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Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.
Ruhe ist eine temporäre, reversibel in die Zellen Zellteilung aufgehört haben, aber weiterhin in der Lage zu vermehren. Mehrere Studien, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Ruhe weitverbreitete Änderungen in der Genexpression zugeordnet ist. Einige dieser Veränderungen entstehen durch Veränderungen in der Ebene oder die Aktivität der Verbreitung-assoziierten Transkriptionsfaktoren, wie E2F und MYC. Wir haben bewiesen, dass mRNA Zerfall auch auf Veränderungen in der Genexpression zwischen proliferierende und ruhende Zellen beitragen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die wuchernde und ruhende Kulturen der menschliche Vorhaut dermalen Fibroblasten. Wir beschreiben die Verfahren zur Hemmung der neue Transkription in proliferierende und ruhende Zellen mit Actinomycin D (ActD). ActD-Behandlung stellt einen einfache und reproduzierbaren Ansatz zu Wehre neue Transkription von Transkript Verfall dar. Ein Nachteil des ActD-Behandlung ist, dass der zeitliche Verlauf auf einem kurzen Zeitrahmen beschränkt sein muss, da ActD Zellviabilität auswirkt. Transkript-Spiegel sind im Laufe der Zeit zur Abschrift Zerfall bestimmen überwacht. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation von Genen und Isoformen, die differenzielle Zerfall im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten aufweisen.
Steady-State widerspiegeln Protokolle den Beitrag der Abschrift Synthese und Transkript Verfall. Reguliert und koordiniert Transkript Zerfall ist ein wichtiger Mechanismus zur Steuerung von biologischen Prozessen1,2,3,4. Zum Beispiel wurden Transkript Verfall Preise gezeigt beizutragen, die zeitliche Abfolge der Ereignisse, die nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor5.
Wir haben bisher gezeigt, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe im primären menschlichen Fibroblasten mit Veränderungen in der Abschrift von vielen Genen6verbunden ist. Einige dieser Änderungen spiegeln Unterschiede in der Aktivität von Transkriptionsfaktoren zwischen diesen beiden Zuständen.
Änderungen in eine Abschrift Zerfallsrate können auch zu Änderungen bei der Ausdruck eine Abschrift in zwei verschiedenen Staaten7,8beitragen. Basierend auf unserer früheren Feststellungen, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe verbunden mit Veränderungen in der Höhe von mehreren RNAs9wir gefragt, ob es auch ein Beitrag von differenziellen Transkript Verfall in der Veränderung ist Genexpression in versus Ruhestrom Fibroblasten vermehren.
Um die Abschrift Stabilität zu überwachen, haben wir die Rate des Zerfalls der Transkripte genomweite in versus ruhenden Zellen wuchern festgestellt. Um dies zu erreichen, überwachen wir Verfall Preise im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten durch die Einführung eines Inhibitors der neue Transkription und Überwachung die Rate an die einzelnen Protokolle im Laufe der Zeit verschwunden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Vergleich zu Methoden, die einfach insgesamt Genexpression, überwachen, indem Sie neue Transkript-Synthese hemmen, werden wir in der Lage die Zerfallsrate für diese Protokolle getrennt von der Rate, mit der sie bestimmen transkribiert.
ActD Behandlung neue Transkription hemmen und Transkript Verfall Preise bestimmen wurde erfolgreich in mehreren früheren Studien angewendet. ActD wurde zur sezieren der Bedeutungdes der RNA-Stabilität in die Änderungen in Hülle und Fülle der Niederschrift, die von einer Behandlung mit Pro-inflammatorischen Zytokinen5ergeben. Ein ähnlicher Ansatz hat auch zur sezieren die Unterschiede im Transkript Zerfallsrate in versus differenzierten C2C12 Zellen wuchern, wie sie eine differenzierte Muskel Phänotyp10annehmen. Als weiteres Beispiel globale mRNA Halbwertszeiten auch in pluripotente erkannt wurden und differenzierte Maus embryonale Stammzellen-11. In diesen Beispielen nachweislich die mRNA Decay für die Regulierung der Abschrift Fülle und für den Übergang von Zellen in andere Zelle Staaten von Bedeutung sein.
Die nachfolgend beschriebenen Methoden anwenden, entdeckten wir Steuersatzänderungen Transkript Zerfall in ungefähr 500 Gene beim Vergleich von Fibroblasten in proliferierende und ruhende Staaten12. Insbesondere, entdeckten wir, dass die Ziele der MicroRNA MiR-29, die in ruhenden Zellen herunterreguliert, stabilisiert werden, wenn Zellen in Ruhe übergehen. Wir beschreiben hier die Methode verwendeten wir Zerfall in proliferierende und ruhende Zellen zu bestimmen. Diese Methode eignet sich für Zinsprodukten mRNA Zerfall in zwei unterschiedliche, aber ähnliche Bedingungen zu vergleichen, wenn Informationen über rasch verfallenden Genen gesucht wird. Es könnte auch verwendet werden, andere Fragen wie die Wirkung der Zelle Kulturbedingungen auf Transkript Zerfall, zum Beispiel in zweidimensional im Vergleich zu drei dimensionale Kulturen anzusprechen. Decay Rate können bestimmt genomweite mit Methoden wie Microarrays oder RNA-FF alternativ in Echtzeit qPCR oder Nordbeflecken kann verwendet werden, um Verfall auf gen-durch-gen oder Isoform von Isoform Basis zu bestimmen. Diese Sätze können dann verwendet werden, um die Halbwertszeit von jedem überwachten gen zu berechnen und Gene mit Verfall zu identifizieren, die in zwei Bedingungen unterschiedlich sind.
Alle beschriebenen Experimente stimmten institutionelle Review Boards an der Princeton University und der University of California, Los Angeles.
1. bereiten Sie wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten für ActD zeitlicher Verlauf
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Timecourse mit vier Zeitpunkte. Drei biologisch unabhängige Stichproben können pro Timepoint gesammelt werden, durch das Sammeln von verschiedenen Gewebekultur Platten in einem Experiment, oder das Experiment kann mehrere Male mit unterschiedlichen Kulturen der Zellen wiederholt werden. Nach unserer Erfahrung bietet eine 10 cm (Durchmesser) Gewebekultur Teller (ein Teller) ausreichend RNA für die Analyse. Bei Bedarf können mehrere Gewebekultur Gerichte für jede Probe, die Zahl der Zellen in jedem Timepoint gebündelt. Darüber hinaus kann das gleiche Experiment durchgeführt werden, mit Fibroblasten aus verschiedenen Individuen isoliert, da wirklich unabhängige biologische repliziert.
(2) ActD zeitlicher Verlauf
3. Isolation von Gesamt-RNS von Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Lysate
4. Analyse der Abschrift Fülle
5.Konstante Tariffindung Verfall
Zuvor haben wir die Ergebnisse der Microarray Analysen der Abschrift Zerfall Sätze in wuchernden und Kontakt gehemmt primären menschlichen Fibroblasten über einen 8-Stunden-Kurs12berichtet. Eine Liste von Genen mit eine signifikante Veränderung im Transkript Stabilität Vergleich wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten dient in ergänzenden Tabelle1. Die Fluoreszenz-Intensitäten zum Zeitpunkt Null und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behandlung stehen zur Verfügung. Gene wurden in die Liste aufgenommen, durch die Bestimmung der Gene, die deutlich unterschiedliche Steigungen im wuchernden und Kontakt gehemmt Bedingungen mit einem ANOVA F-Test haben. Beispiele von Genen mit unterschiedlichen Zerfall in proliferierende und ruhende Fibroblasten sind in Abbildung 5dargestellt.
Abbildung 1 : Schaltplan des Protokolls für die Festlegung der wuchernden und Kontakt gehemmt Platten für Kurs Zeitanalysen ActD. Tag für Tag ist die erforderlichen Maßnahmen, um die Kulturen der Zellen für ActD Behandlung zu etablieren beschrieben unter der Annahme, dass vier Zeitpunkte für den zeitlichen Verlauf verwendet werden. Der Einfachheit halber eine Platte ist pro Timepoint gezeigt, aber Zusatzplatten zugesetzt werden, um biologische Wiederholungen zu erzeugen. Das Protokoll kann auch eingestellt werden, um mehr Platten Zellen hinzuzufügen, wenn mehr als vier Zeitpunkte gewünscht werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Schematische Darstellung des ActD zeitlichen Verlauf und Verfall bewerten Berechnungen in ruhenden im Vergleich zu den wuchernden menschlichen Fibroblasten. Der erwartete Anteil der mRNAs bleiben im Laufe der Zeit für eine hypothetische Abschrift nach Behandlung mit einem transkriptionelle Inhibitor angezeigt wird. Unten, Probeflächen des Bruchs der mRNA verbleibenden im Laufe der Zeit sind Gene, die stabiler sind vorgesehenen Ruhestrom als wuchernden Zellen und Gene, die stabiler im wuchernden als ruhende Zellen sind. Für jeden Datenpunkt wird aus Gründen der Übersichtlichkeit nur ein einzelner Wert angezeigt. In das eigentliche Protokoll werden drei Datenpunkte für jedes Timepoint. Diese Zahl wurde von Elizabeth Pender Johnsons Dissertation mit ihrer Zustimmung geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Fotos von Phenol-Guanidin-Herstellung-Reagenz und Chloroform mischen vor und nach der Zentrifugierung. Die Mischung wird angezeigt wenn die Phenol-Guanidin-Herstellung-Reagenz und Chloroform zunächst, nach dem Mischen und nach Zentrifugation kombiniert werden. Nachdem die Mischung zentrifugiert wird, ist die untere Phase, die rot ist, die organische Phase. Die Interphase in der Mitte ist weiß und trübe. Die obere Phase ist die wässrige Phase und es ist klar. Die RNA ist in der wässrigen Phase, die mit einer Pipette zur Fällung gesammelt werden sollten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Probe RNA Gel, RNS-Qualität zu überwachen. Eine Abbildung von einer RNA-Gel Proben mit intakten RNA zeigt. Intakte RNA hat prominente Bands für die 28 s und 18 s rRNAs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Beispiele von Genen mit unterschiedlichen Verfall Raten im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten. Fluoreszenz-Intensitäten (Genexpression) im Laufe der Zeit sind für vier Gene angezeigt, die anders in proliferierenden versus Ruhestrom Fibroblasten zerfallen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Tabelle1: Gen-spezifischen Fluoreszenz-Intensität im wuchernden und ruhenden Fibroblasten. Daten sind Kontakt gehemmt und zur Verfügung gestellt für Zeitlosigkeit und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behandlung in proliferierenden Fibroblasten. P-Werte, Q-Werte und falsche Entdeckung Preise stehen zur Verfügung. Tabelle wird aus seiner ursprünglichen Veröffentlichung im BMC Genomics12abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Stille kann durch externe Signale einschließlich Rücknahme Mitogene oder Serum, mangelnde Zelladhäsion und Kontakt Hemmung induziert werden. Kontakt-Hemmung, einer von mehreren möglichen Methoden zur Induktion der Ruhe, ist ein höchst evolutionär konservierte Prozess in dem Zellen der proliferativen Zellzyklus in Reaktion auf Zell-Zell-Kontakt beenden. Wir konzentrieren uns hier auf Kontakt Hemmung als Beispiel für eine Methode, um Ruhe zu induzieren. Frühere Studien haben berichtet, dass Zell-Zell-Kontakt MicroRNA Biogenese25beeinflussen kann, so die Ergebnisse Auskunft über eine Ruhe-Methode geben und weitere Studien erforderlich sind, um festzustellen, welche Änderungen mit Ruhe verbunden sind per se.
Wir verwendeten primären menschliche diploide Fibroblasten, die wir von Neugeborenen Haut isoliert. Wir initiierten diese Experimente mit Fibroblasten, die weniger als 10 mal passagiert wurden. Wir später-Passage Fibroblasten verworfen, weil sie Senesce. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf proliferierende und ruhende dermalen Fibroblasten, können die beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Verfall Tarife in verschiedenen Arten von Zellen und unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen.
Wir überwachen mRNA Decay Preise genomweite mit einem Transkription Abschaltzeit Kurs. Abschaltzeit Kurse sind die am weitesten verbreitete Methode zur Entkopplung von mRNA Zerfall von mRNA-Transkription um mRNA Halbwertszeiten1,26zu berechnen. In der Methode beschriebenen ActD, ein Medikament, dass komplexe mit der B-Form der DNA zu blockieren, Dehnung der RNA-Polymerase II, wird verwendet, um die Transkription von mRNAs27zu verhaften. Die Rate, die Transkripte in Hülle und Fülle über einen 8-Stunden-Zeitraum verringern kann als das Transkript Zerfallsrate ermittelt werden.
Eine wichtige Einschränkung des ActD-basierte Ansätze für die Überwachung der Abschrift Verfall ist, dass ActD globale Transkription wird verhindert, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken wird. Dies sollte im Auge behalten werden, bei der Interpretation ActD-basierte Daten, wie Zerfall Preise in Zellen festgelegt werden, die mehr als ihren Heimatstaat gestresst sind. Ein weiteres wichtiges Anliegen ist, dass die Auswirkungen des ActD für Zellen in verschiedenen Staaten, einschließlich der wuchernden versus Kontakt gehemmt Fibroblasten abweichen können. Ein Ansatz zur Minimierung der Nebenwirkungen des ActD-Behandlung ist Zeit Kurse kurzer Dauer zu halten. Aus diesem Grund haben wir einen 8 h Zeit Kurs ausgewählt.
Für die Überwachung der Abschrift Verfall Preise28,29gibt es alternative Ansätze ActD. Hefestämme mit temperaturempfindlichen RNA Polymerase II Allele wurden zur Abschrift Decay Rate30zu überwachen. Eine Abwandlung dieser Ansatz namens "Anker-away" wurde in der Hefe zur bedingten Abbau der RNA-Polymerase II als Reaktion auf Rapamycin Behandlung31,32zu erreichen. Es ist auch möglich, Zerfall in den Zellen mit aktive Transkription zu überwachen. Zum Beispiel Thio ersetzt Uracil Nukleotide können in Zellen eingebracht werden, mRNA eingearbeitet und anschließend erkannt33,34,35. Mit diesem Ansatz kann die Rate, an der verschiedene Transkripte synthetisiert werden, in Zellen ermittelt werden, die weiterhin mRNA synthetisieren. Solche Ansätze haben einen deutlichen Vorteil gegenüber ActD-Behandlung, weil sie nicht giftig sind. In unserer Erfahrung kann es jedoch Variabilität bei der Wiedergewinnung der Transkripte mit diesen Methoden. ActD-Behandlung ist eine einfache und reproduzierbare Ansatz für die Überwachung der Abschrift Verfall.
Ein paar Schritte in das Protokoll zur Verfügung gestellt sind entscheidend für ihren Erfolg. Ein wichtiges Thema ist RNA-Abbau während RNA Isolierung verhindert. Bei Schritt 4.1 sollte für den Abbau die RNA überwacht werden. Wenn die RNA nicht zwei klare Spitzen für 18 s und 28 s rRNAs (Abbildung 4) enthält, ist dies ein Zeichen, dass die Abschrift Verschlechterung eingetreten ist. Einige Geräte bieten RNA Integrität Anzahl (RIN) Noten von 1 bis 10. Proben mit RIN Noten im Bereich von 7 bis 10 sind akzeptabel für die weitere Analyse. Wenn die RNA abgebaut wird, ist es wichtig, weitere Vorkehrungen treffen, um zu verhindern, dass RNA-Abbau, wie sichergestellt wird, die Lösungen und Sterileware RNase-frei sind, und die Handschuhe sind beim Umgang mit RNA Pipetten. Wasser kann mit 0,1 % Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) für mindestens 2 h bei 37 ° C inkubiert vorbehandelt und autoklaviert für mindestens 15 min. beachten Sie nicht, dass DEPC mit Tris-basierte Puffer verwendet werden. RNase dekontaminierende Lösungen auch verwendet werden, können zu entfernen RNase von Arbeitsflächen, Zentrifugen, Pipetten und Reagenzien, die RNases hemmen kann Proben hinzugefügt werden.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Trennung der Phasen der Phenol-Guanidin-Herstellung-Lösung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass nur die obere Phase für RNA gesammelt werden verarbeitet. Enthält die resultierende RNA residual Phenol, das Verhältnis der Extinktion bei 230, 260 und 280 nm werden nicht im Verhältnis 1:2:1 wie erwartet. Höher als erwarteten Extinktion bei 230 nm kann zeigen Phenol Belastung. In diesem Fall kann die RNA Ethanol wieder ausgefällt und zusätzliche mehrmals um jede verbleibende Phenol zu entfernen gewaschen.
Schließlich kann wenn die RNA pelleted und der Überstand wird entfernt, das Pellet klebrig, dünn und leicht gestört werden. An dieser Stelle ist es wichtig, besonders vorsichtig in die Flüssigkeit ausziehen. Es kann wichtig sein, visualisieren Sie das Rohr mit guter Beleuchtung zu lokalisieren das Pellet und stellen Sie sicher, dass sie nicht gestört wird. Zusätzliche Glykogen kann helfen, um sicherzustellen, dass die Pellets an dieser Stelle sichtbar ist.
Die Auswahl der Zeitpunkte für den zeitlichen Verlauf des Zerfalls ist auch ein wichtiges Thema zu berücksichtigen. Während der vier Zeitpunkte von die uns ausgewählten Decay für mehr als 10.000 Gene Kontrolle erlaubt, einige Gene nicht erheblich im Laufe 8 h Zeit zerfallen. Wenn kurzlebige Transkripte eine hohe Priorität sind, können die Ermittler weitere Musterkollektionen vor 120 min, zum Beispiel bei 30 min hinzufügen möchten. Für bessere Beurteilung der langlebigen Transkripte können die Ermittler weitere Musterkollektionen an späteren Zeitpunkten hinzufügen möchten.
Ein weiteres potenzielles Problem könnte wenn die Karies-Preise nicht die zu erwartende Verteilung folgen. Zum Beispiel gibt es möglicherweise zu viele oder zu wenige Gene zeigt einen Log-lineare Zerfall bewerten über 8 h. In diesem Fall ist es hilfreich, den Verfall Tarife von Genen zu überwachen, die bekannt sind, zu kurze oder langlebig sein, um festzustellen, ob sie das erwartete Muster folgen.Wenn Gene im Laufe der Zeit eine eher positive als negative Neigung aufweisen, können sie von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden, da sie keine Log-lineare Zerfallsrate erkennen lassen. Ein letztes Problem könnte auftreten, wenn die Zellen in den beiden verglichenen sehr unterschiedliche Antworten auf die ActD haben so, dass viele Gene schneller in einen Zustand verfallen. In diesem Fall kann es hilfreich sein, bezieht sich nicht nur auf die Differenz in Zerfallsrate zwischen den beiden Staaten, sondern auch auf die Spike-Steuerelemente, die wir vorschlagen, auch vor RNA-Isolierung, über absolute Verfall Preise in den beiden Staaten zu informieren.
Die Fähigkeit, Transkript Verfall Tarife proliferierende und ruhende Zellen oder irgendwelche zwei ähnliche Zustände zu überwachen hat das Potenzial, weiter Einblick in die Bedeutung der Niederschrift Verfall bei der Regulierung der physiologischer Veränderungen. Einsatzgebiete sind Zellen mit und ohne Onkogene Aktivierung, vor und nach der Seneszenz oder virale Infektion, mit und ohne Zuschlag eines bestimmten Gens oder in zwei verschiedenen Zuständen der Differenzierung. Die Ergebnisse können mit RNA-Seq, Informationen über Isoform-spezifische Steuersatzänderungen Transkript Verfall, die Einblick in die Veränderungen in Isoform Expression beobachtet, wie Zellen physiologischen Übergänge durchlaufen bieten können gekoppelt werden.
Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.
HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse zu HAC vom National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grant P50 GM071508 (p.i. David Botstein), PhRMA Foundation Grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879, David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, die Eli & Edythe breit Zentrum für Regenerative Medizin & Forschung an Stammzellen, die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, und die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
Equipment for running agarose gels | |||
Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
2.0 ml eppendorf tubes | |||
Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
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