Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34⁺ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34⁺ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34⁺ Zellen.

Die Ex-vivo-Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Hämatopoese. Das hier beschriebene Protokoll ist für die zytokininduzierte Differenzierung von CD34⁺ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Abstammungszellen. CD34⁺ Zellen werden aus menschlichem Nabelschnurblut isoliert und in Gegenwart von Zytokinen mit MS-5 Stromalzellen kokultiviert. Die immunotypische Charakterisierung der Stamm- und Vorläuferzellen sowie der differenzierten myeloischen Abstammungszellen werden beschrieben. Mit diesem Protokoll können CD34⁺ Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert oder mit Lentiviren transduziert werden, um myeloische Krankheitsmutationen auszudrücken, um ihre Auswirkungen auf die myeloische Differenzierung zu untersuchen.

Die normale Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Werte aller Blutkörperchen. Während der Differenzierung, in einer koordinierten Reaktion auf extrazelluläre Hinweise einschließlich Wachstumsfaktoren und Zytokine, HSCs zuerst entstehen multipotente Vorläuferzellen (MPP) Zellen, die lympho-myeloides Potenzial^{haben 1,2,3 ,4} (Abbildung 1). MPPs führen zu gemeinsamen myeloischen Vorläufern (CMPs) und gemeinsamen lymphoiden Vorläufern (CLPs), die Abstammungsbeschränkungen sind. CLPs unterscheiden sich in die lymphoiden Linien, die aus B, T und natürlichen Killerzellen bestehen. CMPs erzeugen die myeloischen Abstammungen durch zwei eingeschränkte Vorläuferpopulationen, MegakaryozytenerErythroid-Vorläufer (MEP) und Granulozytenmonozytenvorläufer (GMPs). Die MdEP führen zu Megakaryozyten und Erythrozyten, während GSP Granulozyten und Monozyten hervorrufen. Zusätzlich zu den Durchgängen durch CMPs, Megakaryozyten wurden berichtet, dass auch direkt aus HSCs oder frühen MPPs über nicht-kanonische Wege^5,6.

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) zeichnen sich durch den Oberflächenmarker CD34 und das Fehlen von linienspezifischen Markern (Lin^-) aus. Andere Oberflächenmarker, die häufig zur Unterscheidung von HSCs und myeloiden Vorläuferpopulationen verwendet werden, sind CD38, CD45RA und CD123² (Abbildung 1). HSCs und MPPs sind Lin^-/CD34⁺/CD38^- und Lin^-/CD34⁺/CD38⁺, bzw. Myeloide engagierte Vorläuferpopulationen zeichnen sich durch das Vorhandensein oder Fehlen von CD45RA und CD123 aus. CMPs sind Lin^-/CD34⁺/CD38⁺/CD45RA^-/CD123^lo, GMPs sind Lin^-/CD34⁺/CD38⁺/CD45RA⁺/CD123^lo, und MePs sind Lin^-/CD34⁺ /CD38⁺/CD45RA^-/CD123^-.

Die Gesamtpopulation von CD34⁺ Stamm- und Vorläuferzellen kann aus menschlichem Nabelschnurblut (UCB), Knochenmark und peripherem Blut gewonnen werden. CD34⁺ Zellen machen 0,02 % bis 1,46 % der gesamten mononukleären Zellen (MNCs) im menschlichen UCB aus, während ihr Anteil zwischen 0,5 % und 5,3 % im Knochenmark schwankt und im peripheren^Blutmit 0,01 % viel niedriger ist 7^,8,9 . Die proliferative Kapazität und das Differenzierungspotenzial von UCB-abgeleiteten CD34⁺ Zellen ist signifikant höher als die der Knochenmark- oder peripheren Blutkörperchen^1,10, wodurch ein deutlicher Vorteil für die ausreichendes Material für molekulare Analysen in Kombination mit der durchführung immunophenotypic und morphologischen Charakterisierung der Zellen während der Differenzierung.

Ex-vivo-Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34⁺ HSPCs ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der normalen Hämatopoese und hämatopoetischen Krankheit Mechanismen. Bei Kultur mit den entsprechenden Zytokinen können die UCB CD34⁺ HSPCs induziert werden, um entlang der myeloischen oder lymphoiden Linien^{11,12,13,14,15} zu unterscheiden ^{, 16}. Hier beschreiben wir Protokolle zur Isolierung und immunphänotypischen Charakterisierung der CD34⁺ HSPCs aus humanem UCB und für deren Differenzierung zu myeloischen Abstammungszellen. Dieses Kultursystem basiert auf der zytokininduzierten Differenzierung von HSPCs in Gegenwart von MS-5-Stromalzellen, um die Mikroumgebung im Knochenmark nachzuahmen. Die Kulturbedingungen führen zu einer anfänglichen Ausdehnung der CD34⁺ Zellen, gefolgt von deren Differenzierung zu Zellen, die Marker für die vier myeloischen Abstammungszellen ausdrücken, nämlich Granulozyten (CD66b), Monozyten (CD14), Megakaryozyten (CD41) und Erythrozyten (CD235a). Anwendungen des CD34⁺ Zelldifferenzierungsprotokolls umfassen Studien über molekulare Mechanismen zur Regulierung der Hämatopoese und Untersuchungen der Auswirkungen von myeloiden Krankheitsmutationen und kleinen Molekülen auf die Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs.

Menschliches Nabelschnurblut zum Experimentieren wurde von gesunden Personen nach informierter Zustimmung zu Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix gespendet. Die identifizierten Einheiten wurden durch eine Materialtransfer-Vereinbarung zwischen MIHS und der University of Arizona erhalten.

1. Reagenzien und Puffer

HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien und Puffer unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank vor.

1. Bereiten Sie sterilen PBS-BSA-EDTA (PBE) Puffer vor, indem Sie 7,2 ml steriles 35% Rinderserumalbumin (BSA; sterile Gewebekultur grade 35% BSA) und 5 ml steriles 0,5 M Ethylendin-Tetra-Essigsäure (EDTA) zu 487,8 ml steriler Dulbecco-Phosphatgepufferung hinzufügen. Saline (DPBS). Filter sterilisieren und entgasen den Puffer, indem er den Filter mindestens 2 h in einem biologischen Sicherheitsschrank am Vakuum befestigt lässt. Aliquot den entgaseten Puffer in kleineren Mengen (250 ml) und bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie 1x Hanks ausgewogene Salzlösung (1x HBSS) vor. 100 ml 10x HBSS-Lager in 900 ml sterilem destilliertem Wasser verdünnen, um 1 L 1x HBSS herzustellen und pH auf 7,2 einzustellen. Filter sterilisieren Sie den 1x HBSS vor der Verwendung.
3. Bereiten Sie 2% Essigsäurelösung vor, indem man 2 ml Eisessigsäure zu 98 ml destilliertem Wasser hinzufügt.
4. Bereiten Sie 20 ng/ml rekombinante humane Fibronectin-Fragmentlösung in 1x PBS vor. Machen Sie 10 ml pro 48-Well-Platte.
5. Bereiten Sie 2% BSA vor. Auf 100 ml 1x PBS, fügen Sie 2 Gramm BSA Fraktion V. Filter sterilisieren vor der Verwendung.
6. Machen Sie das komplette Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) durch Zugabe des DMEM-Pulvers, 3,7 g Natriumbicarbonat, 100 ml fetalem Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin (PS) zu 800 ml sterilem destilliertem Wasser. Mischen und machen Sie das Volumen auf 1 L, und Filter sterilisieren vor der Verwendung.
7. Gefriermedium durch Mischen von 90 ml FBS und 10 ml sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereiten.
8. Bereiten Sie Stimulationsmedium vor. Um das serumfreie Medium zu serumfreies Medium hinzuzufügen, l-Glutamin auf 2 mM und Zytokine zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml für Stammzellfaktor (SCF), Thrombopoietin (TPO) und Fms-ähnliche Tyrosinkinase 3 Liganden (Flt3L) und 20 ng/ml für Interleukin-3 (IL3) (siehe Tabelle der Materialien) zur Herstellung von Zytokin-Lagerlösungen). Machen Sie 5 ml pro 48-Well-Platte.
9. Bereiten Sie 1x myeloische Differenzierungsmedium. Um DMEM abzuschließen, fügen Sie Zytokine zu einer Endkonzentration von 5 ng/ml für SCF, Flt3L und IL3, 50 ng/ml für TPO und 4 Einheiten/ml für Erythropoietin (EPO) hinzu. Machen Sie 5 ml pro 48-Well-Platte.
10. Bereiten Sie 2x myeloische Differenzierungsmedium. Um DMEM abzuschließen, fügen Sie Zytokine zu einer Endkonzentration von 10 ng/ml für SCF, Flt3L und IL3, 100 ng/ml für TPO und 8 Einheiten/ml für EPO hinzu. Machen Sie 5 ml pro 48-Well-Platte.
11. Bereiten Sie den Flow-Zytometriepuffer vor. Zu 1 L 1x 1x PBS 10 g BSA-Fraktion V hinzufügen.
12. 1% Paraformaldehyd in 1x PBS vorbereiten (Details finden Sie in der Materialtabelle).
13. Bereiten Sie die Poly-L-Lysin-Lösung vor, indem Sie 500 l 10 mg/ml Poly-L-Lysin zu 49,5 ml 1x PBS hinzufügen.

2. Isolierung mononukleischer Zellen aus Nabelschnurblut

HINWEIS: Für das unten beschriebene Protokoll wurden Nabelschnurblutvolumen von 90 bis 100 ml verwendet. Die Isolierung von CD34⁺ Zellen muss unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.

1. Sprühen Sie den Beutel mit UCB mit 70% Ethanol, um die Außenfläche zu sterilisieren, bevor Sie ihn in den biologischen Sicherheitsschrank einführen. Übertragen Sie den UCB in eine sterile 250 ml Kunststoffflasche und verdünnen Sie sie 1:1 durch Zugabe eines gleichen Volumens der Raumtemperatur (RT) 1x HBSS.
2. 15 ml MNC-Fraktionierungsmedium (MFM; siehe Materialtabelle)pro Rohr in ca. sechs sterile 50 ml konische Rohre geben. Neigen Sie das Rohr mit MFM und gießen Sie 30 ml verdünntes UCB vorsichtig auf die MFM-Schicht, ohne sie zu stören.
3. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 x g für 30 min bei RT mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse.
4. Nach der Zentrifugation zwischen 15-20 ml des Plasmas über der MNC-Schicht aspirieren. Sammeln Sie die MNCs vorsichtig mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr.
   HINWEIS: MNCs legen sich als weiße Buffy-Schicht an der Schnittstelle von Plasma und MFM ab, und die roten Blutkörperchen (RBCs) Sediment am Boden des konischen Rohres.
5. Pool MNCs gesammelt aus 2-3 Röhren zusammen. Machen Sie das Volumen jedes Rohres auf 50 ml mit kaltem PBE-Puffer.
6. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, wobei die Bremse niedrig ist.
7. Aspirieren Sie den Überstand und tippen Sie sanft auf das Rohr, um das Zellpellet zu lösen.
8. Setzen Sie die pelletierten Zellen in 5 ml eiskaltem PBE-Puffer wieder aus. Verwenden Sie die gleichen 5 ml resuspendierten Zellen, um Zellen aus anderen Röhren zu sammeln. Kombinieren Sie Zellen von 3 bis 4 Röhren in einem 50 ml konischen Rohr.
9. Um die verbleibenden Zellen zu sammeln, waschen Sie alle Rohre mit 5 ml kaltem PBE-Puffer und fügen Sie das 50 ml konische Rohr hinzu.
10. Zählen Sie die MNCs, indem Sie 10 l Zellsuspension in eine Essigsäurelösung von 490 l verdünnen.
    HINWEIS: Essigsäure lysiert alle kontaminierenden RBCs, um eine einfachere Zählung von MNCs zu ermöglichen.
11. Machen Sie das Volumen der Zellsuspension mit eiskaltem PBE-Puffer auf 50 ml auf. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, mit Bremse auf niedrig.
    HINWEIS: Die MNC-Suspension kann sofort zur Isolierung von CD34⁺ Zellen verarbeitet oder für spätere Anwendungen eingefroren werden.
12. Um die MNCs einzufrieren, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie bei einer Dichte von 2 x 10⁷ Zellen/ml im Gefriermedium bei RT erneut auf.
13. Die Zellen über Nacht bei -80 °C in einem Zellgefrierbehälter einfrieren und dann in flüssigen Stickstoff geben.

3. Isolierung von CD34⁺ Zellen aus mononukleären Zellen

1. Wenn Sie frisch isolierte MNCs verwenden, fahren Sie direkt mit Schritt 3.3 fort.
2. Wenn Sie gefrorene MNCs verwenden, die gefrorenen Zellen in einem 37 °C-Wasserbad schnell auftauen und in ein 50 ml konisches Rohr übertragen. Sammeln Sie alle verbleibenden Zellen in den Durchstechflaschen mit 1 ml eiskaltem PBE-Puffer und übertragen Sie sie in das 50 ml konische Rohr.
3. Das Volumen der MNC-Aufhängung auf 50 ml mit kaltem PBE-Puffer und Zentrifuge bei 600 x g für 5 min bei 4 °C aufstellen.
4. Entfernen Sie den Überstand und tippen Sie vorsichtig auf das Rohr, um das Zellpellet zu lösen. Setzen Sie die MNCs auf 1 x 10⁸ Zellen in 300 l eiskalten PBE-Puffer aus.
5. Fügen Sie 100 L FcR-Blockierreagenz aus der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) human CD34 Microbead Kit pro 1 x 10⁸ MNCs hinzu und mischen Sie vorsichtig.
   HINWEIS: Dies blockiert die unspezifische Bindung an die CD34-Mikroperlen.
6. Fügen Sie 100 l der CD34 Mikroperlen pro 1 x 10⁸ Zellen hinzu. Sanft mischen und bei 4 °C 30 min im Kühlschrank inkubieren. Nicht auf Eis brüten.
7. Während die Zellen inkubieren, legen Sie eine LS-Säule und einen Vortrennfilter in das Magnetfeld des MACS-Trennzeichens. Ausgleichder der Säule mit eiskaltem PBE-Puffer, indem 2 ml direkt in die Spalte und 1 ml im Vortrennfilter eingefügt werden. Lassen Sie die Spalte in ein 15 ml konisches Rohr entleeren und den Durchfluss durchwerfen.
8. Entfernen Sie die MNCs von 4 °C, fügen Sie eiskalten PBE-Puffer hinzu, um das Volumen auf 15 ml zu erhöhen, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, wobei die Bremse niedrig ist.
9. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml eiskalten PBE-Puffer wieder auf.
10. Fügen Sie die Zellsuspension dem Aufspaltungsfilter hinzu, der auf der LS-Spalte platziert ist.
    HINWEIS: Der Vortrennfilter entfernt alle großen Zellaggregate, die die Spalte blockieren können.
11. Spülen Sie das Rohr mit 3 ml eiskaltem PBE-Puffer ab und fügen Sie es dem Aufscheidungsfilter auf der LS-Säule hinzu. Verwerfen Sie anschließend den Vortrennfilter.
12. Waschen Sie die LS-Säule viermal, indem Sie 3 ml eiskalten PBE-Puffer hinzufügen, sodass die Säule jedes Mal abfließen kann.
    HINWEIS: Die CD34⁺ Zellen bleiben an die Spalte gebunden, und die nicht beschrifteten Zellen fließen durch die Spalte.
13. Nach der letzten Wäsche die Säule aus dem MACS-Trennzeichen-Magnetfeld entfernen und in ein neues 15 ml konisches Rohr legen, weg vom Magneten.
14. Fügen Sie der Säule 5 ml eiskalten PBE-Puffer hinzu und vertreiben Sie die gebundenen CD34⁺ Zellen, indem Sie den Kolben fest einschieben.
15. Optional können Sie CD34⁺ Zellen, die von der ersten Spalte isoliert sind, mit dem oben beschriebenen Vortrennfilter (Schritte 3.10-3.13) über eine andere LS-Spalte übergeben.
16. Zählen Sie die isolierten CD34⁺ Zellen mit Trypanblau (10 L Zellen und 10 L Trypanblau), um die Gesamtzahl der lebenden Zellen zu bestimmen.
    HINWEIS: In diesem Stadium können die isolierten CD34⁺ Zellen für die spätere Verwendung eingefroren oder direkt zur Analyse von HSPCs mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 4) oder zur Differenzierung zu myeloiden Linienzellen (Abschnitt 5) verarbeitet werden.
17. Zentrifugieren Sie die Zellaufhängung bei 600 x g für 5 min bei RT, mit Bremse auf niedrig.
18. Um die CD34⁺ Zellen einzufrieren, den Überstand ansaugen und bis zu 5 x 10⁶ Zellen in 1 ml Gefriermedium wieder aussetzen und wie oben beschrieben einfrieren (Schritt 2.13). Fahren Sie andernfalls mit Abschnitt 4 oder 5 fort.

4. Bestimmung von Stamm- und Vorläuferpopulationen durch Durchflusszytometrie

1. Um die Fraktionen von Stamm- und Vorläuferpopulationen in den frisch isolierten CD34⁺ HSPCs zu bestimmen, zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für 5 min und setzen 1 x 10⁶ Zellen in 50 l Durchflusszytometriepuffer wieder auf.
2. Um 1 x 10⁶ CD34⁺ Zellen Antikörper (siehe Materialtabelle für Verdünnungen) zu Lineage-Markern (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 und CD235a — alle FITC-gekennzeichnet), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) und 7- Aminoactinomycin D (7-AAD; als lebender/toter Fleck) und machen das Gesamtvolumen bis 100 l aus. 20 min auf Eis im Dunkeln bebrüten.
   HINWEIS: Für die Analyse können weniger als 1 x 10⁶ CD34⁺ Zellen verwendet werden. Wenn weniger Zellen färben, sollten das Gesamtvolumen und das Volumen der hinzugefügten Antikörper entsprechend reduziert werden. Für die Analyse der Durchflusszytometrie sollten ungefärbte und einzelne gebeizte MNCs als Steuerungen für die Einstellung positiver und negativer Tore für jedes Fluorophor verwendet werden.
3. Nach der Inkubation die Zellen mit 1 ml Durchflusszytometriepuffer und Zentrifuge bei 600 x g für 5 min waschen.
4. Optional die gebeizten Zellen in 0,5 ml 1% Paraformaldehydlösung für 10 min im Dunkeln bei RT fixieren.
5. Zentrifuge bei 600 x g für 5 min und aspirieren Sie den Überstand.
6. Waschen Sie die fixierten/gefärbten Zellen mit 1 ml Durchflusszytometriepuffer und Zentrifuge bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
7. Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 500 L Durchflusszytometriepuffer wieder auf und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer (Materialtabelle).

5. Myeloische Differenzierung der CD34⁺ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

HINWEIS: Um die CD34⁺ HSPCs von den myeloiden Linienzellen zu unterscheiden, werden sie zunächst in rekombinanten menschlichen Fibronectin-Fragment-beschichteten Platten stimuliert und dann auf einer Schicht von MS-5-Stromalzellen im myeloischen Differenzierungsmedium gesät. Die Differenzierung kann jede Woche für 3 Wochen überwacht werden, basierend auf der Expression von Zelloberflächenmarkern, die für die vier myeloischen Linien spezifisch sind. Während der Stimulation und Differenzierung werden alle Inkubationen bei 37 °C und 5% CO2 in einer befeuchteten Kammer durchgeführt. Alle Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.

1. Beschichten Sie die Brunnen einer sterilen unbeschichteten 48-Well-Platte, indem Sie 200 L/Well der rekombinanten menschlichen Fibronectin-Lösung in 1x PBS für 2 h bei RT hinzufügen.
2. Nach 2 h die rekombinante menschliche Fibronectinlösung vorsichtig entfernen und entsorgen.
3. Blockieren Sie die Bohrungen mit 200 l/Well von 2% BSA für 30 min bei RT.
4. Saugen Sie die BSA-Lösung und waschen Sie die Brunnen zweimal mit 500 l sterilen 1x PBS.
   HINWEIS: Fibronectin-Fragmentbeschichtete Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
5. Um die CD34⁺ HSPCs zu stimulieren, setzen Sie die frisch isolierten Zellen (ab Schritt 3.17) mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/200 l oder 5 x 10⁵ Zellen/ml warmem 1x Stimulationsmedium wieder auf.
6. Wenn Sie gefrorene CD34⁺ Zellen verwenden, tauen Sie schnell auf und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Rohr, das warmes komplettes DMEM enthält. Zentrifuge bei 600 x g für 5 min und re-suspendieren die Zellen wie in Schritt 5.5 beschrieben.
7. Platte 200 l der CD34⁺ Zellsuspension pro Bohrung des Fibronectin-Fragments beschichtet 48-Well-Platte und inkubieren für 48 h.
8. Am nächsten Tag säen Sie 15.000 MS-5 Stromalzellen in 200 l vollständiger DMEM pro Bohrung einer 48-Well-Gewebekultur behandelten Platte und brüten bei 37 °C für 24 h.
9. Nach 48 h Stimulation, sammeln Sie die CD34⁺ Zellen durch sanfte Pipetten. Waschen Sie die Brunnen mit 500 l warmen DMEM und Pool mit der Zellsuspension.
10. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 600 x g für 5 min und setzen Sie sie bei einer Dichte von 5.000 Zellen/200 l des 1x myeloiden Differenzierungsmediums wieder auf.
11. Aus der 48-Well-Gewebekulturplatte, die mit MS-5 Stromalzellen gesät ist, saugen Sie das Medium sanft an, ohne die Zellen zu stören. Schicht 200 l (5.000 Zellen) der CD34⁺ Zellsuspension pro Bohrloch der Platte und inkubieren bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Kultur von MS-5-Zellen kann in vollständiger DMEM beibehalten werden. Am Tag der Aussaat der CD34⁺ Zellen müssen die MS-5-Zellen in einer einheitlichen Schicht (80-90% Zusammenfluss) liegen. Es wird empfohlen, die MS-5-Zellen mindestens 24 Stunden vor dem Aussaat der CD34⁺ Zellen zu plattieren.  Sollen MS-5-Zellen vor dem Aussaat der CD34⁺ Zellen 48 h oder 72 h plattiert werden, sollte die Zelldichte entsprechend angepasst werden. Es wird auch empfohlen, die peripheren Brunnen der 48-Well-Platte leer zu lassen oder mit 200 l sterilem Wasser zu füllen, um Kanteneffekte zu vermeiden.
12. Führen Sie halb-mittlere Veränderungen alle 3 bis 4 Tage durch, indem Sie 100 l des Mediums vorsichtig von der Oberseite jedes Brunnens entfernen und es durch 100 l 2x myeloides Differenzierungsmedium pro Brunnen ersetzen.
13. Ernten Sie am 21. Tag die Zellen zur Analyse der myeloischen Linienmarkerexpression durch Durchflusszytometrie. Ohne die MS-5-Schicht zu stören, pipette das Medium vorsichtig und überträgt Zellen in ein 5 ml Rohr.
    HINWEIS: Für die Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse sind Zellen aus 1-2 Brunnen ausreichend. Die Differenzierung kann auch an den Tagen 1, 7 und 14 überwacht werden. Wenn Sie an mehreren Tagen eine Immunophenotypisierung durchführen, sollte die Anzahl der für die Analyse benötigten Brunnen entsprechend berechnet werden.
14. Stain 5 x 10⁵ Zellen mit Antikörpern gegen CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) und CD235a (APC) in einem Gesamtvolumen von 50 l. Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 20 min. Ungefärbte und einzelne gebeizte MNCs als Kontrollen zur Einstellung positive und negative Tore für jedes Fluorophor und 7-AAD als lebender/toter Fleck, um abgestorbene Zellen aus der Analyse zu entfernen.
15. Waschen und fixieren (optional) die gefärbten Zellen wie oben beschrieben (Schritte 4.3-4.6).
16. Setzen Sie die Zellen in 500 L Durchflusszytometriepuffer wieder auf und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.

6. Bewertung der Zellmorphologie

1. Reinigen Sie das Mikroskop durch Sprühen von Ethanol und Wischen bis quietschen.
2. Saubere Dias in Poly-L-Lysin-Lösung für 5 min bei RT und trocken für 1 h bei RT.
3. Setzen Sie die HSPCs aus Schritt 3.14 wieder auf und differenzieren Sie Zellen von Schritt 5.13 in 10 L Durchflusszytometriepuffer.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension auf die beschichteten Schlitten und lassen Sie sie lufttrocken.
   HINWEIS: Dias ab Tag 1 und 21 können bei RT gelagert und gleichzeitig gebeizt werden.
5. Gießen Sie 0,5 ml des Wright-Giemsa Flecks auf der Rutsche und lassen Sie für 3 min bei RT stehen.
6. Fügen Sie gleiche Menge an entionisiertem Wasser hinzu und lassen Sie zusätzliche 10 min bei RT stehen.
7. Waschen Sie die Rutsche in entionisiertem Wasser.
8. Visualisieren Sie gefärbte Zellen bei einer Vergrößerung von 60x oder 100x durch ein Mikroskop.

Die Anwendung der oben genannten Protokolle ergibt 5,6 (ca. 0,5) x 10⁸ MNCs und 1 (ca. 0,3) x 10⁶ CD34⁺ Zellen aus einer Nabelschnurbluteinheit von 100 ml. Der Prozentsatz der gesamten CD34⁺ Zellen liegt zwischen 80-90% (Abbildung 2A,B). Die immunotypische Analyse nach dem von Manz et al.⁵ beschriebenen Schema zeigt, dass die CD34⁺ Zellen in der Regel aus 20 % HSCs und 72 % MPPs bestehen, die Lin^-/CD34⁺/CD38^- und Lin^-/CD34⁺ /CD38⁺, bzw. Abbildung1 bzw. Abbildung 2A). In der MPP-Population sind die Prozentsätze der CMPs (Lin^-/CD34⁺/CD38⁺/CD123^lo/CD45RA^-), GMPs (Lin^-/CD34⁺/CD38⁺/CD123^lo/CD45RA⁺), und Die Mitglieder des Europäischen Parlaments (Lin^-/CD34⁺/CD38⁺/CD123^-/CD45RA^-) sind etwa 25 %, 15 % bzw. 56 % (Abbildung 1 und Abbildung 2B).

Während der Inkubation der isolierten HSPCs in myeloischen Differenzierungsbedingungen kommt der CD34-Marker fortschreitend verloren. Die Immunophenotypisierung zeigt, dass der Anteil der CD34⁺ Zellen von 90 % bei Isolation (Abbildung 2A) auf 23 % am 21. Tag (Abbildung 3B) sinkt. Die Analyse der CD34 -Population zeigt einen gleichzeitigen Anstieg des Prozentsatzes der Zellen, die reife myeloische Abstammungsmarker exdrücken. Der Anteil der Zellen, die Marker für Monozyten (CD34^-/CD14⁺/CD66b^-) exzätsieren, ist von durchschnittlich 1,7 % auf 12 %, für Granulozyten (CD34^-/CD14^-/CD66b⁺) von durchschnittlich 1,7 % auf 12 % gestiegen. Megakaryozyten (CD34^-/CD41⁺/CD235a^-) von 1,8% bis 8% und für Erythroidzellen (CD34^-/CD41^-/CD235a⁺) von 0,7% auf 11% (Abbildung 3C). Die Untersuchung von Wright-Giemsa-gefärbten Zellen zeigt, dass die morphologischen Eigenschaften der Zellen an Tag 1 und Tag 21 unterschiedlich sind. Die undifferenzierten Zellen haben große runde Kerne und sehr wenig Zytoplasma. Andererseits weisen Zellen aus differenzierten Kulturen Merkmale von Linienzellen auf, einschließlich reifer Monozyten, Granulozyten und Erythroblasten (Abbildung 4). Daher fördern die in diesem Protokoll beschriebenen Kulturbedingungen die Differenzierung von UCB CD34⁺ Zellen zu den myeloischen Abstammungszellen.

Abbildung 1 : Hämatopoetische Differenzierung schematisch. Die pluripotente hämatopoetische Stammzelle (HSC) differenziert sich in den multipotenten Vorläufer (MPP), wodurch der gemeinsame myeloische Vorläufer (CMP) und die gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzellen (CLP) entstehen. CMPs erzeugen zwei weitere myeloische Vorläufer, die Granulozytenmonozyten-Vorläufer (GMPs) und die Megakaryozyten-Erythrozyten-Vorläufer (MEP). Granulozyten und Monozyten entstehen aus GPS, und Erythrozyten und Megakaryozyten stammen von MdEP. CLPs führen zu natürlichen Killer-, B- und T-Zellen. Die Zelloberflächenmarker, die zur Charakterisierung der Zellpopulationen in diesem Protokoll verwendet werden, sind angegeben. Diese Zahl wurde von Bapat et al.¹¹geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Immunphenotyptische Analyse der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. (A) Zellen wurden nach vorne und seitlich gestreut, um eine einzelne Zellpopulation auszuwählen. Tote und Linien-positive Zellen wurden durch Färbung mit 7-AAD und Antikörpern gegen CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 und CD235a (alle FITC-gefärbt) eliminiert. Die Lin -/live-Zellen wurden mit Antikörpern gegen CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC) und CD45RA (PE-Cy7) analysiert. Die Vorläufer wurden von den Zellen CD34⁺/CD38⁺ unterschieden. CMPs sind CD123^lo/CD45RA^-, GMPs sind CD123^lo/CD45RA⁺ und MdEP sind CD123^-/CD45RA^-. Repräsentative Streudiagramme aus einem Experiment werden angezeigt. (B) Prozentsätze der gesamten HSPCs (gesamt CD34⁺ Zellen), GPS, GPS und MdEP im Nabelschnurblut sind vertreten. Die dargestellten Daten sind Durchschnittswerte mit Standardfehlern aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Immunphenotypische Analyse von myeloischen Abstammungszellen. Einzelne Zellen wurden basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung abgegrenzt. CD34^- Zellen wurden durch Färbung mit Antikörpern gegen CD34 (APC-Cy7) ausgewählt. Myeloide Abstammungen in der CD34^- Population wurden mit Antikörpern gegen CD14 (PE), CD66b (PE-Cy7), CD41 (PerCP-Cy5.5) und CD235a (APC) am Tag 1 (A) und Tag 21 (B) analysiert. Monozyten sind CD14⁺/CD66b^-, granulozyten sind CD14^-/CD66b⁺, megakaryocytes sind CD41⁺/CD235a^- und erythroide Zellen sind CD41^-/CD235a⁺. Repräsentative Streudiagramme aus einem Experiment werden angezeigt. Fraktionen von Monozyten, Granulozyten, Megakaryozyten und Erythroidzellen in der CD34^- Population an Tag 1 und Tag 21 sind vertreten (C). Die dargestellten Daten sind Durchschnittswerte mit Standardfehlern aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl wurde von Bapat et al.¹¹geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Repräsentative Bilder von HSPCs und differenzierten Zellen. CD34⁺ HSPCs (A) und Zellen aus myeloischen Kulturen an Tag 21 (B) wurden mit dem Wright-Giemsa-Fleck befleckt. Es werden Zellen angezeigt, die Granulozyten (schwarze Pfeile), Monozyten (blaue Pfeile) und Erythroidzellen (rote Pfeile) entsprechen. Skalenbalken stellen 10 mm dar. Diese Zahl wurde von Bapat et al.¹¹geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das hier beschriebene Protokoll eignet sich zur ex vivo-Differenzierung von UCB-abgeleiteten CD34⁺ HSPCs zu den vier myeloischen Linien. Die anfängliche Inkubation mit einem Zytokin-Mix bestehend aus SCF, TPO, Flt3L und IL3 stimuliert die CD34⁺ Zellen. Anschließend wird die Differenzierung mit einem Cocktail aus SCF, IL3, Flt3L, EPO und TPO erreicht. In diesem Mix sind SCF, IL3 und Flt3L wichtig für das Überleben und die Proliferation von CD34⁺ HSCs. EPO und TPO fördern die Differenzierung zu Erythrozyten bzw. Megakaryozyten, und IL3 fördert die Differenzierung von frühem Granulozyten-Monozyten Vorläufer und reife Zellen^13,17,18. Eine Einschränkung dieser Methode ist die beobachtete Variation in den Prozentsätzen der differenzierten Zellen. Dies könnte auf die unterschiedlichen Kapazitäten der CD34⁺ HSPCs liegen, die von verschiedenen Spendern isoliert sind, um die Abstammungszellen hervorzurufen.

Die Schicht der MS-5-Zellen ist entscheidend für eine effiziente Differenzierung der CD34⁺ HSPCs. Nach unserer Erfahrung müssen die MS-5-Zellen mindestens 24 Stunden vor dem Aussaat der CD34⁺ Zellen plattiert werden. Es ist wichtig, den Zusammenfluss von MS-5-Zellen bei 80-90% zu halten. Überkonfivermse MS-5-Zellen neigen dazu, sich zu lösen, und eine geringere Konfluenz führt zu einer verminderten Differenzierung. Während der Inkubation dehnen sich die CD34⁺ Zellen um das 50-fache aus. Sie werden am 14. Tag konfluent und müssen geerntet und in zusätzliche Brunnen aufgeteilt werden, die MS-5-Zellen auf einer neuen Platte enthalten.

Die Häufigkeit von Medienveränderungen ist auch für eine effiziente Differenzierung von entscheidender Bedeutung und muss alle 3-4 Tage durchgeführt werden, um optimale Zytokinkonzentrationen aufrechtzuerhalten. Weniger Medienveränderungen und niedrigere Zytokinkonzentrationen führen zu einer Verringerung der Proliferation und Differenzierung von CD34⁺ HSPCs. Diese Anforderung an große Mengen an Zytokinen kann die Kosten erheblich erhöhen und stellt somit eine Einschränkung dieses Protokolls dar. Eine weitere Einschränkung für groß angelegte Experimente ist die Anzahl der CD34⁺ Zellen, die aus einer Einheit Nabelschnurblut gewonnen werden. Typischerweise ergibt eine frische UCB-Einheit von 100 ml etwa eine Million CD34⁺ Zellen. Die Lagerung des Geräts über 24 Stunden hinaus reduziert die Ausbeute erheblich. Ein weiterer Reinheitsverlust der CD34⁺ Zellen kann während der Säulenwaschschritte auftreten, die für die Entfernung nicht beschrifteter kontaminierender Zellen wichtig sind. Wenn die Spalte während der Waschschritte verstopft, wird empfohlen, die gebundenen Zellen aus der verstopften Spalte zu elutieren und auf eine neue Spalte neu zu laden, um eine reine Grundgesamtheit von CD34⁺ Zellen zu erhalten.

In der Literatur wurden verschiedene Zytokin-Kombinationen berichtet, die die Differenzierung in Richtung megakaryozytischer, erythroider oder granulo-monozytischer Linien^19,20,21,22 fördern. . Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass es eine Differenzierung entlang aller vier myeloiden Populationen ermöglicht, nämlich Monozyten, Granulozyten, Megakaryozyten und Erythrozyten. So kann es für die Untersuchung der normalen myeloiden Differenzierung und für die Untersuchung der Auswirkungen der myelodysplastischen Krankheit (myelodysplastische Syndrome, akute myeloische Leukämie, myeloproliferative Neoplasmen und andere) assoziierten Punktmutationen und chromosomale Translokationen auf molekularem und zellulärem Phänotyp während der Proliferation und Differenzierung von CD34⁺ Zellen^{11,12,23,24,25}. Dieses Protokoll kann auch für die Untersuchung der Auswirkungen von anti- und pro-inflammatorischen Zytokinen und von potenziellen therapeutischen Medikamenten auf myeloische Differenzierung^26,27,28verwendet werden.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Autoren danken Wendy Barrett, Rachel Caballero und Gabriella Ruiz von Maricopa Integrated Health Systems für die entidentifizierten und gespendeten Nabelschnurbluteinheiten, Mrinalini Kala für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Gay Crooks und Christopher Seet für Beratung zur ex-vivo-Myeloiddifferenzierung. Diese Arbeit wurde durch Mittel unterstützt, die S.S. von den National Institutes of Health (R21CA170786 und R01GM127464) und der American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) erhielten. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.