmedium mit Antibiotika, 0,02 % L-Arabinose und 1 mM der unnatürlichen Aminosäure PrK verdünnen und bei 37 °C für 24 h mit Schütteln inkubieren. Schließen Sie eine negative Kontrolle ein, indem Sie die Kultur ohne PrK parallel und eine positive Kontrolle durchführen, indem Sie die Kultur eines Klons ausführen, der das Wt-Protein enthält.
   3. Aliquot 5 ml aus dem 500 ml Kulturmedium und Zentrifuge für 10 min bei 5.000 x g. Den Überstand entsorgen und bei -20 °C einfrieren. Erntezellen aus den restlichen 495 ml durch Zentrifugation für 10 min bei 5.000 x g. Den Überstand entsorgen und bei -20 °C einfrieren.
4. Analysieren von Rohzellextrakten aus den 5 ml Kulturproben nach SDS-PAGE und Western Blot-Analyse
   1. 5 ml Zellpellets in 250 l Lysepuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM Imidazol, 0,2 mM PMSF) wieder aufsetzen und in ein 1,5 ml Mikrorohr übertragen.
   2. Lyse Zellen durch Einfrieren der Rohre in flüssigen Stickstoff, auftauen in einem 42 °C Bad und Wirbel nxte bei hoher Geschwindigkeit für 30 s. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
   3. Zentrifugenproben bei 17.000 x g für 10 min, um Zellablagerungen zu beseitigen.
   4. Nehmen Sie 10 l des Überstandes und fügen Sie 5 l Wasser und 5 l Ladepuffer (Bromphenolblau, SDS, β-Mercaptoethanol) hinzu. Die Proben 5 min bei 100 °C erhitzen und SDS-PAGE- und Western Blot-Analysen durchführen.
5. Proteinreinigung durch Gravitationsfluss-Bench-Affinitätschromatographie mit Nickel-NTA-Perlen
   1. Die Zellpellets (aus der 495 ml-Kultur) in 20 ml Lysepuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM Imidazol, 0,2 mM PMSF) wieder aufsetzen.
   2. Fügen Sie 5 l DNase I (1 mg/ml) und 500 l Lysozym (50 mg/ml) in die Suspension ein und lassen Sie die Lyse durch Inkubation der Suspension bei 37 °C während 30 min.
   3. Beschallen Sie die Zellen während 5 min (Zyklen von 5 s-5 s, Amplitude 50%) und entfernen Sie dann die Zellablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 30 min, gefolgt von Filtration auf 0,45 m Filter.
   4. Ni-NTA-Harz in die Suspension geben (500 l für 500 ml Zellkultur) und bei 4 °C für 1 h sanft mischen.
   5. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und sammeln Sie den ungebundenen Bruch.
   6. Waschen Sie das Harz mit 10 ml Waschpuffer mit 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol. Waschen Sie das Harz ein zweites Mal mit 5 ml Waschpuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 20 mM Imidazol). Sammeln Sie die Waschfraktionen.
   7. Elute das mit seiner Tätlichkeit versehene Protein mit 1 ml Elutionspuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 mM Imidazol). Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal und sammeln Sie alle Elutionsfraktionen.
   8. Analysieren Sie das rohe Lysat sowie die 7 Reinigungsfraktionen per SDS-PAGE auf einem 12% Acrylamidgel.
   9. Kombinieren Sie die Fraktionen, die reines His-tagged-Protein enthalten, und dialysieren Sie es gegen 1 L TEV-Proteasepuffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) über Nacht mit einer Dialysemembran (Cut-off MW 6000-8000 Da). Messen Sie die Konzentration des Proteins bei 280 nm mit einem molaren Aussterbekoeffizienten von 37 360 cm^-1-M^-1 und einem Molekulargewicht von 34,14 kDa für mPsaA.

3. Entfernung des Histidin-Tags durch TEV-Proteaseverdauung

1. Die Proteinprobe in ein 50 ml-Rohr einsammeln und DEN TEV-Puffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) bei einer Konzentration von 2 mg/ml hinzufügen.
   HINWEIS: Die Konzentration kann je nach früheren Ergebnissen variieren. Die von uns getesteten Proteinkonzentrationen liegen in einem typischen Bereich von 2-3 mg/ml.
2. Fügen Sie 100 l TEV-Protease hinzu (hinzufügen Sie 1 l mit 10 Einheiten TEV-Protease für 20 g Protein zu verdauen).
3. Fügen Sie 50 l von 0,1 M Dithiothreitol (DTT) hinzu.
4. Komplett mit TEV-Puffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) bis 5 ml.
5. Über Nacht bei 4 °C mit langsamem Schütteln inkubieren.
   HINWEIS: Wenn die Verdauung nicht abgeschlossen ist, fügen Sie mehr TEV-Protease hinzu, brüten Sie länger oder bei höheren Temperaturen bis zu 30 °C.
6. Dialyse das verdaute Protein, um EDTA bei 4 °C über Nacht mit einer Dialysemembran (Cut-off 6000-8000 Da) gegen Phosphatpuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 5 mM Imidazol) zu entfernen.
7. Um die TEV-Protease und das unverdaute Protein zu eliminieren, die Mischung mit Ni-NTA-Perlen inkubieren und bei 4 °C sanft 1 h mischen.
8. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule. Sammeln Sie die ungebundene Fraktion und waschen Sie die Säule mit 5 ml Waschpuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol)
   HINWEIS: Das Protein von Interesse sollte in den ungebundenen und Waschfraktionen zurückgewonnen werden.
9. Elute die TEV-Protease und das unverdaute Protein durch Zugabe von 5 ml Elutionspuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 mM Imidazol) auf der Säule. Überprüfen Sie die Fraktionen auf Proteingehalte bei 280 nm und durch SDS-PAGE-Analyse.
10. Überprüfen Sie die Effizienz der Verdauung, indem Sie verdaute Proben auf eine SDS-SEITE mit dem unverdautem Protein als Kontrolle laden.
11. Dialysieren Sie das verdaute Protein gegen 1 L Klickpuffer (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH8) bei 4 °C über Nacht mit einer Dialysemembran (Cut-off 6000-8000 Da), um Imidazol zu entfernen sowie den Puffer auszutauschen, und messen Sie die Konzentration des Proteins bei 280 nm mit molarem Extinktionskoeffizient und Molekulargewicht von mPsaA (37 360 cm^-1M^-1 und MW 34,14 kDa).

4. Bewertung der unnatürlichen Aminosäure Propargyl-Lysin Zugänglichkeit und Funktionalität für Klickchemie

HINWEIS: Konjugieren Sie die mPsaA mit 6-Hexachlor-Fluorescein-Azid mit dem Von Presolski et al.²⁰ beschriebenen Protokoll für Klickchemie.

1. Nehmen Sie 432,5 l PrK-mutiertes Protein in einer Konzentration von 57,8 m in ein 2 ml Mikrorohr.
   HINWEIS: Eine Mindestkonzentration von 2 M Alkyn ist akzeptabel. Wenn die Proteinkonzentration niedriger ist, konzentrieren Sie sie mit einem Zentrifugalkonzentrator oder bevorzugen Sie das Gleichgewicht der Reaktion durch Erhöhung des Azid-Alkyn-Molaren-Verhältnisses.
2. Fügen Sie 10 l von 5 mM 6-Hexachlor-Fluorescein-Azid hinzu und fügen Sie dann einen Vormix von 2,5 l CuSO_4-Lösung bei 20 mM und 7,5 l Tris(Benzyltriazolylmethyl)amin (THPTA) bei 50 mM (Lagerlösungskonzentrationen) hinzu.
   1. Fügen Sie 25 l wässriges 100 mM Aminoguanidinhydrochlorid hinzu.
   2. Fügen Sie 25 l von 20 mg/ml eine extemporisch zubereitete wässrige Lösung von Natriumascorbat hinzu.
   3. Schließen Sie das Rohr, mischen Sie durch mehrmalses Invertieren und inkubieren bei Raumtemperatur für 2 h.
   4. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 l von 0,5 M EDTA hinzufügen.
   5. Nehmen Sie 15 l des Reaktionsgemisches und legen Sie es ein Mikrorohr, fügen Sie 5 l Ladepuffer (Bromphenolblau, SDS, β-Mercaptoethanol) hinzu, erhitzen Sie das Gemisch bei 100 °C für 5 min und laden Sie es dann in ein 12% Acrylamid-Gel. Visualisieren Sie nach der Migration das fluoreszierende Konjugat auf dem Gel unter UV-Licht bei 312 nm.

5. Konjugation von mPsaA mit einem azido-funktionalisierten Kohlenhydratantigen (Pn14TS-N₃) durch Klick Chemie

1. Kupplung
   1. Nehmen Sie 432,5 l PrK-mutiertes Protein bei 57,8 m in ein 2 ml Mikrorohr.
   2. Fügen Sie 10 l von 5 mM Pn14TS-N₃²¹ in Wasser hinzu, und fügen Sie dann einen Vormix von 2,5 l CuSO_4-Lösung bei 20 mM und 7,5 l THPTA bei 50 mM hinzu.
      HINWEIS: Die Synthese von Pn14TS-N₃, einem Tetrasaccharid, das den Streptococcus pneumoniae Serotyp 14 kapselförmiges Polysaccharid imitiert, wurde in Referenz 21 beschrieben. Theoretisch kann jedes Kohlenhydratantigen verwendet werden, das eine Azidfunktion enthält.
   3. Fügen Sie 25 l von 100 mM Aminoguanidinhydrochlorid hinzu.
   4. Fügen Sie 25 l von 20 mg/ml extemporisch zubereitete wässrige Lösung von Natriumascorbat hinzu.
   5. Schließen Sie das Rohr, mischen Sie durch mehrmalses Invertieren und inkubieren Sie bei RT während 2 h.
   6. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 l von 0,5 M EDTA hinzufügen.
   7. Nehmen Sie 15 L Proben und analysieren Sie mit SDS-PAGE.
2. Gelfiltrationsreinigung des Glykonokjugatts
   1. Reinigen Sie das Glykonojugate, indem Sie es auf eine sterische Ausschlussagarosesäule (15 x 600 Bettabmessungen, 3.000-70.000 Fraktionierungsbereich) auftragen, gleichgläs mit 100 mM PBS-Puffer, pH 7,3 bei einem 0,8 ml/min-Durchfluss mit Detektion bei 280 nm.
   2. Sammeln Sie die Fraktionen, die das Glykonojugate enthalten.
      HINWEIS: Bei längerer Lagerung das Glykonojugate gegen 1 L_H2O zweimal für 2 h dialysieren und dann bei 4 °C mit Dialysemembran (Cut-off Mw 6000-8000 Da) über Nacht, dann gefriertrocken und das Glykonojugate bei -80 °C lagern.

In diesem Projekt wurde ein homogener Glykonojugat-Impfstoff mit der Bernstein-Stop-Codon-Unterdrückungsstrategie zur Einführung einer UAA an einem definierten Standort hergestellt (Abbildung 1). Pneumokokken-Oberflächenadhesin A wurde als Trägerprotein-Moiety ausgewählt. Dieses Protein ist hochkonserviert und wird durch alle Stämme von Streptococcus pneumoniae²²ausgedrückt. Es ist hoch immunogen und wurde zuvor als Träger in Pneumokokken-Impfstoffformulierungen^21,23verwendet. Als Proof-of-Concept wurde das UAA-Propargyl-Lysin, das vom wilden Typ Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS)/tRNA-Paar der Archaea Methanosarcina mazei effizient aufgeladen wurde, untersucht. Das Propargyllysin ist im Handel erhältlich, kann aber vorteilhafterweise aus Boc-L-Lysin in nur zwei synthetischen Schritten hergestellt werden (Abbildung 2). Ein Bernstein-Codon wurde an einer gewünschten Position in einem pET24d-Plasmid erzeugt, das das mPsaA-Gen enthält. Dieses Plasmid wurde mit einem pEVOL-Plasmid (ein freundliches Geschenk von Edward Lemke (EMBL¹⁹) mit orthogonalen Werkzeugen, die notwendig sind, um das Propargyllysin zu integrieren, in einen kompetenten E. coli BL21(DE3)-Stamm umgewandelt. Positive kotransformierte Klone wurden mit 25 g/ml Kanamycin und 30 g/ml Chloramphenicol ausgewählt. Das Plasmid pEVOL enthält ursprünglich nicht eine, sondern zwei Kopien des Gens, das für MmPylRS kodiert, um den Propargyl-Lysin-Rückstand zu integrieren: Die erste Kopie steht unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, während die Expression des anderen in Gegenwart von Arabinose induzierbar ist. Wir haben jedoch keine dramatische Abnahme der Propargyl-Lysin-Inkorporation festgestellt, wenn das MmPylRS-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors unterdrückt wird.

Das Propargyllysin wurde an Position 32 als Ersatz eines Lysins in der Nähe des N-Terminus der PsaA eingeführt. Rückstände mit einer oberflächenexponierten Seitenkette können im Hinblick auf eine weitere Konjugation praktisch ausgetauscht werden. Das mutierte Protein wurde in seiner reifen Form (mPsaA^K32PrK) mit der Aufnahme einer stimmbaren 6-Histidin-Tag-Sequenz an seinem C-Terminus hergestellt. Die Effizienz der mPsaA^{K32PrK-Produktion} wurde durch SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse mit einem Anti-Histidin-Tag-Antikörper überprüft, wenn das Wachstum in Gegenwart oder Abwesenheit des UAA-Propargyllysins und im Vergleich zur Produktion des Wildtyps mPsaA (Abbildung 3) durchgeführt wurde. Die Visualisierung ergab ein Proteinband mit einem erwarteten Molekulargewicht (Lanes 4, Abbildung 3A & 3B). Das Vorhandensein eines vollwertigen Proteins deutet stark auf die erfolgreiche Aufnahme des PrK in mPsaA hin. Die Intensität ist jedoch geringer als bei Wildtyp mPsaA (Lanes 2, Abbildung 3A & 3B). Leckage (d. h. Produktion des Voll-Längen-Proteins ohne Einbeziehung der UAA) und vorzeitige Freisetzung des Proteins durch den Trennfaktor RF1 während der Übersetzung sind zwei Hauptnachteile, die bei diesem Prozess häufig auftreten. Einerseits wird kein Band mit dem erwarteten Molekulargewicht in Ermangelung von Propargyllysin visualisiert, was bedeutet, dass keine Leckage aufgetreten ist (Lanes 3, Abbildung 3A & 3B) und indirekt bestätigt, dass das auf Lanes 4 beobachtete Band mPsaA^K32PrKentspricht. Andererseits ist bei niedrigem Molekulargewicht kein Band zu sehen, das der abgeschnittenen Form von mPsaA entsprechen könnte (Lane 4 auf Abbildung 3A). Das mPsaA^K32PrK wurde dann durch Affinitätschromatographie mit einer typischen Ausbeute von 8 mg/L (im Vergleich zu 12-20 mg/L für das Wildtypprotein) gereinigt und die Aufnahme des Propargyl-Lysin-Rückstandes wurde schließlich durch Massenspektrometrie bestätigt(Abbildung 4). Das Histidin-Tag wurde bei proteolytischer Spaltung mit TEV-Protease entfernt (Abbildung 4). Die so erhaltene Stabilität des mPsaA^K32PrK wurde durch kreisförmigen Dichroismus beurteilt, der zeigte, dass die Struktur des Proteins nicht durch die Mutation des Lysins 32 zu einem Propargyl-Lysin gestört wurde (Daten nicht dargestellt).

Mit dem mPsaA^K32PrKwurde die Reaktivität des Alkyns für die Klickchemie mit einem azido-funktionalisierten Fluorescein bewertet und weiter verwendet, um ein synthetisches Oligosaccharid-Antigen β-2-Azidoethyl zu konjugieren. d-Galp-(1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (Abbildung 5). Dieses Tetrasaccharid ist mit dem S. pneumoniae Typ 14 kapselförmiges Polysaccharid verwandt und wurde zuvor mit mPsaA unter Verwendung verschiedener Konjugationschemikalien^8,21,24konjugiert. Hier wurden Experimente im Vergleich zu Wildtyp mPsaA als Kontrolle durchgeführt. Das Histidin-Tag wurde zuerst bei proteolytischer Spaltung mit der TEV-Protease entfernt. Die verdauten mPsaA^K32PrK und mPsaA WT wurden dann mit der Fluorsonde konjugiert (Abbildung 6A) oder Pn14TS (Abbildung 6B). Die Reaktion wurde von SDS-PAGE bewertet. Der geringe Anstieg des Molekulargewichts der Probe zwischen Bahn 6 und 7 (Abbildung 6B) deutet auf eine erfolgreiche Konjugation mit dem Tetrasaccharid Pn14TS hin. Schließlich wurde das Glykonojugate durch Gelfiltration gereinigt und seine Identität durch Massenspektrometrie bestätigt (Abbildung 6C). Die Konjugation durch Klickchemie quantitativ die Mehrheit der mPsaA^K32PrK wurde mit dem Pn14TS-N₃ konjugiert, wie durch die Massenspektrometrie Ergebnisse dargestellt (Abbildung 6C).

Abbildung 1: Aufnahme von Propargyllysin (PrK) in mPsaA während der Translation mit einem orthogonalen Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase/tRNA-Paar und TAG-Codon-Umwidmung²⁵. Während der Translation katalysieren endogene Synthetasen die Verbindung zwischen Aminosäuren und entsprechenden tRNAs. Dann werden geladene tRNAs von der ribosomalen Maschineverwendet, um das neosynthetisierte Polypeptid zu erzeugen. Gemäß der Bernstein-Stop-Codon-Unterdrückungsstrategie lädt eine orthogonale Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) (hierin eine Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase von M. mazei), eine UAA (hier in PrK) auf ihre cognate tRNA, die Antikodon entwickelt hat, das Bernstein-Stop-Codon (TAG) auf der mRNA ablesen. Diese spezifische Anerkennung leitet die Einbeziehung der UAA in die spezifische Stelle auf dem Zielprotein. Abbildung reproduziert von Wang et al.²⁵. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Propargyl-Lysin-Synthese. (A) Schritte der Propargyl-Lysin-Synthese. Insert: Überwachung des Deschutzes von Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH-Zwischenprodukt: Dünnschichtchromatographie auf 0,25 mm Kieselgelplatten mit Fluoreszenzanzeige (GF254) und visualisiert durch Verkohlung mit Vanillin in Schwefelsäure/Ethanol (1,5:95 v/v); Eluent: CH₂Cl₂/MeOH (9:1), linke Spur: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH (R_f 0.90), rechter Fahrstreifen: Rohpropargyllysin, (R_f 0.38). 400 MHz ¹H (B) und ¹³C NMR Spektren (C) von Propargyllysin in D₂O aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analyse von Rohzellproben. (A) SDS-PAGE-Analyse und (B) Western Blot-Analyse an Rohzellproben. Spur 1: ungefärbter Proteinmarker; Lane 2: Rohzellextrakt des wilden Typs mPsaA; Spur 3: Rohzellextrakt von mPsaA^K32TAG in Abwesenheit von PrK angebaut; Spur 4: Rohzellextraktion von mPsaA^K32TAG in Gegenwart von PrK angebaut. Bedingungen: 12% Acrylamid-Gel, läuft bei 100 V, 2 h. SDS-PAGE von Coomassie blau gefärbt; Western Blot enthüllte die Verwendung von Antihistidin-Tag-Antikörpern und sekundären Antikörpern in Verbindung mit AlexaFluor680. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Histidin-Tag-Entfernung und Massenspektrometrie-Analyse. (A) SDS-PAGE Analyse. Spur 1: ungefärbter Proteinmarker; Lane 2: Rohzellextrakt; Spur 3: ungebundener Bruch; Spur 4: Waschfraktion mit 10 mM Imidazol; Spur 5: Waschfraktion mit 20 mM Imidazol; Bedingungen: 12% Acrylamid-Gel mit 100 V für 2 h, und gefärbt von Coomassie blau; (B) MALDI-TOF-MS spektra von (top) mPsaA WT, theoretisch MW 33 103 Da, gefunden 33 106 Da und (unten) mPsaA K32PrK, theoretisch 33 184 Da, gefunden 33 192 Da. Die gefundenen Massen befinden sich innerhalb des erwarteten Margin-Fehlers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Konjugationsstrategie durch Klicken auf Chemie. Ein einzelnes Tetrasaccharid, das ein Azid trägt, ist speziell an seine komplementäre biorthogonale Alkyne-Gruppe auf mPsaA K32PrK gekoppelt (mPsaA-Vertretung basierend auf der 1PSZ-PDB-Datei, mit einer Auflösung von 2,0 bis²⁶). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Histidin-Tag-Verdauung und Konjugation von mPsaA mit (A) Fluorescein-N₃ und mit (B) Pn14TS. (A) SDS-PAGE Lanes 1-3: WT mPsaA; Spur 4-6: mPsaA^K32PrK; (B) Lane 1: ungefärbter Proteinmarker; Spur 2-4: WT mPsaA; Spur 5-7: mPsaA^K32PrK. 2 g Proteinprobe/Lane, 12% Acrylamid, 100 V, 2 h; (C) MALDI-TOF-MS Spektren der Pn14TS-mPsaA^K32PrK theoretisch MW 34 091 Da, gefunden 34 088 Da. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Die standortgesteuerte Mutagenese ist eine einfache Strategie, um spezifische Aminosäuren an einer definierten Position eines Proteins zu integrieren, das kaum verwendet wird, um Glykonojugate-Impfstoffe^7,8,14herzustellen. Die klassische Mutagenese auf Basis des 20 natürlichen Aminosäureansatzes ist hocheffizient, da keine Modifikation des Übersetzungsrechners erforderlich ist. Cysteinmutationen sind in der Regel darauf ausgerichtet, die einzigartige Thiol-Reaktivität entweder direkt oder in zwei Schritten weiter zu erforschen(z.B.nach ihrer Modifikation in ein Dehydroalanin-Zwischenprodukt, eine Strategie namens posttranslationale Mutagenese)^27,28. Genetische Code-Erweiterung ist vielleicht noch attraktiver und flexibler, da sie die direkte Integration einer breiten Palette von UAAs mit verschiedenen Funktionalitäten^{ermöglicht 9,10}. Während mehrere UAAs gleichzeitig in ein Protein²⁹integriert werden können, ist die Anzahl der Mutationen in der Regel begrenzter. Wir haben hierin die zugehörige Bernstein-Stop-Codon-Strategie angewendet, um ein einzelnes Propargyl-Lysin in ein Trägerprotein einzuführen. Die Einarbeitung kann an jeder beliebigen Position erfolgen, sofern die Seitenkette der ursprünglichen Aminosäure oberflächenexponiert ist, ein Kriterium, das leicht aus kristallographischen Röntgenstrukturen oder in der Silico-Modellierung bestimmt werden kann. Darüber hinaus ist es nicht auf Propargyl-Lysin beschränkt, sondern kann auf jede UAA-Funktion mit einer biorthogonalen Funktion erweitert werden, die später als Anker dienen wird, um das eingehende Kohlenhydrat-Antigen zu transplantieren und für das ein orthogonales aaRS/tRNA-Paar existiert.

Einer der Nachteile der Strategie ist die mögliche Produktion von abgeschnittenem Protein, das sich aus der Freisetzung der peptidyl Sidechain beim Lesen des Bernsteinstop-Codons als Nebenprodukt ergibt. Auch wenn wir hier keine abgeschnittene Form beobachtet haben (wahrscheinlich durch die Bakterien aufgrund ihrer sehr geringen Größe abgebaut), wurde am C-terminus des Proteins ein Histidin-Tag hinzugefügt, um die Reinigung des erwarteten vollwertigen mutierten Proteins von Verunreinigungen und merklich aus dem abgeschnittenen Protein zu erleichtern (das im Wesentlichen nicht die Histidin-Tag-Sequenz ausdrückt). Dies kann wesentlich werden, wenn die UAA-Inkorporation in der Nähe des Proteins C-terminus durchgeführt wird, da die Reinigung nicht mit alternativen Chromatographie-Techniken wie der Gelfiltration versucht werden kann.

Für die meisten Anwendungen ist das Entfernen des Histidin-Tags nicht obligatorisch. Es kann jedoch nützlich sein, was die Entwicklung von Glykonojugat-Impfstoff als Teil des Immunsystems kann gegen die Tag-Sequenz umgeleitet werden. Für diesen Proof-of-Concept haben wir eine Aminosäurelängensequenz eingefügt, die speziell durch die TEV-Protease gespaltet wurde und nach der Verdauung fünf zusätzliche Aminosäuren auf dem Trägerprotein hinterlässt.

Der Konjugationsschritt zwischen dem Alkyn des Propargyllysins und einem repräsentativen synthetischen Oligosaccharid Pn14TS im Zusammenhang mit einer Pneumokokkenkapsel und dem Tragen eines komplementären Azids wurde gemäß einem von Presolski et al. berichteten Click-Chemieprotokoll durchgeführt.²⁰ Gegebenenfalls kann die Vollkomma der Reaktion leicht erreicht werden, indem die Reaktionszeit erhöht oder das Verhältnis zwischen Alkyn-, Azid- und Kupferreaktika und Reagenzien geändert wird. Kupfersalze werden durch Behandlung mit überschüssiger EDTA eliminiert, gefolgt von einer kurzen Reinigung durch sterische Ausschlusschromatographie.

Das mit der in der vorliegenden Arbeit beschriebene Verfahren erhaltene Glykonojugate kann dann zur Immunisierung von Mäusen verwendet werden. Mit einem derart vollständig definierten und leicht modulierten Glykonokjugate in den Händen bietet unschätzbare Werkzeuge, um die Auswirkungen der Hapten/Protein-Träger-Konnektivität auf die Immunantwort⁸zu bewerten. Da die Erhöhung des Hapten-Protein-Verhältnisses oft mit einer verbesserten anti-hapten humoralen Reaktion bei der Verwendung von kurzen Hapten³⁰korreliert, könnte man daran interessiert sein, Konjugate mit multiplen Hapten zu testen. Die Einbeziehung mehrerer UAAs erfordert jedoch einige Anpassungen des Protokolls, da die Einbeziehung einer UAA in das Protein dazu neigt, den Ertrag der Proteinproduktion aufgrund der RF1-Aktivität zu verringern.

Definitiv ist diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zugang zu homogenen Glykonojugonjugate-Impfstoffen zu erhalten, die ihre physikalisch-chemische Charakterisierung erleichtern, sowie weitere Kohlenhydrat-Antigen-/Träger-Konnektivitäts-Immunogenitäts-Beziehungsstudien.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

E.C. würdigt die finanzielle Unterstützung durch La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), insbesondere ein Promotionsstipendium an Die T.V. Wir würdigen auch Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankreich) für seine wertvollen technischen Ratschläge.