Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten

Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.

Ruhe ist eine temporäre, reversibel in die Zellen Zellteilung aufgehört haben, aber weiterhin in der Lage zu vermehren. Mehrere Studien, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Ruhe weitverbreitete Änderungen in der Genexpression zugeordnet ist. Einige dieser Veränderungen entstehen durch Veränderungen in der Ebene oder die Aktivität der Verbreitung-assoziierten Transkriptionsfaktoren, wie E2F und MYC. Wir haben bewiesen, dass mRNA Zerfall auch auf Veränderungen in der Genexpression zwischen proliferierende und ruhende Zellen beitragen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die wuchernde und ruhende Kulturen der menschliche Vorhaut dermalen Fibroblasten. Wir beschreiben die Verfahren zur Hemmung der neue Transkription in proliferierende und ruhende Zellen mit Actinomycin D (ActD). ActD-Behandlung stellt einen einfache und reproduzierbaren Ansatz zu Wehre neue Transkription von Transkript Verfall dar. Ein Nachteil des ActD-Behandlung ist, dass der zeitliche Verlauf auf einem kurzen Zeitrahmen beschränkt sein muss, da ActD Zellviabilität auswirkt. Transkript-Spiegel sind im Laufe der Zeit zur Abschrift Zerfall bestimmen überwacht. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation von Genen und Isoformen, die differenzielle Zerfall im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten aufweisen.

Steady-State widerspiegeln Protokolle den Beitrag der Abschrift Synthese und Transkript Verfall. Reguliert und koordiniert Transkript Zerfall ist ein wichtiger Mechanismus zur Steuerung von biologischen Prozessen^1,2,3,4. Zum Beispiel wurden Transkript Verfall Preise gezeigt beizutragen, die zeitliche Abfolge der Ereignisse, die nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor⁵.

Wir haben bisher gezeigt, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe im primären menschlichen Fibroblasten mit Veränderungen in der Abschrift von vielen Genen⁶verbunden ist. Einige dieser Änderungen spiegeln Unterschiede in der Aktivität von Transkriptionsfaktoren zwischen diesen beiden Zuständen.

Änderungen in eine Abschrift Zerfallsrate können auch zu Änderungen bei der Ausdruck eine Abschrift in zwei verschiedenen Staaten^7,8beitragen. Basierend auf unserer früheren Feststellungen, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe verbunden mit Veränderungen in der Höhe von mehreren RNAs⁹wir gefragt, ob es auch ein Beitrag von differenziellen Transkript Verfall in der Veränderung ist Genexpression in versus Ruhestrom Fibroblasten vermehren.

Um die Abschrift Stabilität zu überwachen, haben wir die Rate des Zerfalls der Transkripte genomweite in versus ruhenden Zellen wuchern festgestellt. Um dies zu erreichen, überwachen wir Verfall Preise im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten durch die Einführung eines Inhibitors der neue Transkription und Überwachung die Rate an die einzelnen Protokolle im Laufe der Zeit verschwunden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Vergleich zu Methoden, die einfach insgesamt Genexpression, überwachen, indem Sie neue Transkript-Synthese hemmen, werden wir in der Lage die Zerfallsrate für diese Protokolle getrennt von der Rate, mit der sie bestimmen transkribiert.

ActD Behandlung neue Transkription hemmen und Transkript Verfall Preise bestimmen wurde erfolgreich in mehreren früheren Studien angewendet. ActD wurde zur sezieren der Bedeutungdes der RNA-Stabilität in die Änderungen in Hülle und Fülle der Niederschrift, die von einer Behandlung mit Pro-inflammatorischen Zytokinen⁵ergeben. Ein ähnlicher Ansatz hat auch zur sezieren die Unterschiede im Transkript Zerfallsrate in versus differenzierten C2C12 Zellen wuchern, wie sie eine differenzierte Muskel Phänotyp¹⁰annehmen. Als weiteres Beispiel globale mRNA Halbwertszeiten auch in pluripotente erkannt wurden und differenzierte Maus embryonale Stammzellen-¹¹. In diesen Beispielen nachweislich die mRNA Decay für die Regulierung der Abschrift Fülle und für den Übergang von Zellen in andere Zelle Staaten von Bedeutung sein.

Die nachfolgend beschriebenen Methoden anwenden, entdeckten wir Steuersatzänderungen Transkript Zerfall in ungefähr 500 Gene beim Vergleich von Fibroblasten in proliferierende und ruhende Staaten¹². Insbesondere, entdeckten wir, dass die Ziele der MicroRNA MiR-29, die in ruhenden Zellen herunterreguliert, stabilisiert werden, wenn Zellen in Ruhe übergehen. Wir beschreiben hier die Methode verwendeten wir Zerfall in proliferierende und ruhende Zellen zu bestimmen. Diese Methode eignet sich für Zinsprodukten mRNA Zerfall in zwei unterschiedliche, aber ähnliche Bedingungen zu vergleichen, wenn Informationen über rasch verfallenden Genen gesucht wird. Es könnte auch verwendet werden, andere Fragen wie die Wirkung der Zelle Kulturbedingungen auf Transkript Zerfall, zum Beispiel in zweidimensional im Vergleich zu drei dimensionale Kulturen anzusprechen. Decay Rate können bestimmt genomweite mit Methoden wie Microarrays oder RNA-FF alternativ in Echtzeit qPCR oder Nordbeflecken kann verwendet werden, um Verfall auf gen-durch-gen oder Isoform von Isoform Basis zu bestimmen. Diese Sätze können dann verwendet werden, um die Halbwertszeit von jedem überwachten gen zu berechnen und Gene mit Verfall zu identifizieren, die in zwei Bedingungen unterschiedlich sind.

Alle beschriebenen Experimente stimmten institutionelle Review Boards an der Princeton University und der University of California, Los Angeles.

1. bereiten Sie wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten für ActD zeitlicher Verlauf

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Timecourse mit vier Zeitpunkte. Drei biologisch unabhängige Stichproben können pro Timepoint gesammelt werden, durch das Sammeln von verschiedenen Gewebekultur Platten in einem Experiment, oder das Experiment kann mehrere Male mit unterschiedlichen Kulturen der Zellen wiederholt werden. Nach unserer Erfahrung bietet eine 10 cm (Durchmesser) Gewebekultur Teller (ein Teller) ausreichend RNA für die Analyse. Bei Bedarf können mehrere Gewebekultur Gerichte für jede Probe, die Zahl der Zellen in jedem Timepoint gebündelt. Darüber hinaus kann das gleiche Experiment durchgeführt werden, mit Fibroblasten aus verschiedenen Individuen isoliert, da wirklich unabhängige biologische repliziert.

1. Proliferierende und ruhende Kulturen der Zellen für die Mitschrift Verfall Analyse zu etablieren. Teilen Sie für wuchernden Zellen die Zellen alle drei Tage während der Kontakt gehemmt Zellen Kontakt gehemmt werden.
   1. Verändern Sie das Medium für die Kontakt-gehemmt Zellen alle 2 Tage für 7 Tage. Aufteilen der proliferierenden Zellen 2 Tage, bevor die Kontakt gehemmt Fibroblasten zur Abholung bereit ist. Ein Beispiel für eine Zelle-Kultur-Schema ist in Abbildung 1dargestellt. Die verbleibenden Schritte in diesem Abschnitt bieten ein detailliertes Protokoll für die Einrichtung und Aufteilung der Zellen.
2. Primäre dermale Fibroblasten von Neugeborenen Haut nach etablierte Protokolle¹³zu isolieren. Durchgang Fibroblasten um eine homogene Bevölkerung zu gewährleisten.
   Hinweis: Fibroblasten können eingefroren und wieder aufgetaut, wenn nötig.
3. Auftauen oder Fibroblasten, replate, wenn nötig. Wachsen Sie Fibroblasten in DMEM mit 10 % Serum unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂. Verwenden Sie die Fibroblasten, die für weniger als 10 Passagen angebaut wurden. Fibroblasten soll < 80 % Zusammenfluss am Tag der Teilung Zellen, wuchernde und ruhende Bevölkerungen zu machen.
4. In einer Gewebekultur-Platte in mehrere Platten, prewarm PBS, Trypsin und Medium mit Serum in einem 37 ° C Wasserbad 20 Minuten aufgeteilt.
5. Aspirieren Sie oder verwenden Sie ein Pipettieren jede Gewebekultur-Platte mit Zellen, formulierte werden das Medium entfernt.
6. Pipettieren warm PBS auf jede Platte (10 mL der Lösung für ein 150 mm Platte, 5 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte) und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte.
7. Absaugen oder pipettieren, PBS aus jeder Gewebekultur-Platte zu entfernen.
8. Sanft Pipettieren 1 x Trypsin-EDTA auf jede Platte (8 mL Lösung für einen 150 mm Teller, 3 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte).
   Hinweis: Stellen Sie 1 x Trypsin-EDTA durch Verdünnung steril 10 x Trypsin-EDTA in sterilen PBS. Die letzte 1 X Lösung sollte 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA.
9. Inkubieren Sie Trypsin mit Zellen für 5 min.
10. Klopfen Sie leicht die Platte, um Zellen von der Platte zu verdrängen.
11. Pipettieren, Zellen in eine einzelne Zelle Suspension aufzuwirbeln.
12. Übertragen Sie Zellen in Trypsin-Lösung auf eine konische Rohr mit dem gleichen Volumen DMEM mit 10 % Serum (8 mL Lösung für einen 150 mm Teller, 3 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen einer 12 gut Platte).
13. Spin-down Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 1000 X g , Trypsin zu entfernen.
14. Aufschwemmen Sie Zellen in einem entsprechenden Volumen des Mediums und zählen mit einer Hemacytometer Zelle Konzentration bestimmt.
15. Samen 5 x 10⁵ Zellen pro 100 mm Gewebekultur Platte für wuchernden und Kontakt-gehemmt.
16. Mit dieser Methode zu etablieren die wuchernden und Kontakt gehemmt Proben für Analyse (Abbildung 1) erforderlich.

(2) ActD zeitlicher Verlauf

1. Aufschwemmen Sie ActD in ein Lager Konzentration von 1 mg/mL (für 1 mg des ActD, Einsatz 950 µL steriler PBS und 50 µL steriler DMSO).
   Hinweis: Gefrorene Stammlösungen ActD sollte stabil für einen Monat bei-20 ° c sein Verdünnte Lösungen sollten verworfen und nicht zur weiteren Verwendung gespeichert werden.
2. Das entsprechende Volumen der vorgewärmte Medium ActD hinzufügen, für alle biologischen replizieren Zellkultur-Platten wurden für die 0, 120, 240 und 480 min Zeitpunkte (Abbildung 2) eingerichtet. ActD in einer Konzentration von 15 µg pro mL Medium hinzufügen. Mischen Sie gut, aspirieren Sie das alte Medium, und die Zellen fügen Sie ActD-haltigen Medium hinzu.
   1. Für eine 1 mg/mL Brühe hinzufügen 15 µL ActD für jedes mL Medium, z. B.für 10 mL Medium für eine 100 mm-Platte hinzufügen 150 µL ActD.
3. Die Null Timepoint Probe sammeln, sanft aus dem ActD Medium und Pipettieren Aspirieren vorgewärmt PBS auf die Zellen. Pipettieren 10 mL der Lösung für ein 150 mm-Platte, 5 mL der Lösung für eine 100 mm-Platte, 2 mL für einen Brunnen von einem 6-well-Platte und 1 mL für einen Brunnen von einem 12-well-Platte.
4. Aspirieren Sie sanft oder Pipettieren von PBS.
   Hinweis: Alle Schritte mit RNA Isolierung sollte mit RNase-freies Wasser, RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen und RNase-freie Pipetten durchgeführt werden. Handschuhe sollten getragen und verändert oft beim Arbeiten mit RNA.
5. Fügen Sie Phenol-Guanidin-Herstellung-Lösung (1 mL/10-cm-Platte mit 4 x 10⁵ 4 x 10⁷ Zellen) direkt in der Gewebekultur-Platte.
   Hinweis: Phenol-Guanidin erfolgt ist eine monophasische Lösung, die RNS-Qualität hält während der Lyse der Zellen und DNA, RNA und Protein voneinander zu trennen.
   Achtung: Phenol und Guanidin Herstellung sind korrosiv. Verwenden Sie geeignete Schutzmaßnahmen.
6. Pipettieren der Phenol-Guanidin erfolgt Lösungszelle Gemisch nach oben und unten mehrmals, um eine homogene Mischung zu machen.
   Hinweis: Phenol-Guanidin erfolgt Lösung lysate kann bei 4 ° C über Nacht oder bei-20 ° C bis zu einem Jahr aufbewahrt werden.
7. Sammeln Sie jeden Zeitpunkt, nachdem die entsprechende Menge an Zeit vergangen ist in Schritte 2.3-2.6 beschriebene Methode verwenden.

3. Isolation von Gesamt-RNS von Phenol-Guanidin erfolgt Lösung Lysate

1. Inkubieren Sie Proben bei Raumtemperatur für 5 min um die vollständige Auflösung der RNA-Protein-komplexe zu gewährleisten.
   Hinweis: Die Schritte des Protokolls Phenol-Guanidin erfolgt Lösung können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
2. Stellen Sie Spike-Steuerelement-Transkripte, die mit der Methodik erkannt werden können.

4. Analyse der Abschrift Fülle

1. Quantifizieren Sie, RNA und prüfen Sie RNA auf Reinheit mit einem Spektralphotometer.
   Hinweis: Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm, 280 nm sollte ungefähr 2.0 für RNA.
2. Analysieren Sie RNA mit einer 1 % Agarosegel oder eine gleichwertige Technologie, das Ausmaß der Schädigung zu visualisieren.
   Hinweis: Zwei klare Bands vertreten 18 s und 28 s rRNA sollte deutlich sichtbar (Abbildung 4). Wenn diese Bänder nicht sichtbar sind, kann die RNA beeinträchtigt werden. Trouble shooting Tipps für RNA-Abbau sind in der Diskussion zur Verfügung gestellt.
3. Northern blots¹⁸oder Monitor Transkript Fülle in den gesammelten Aliquote RNA verglichen mit Pfennigabsatz in internen Standards mittels Microarrays¹⁵, RNA-Seq¹⁶, Echtzeit-qPCR¹⁷.
   1. Bestimmen Sie die Hülle und Fülle für jedes Protokoll zu jedem Zeitpunkt im Vergleich mit einer Steuerung versetzt-in der bekannten Fülle.
      Hinweis: Für Microarrays werden die Werte Fluoreszenz-Intensitäten. Für Nordflecken können Bands auf dem Röntgenfilm quantifiziert werden. Für Echtzeit-qPCR kann durch Vergleich mit bekannten Standards mit der 2^{- σσC}-_T -Methode¹⁹Transkript Fülle bestimmt werden. Für RNA-Seq können als FPKM oder Fragmente pro Kilobase Exon pro million liest abgebildet normalisierte Werte ermittelt werden. Isoform-spezifische Verfall Preise können mit Isoform bewusst Methoden wie DEXSeq²⁰RNA-Seq-Daten analysiert werden. Isoform-spezifische Verfall Preise richten sich am besten mit RNA-seq. Wenn sie mit Microarray Daten ermittelt werden sollen, müssen die Daten auf einer Sonde durch die Sonde Basis anstatt einer gen durch gen-Basis analysiert werden. Die Analyst muss bei der Interpretation der Informationen aus einer begrenzten Anzahl von Sonden aufpassen. Z. B. möglicherweise höchstens 5 Sonden, die über eine bestimmte Isoform informativ sind. In diesem Fall wird die Analyst benötigen, um festzustellen, ob das Verhalten von diese Sonden hinreichend konsistent ist, damit die Ergebnisse zuverlässig sind.
4. Führen Sie in Echtzeit qPCR auf der isolierten RNA¹⁷ in den gesammelten Proben analysieren rasch verfallenden Gene, wie c-Myc und ein langsam verfallenden gen wie GAPDH, Vertrauen zu gewinnen das Transkript-Zerfall, die Preise genau erfasst wurden.
   Hinweis: Für weitere Bestätigung Echtzeit qPCR Isoform-spezifischen Sonden können entwickelt und verwendet, um die Fülle an spezifische Isoformen über Zeit²¹überwachen.

5.Konstante Tariffindung Verfall

1. Für jede Timepoint Log-Transformation die Fülle Werte für jedes Protokoll (Gen-spezifische oder Isoform-spezifisch).
   Hinweis: Log-Transformation werden die Werte exponentiellen Zerfall Kurven Linien konvertieren, die mit einem linearen Verfall Modell²²passen können.
2. Passen Sie der Ausdruck Profil für jedes Protokoll (Gen-spezifische oder Isoform-spezifische) zu einem linearen Verfall Modell. Die Formel für ein solches Modell ist f(t) = C - R * t. In dieser Gleichung C ist eine konstante, die eine Abschrift des Ausgangsbetrags darstellt, R ist der Rückgang und t ist die Zeit seit Beginn des Experiments. Aus dieser Gleichung bestimmen die Zerfallsrate als r*ln(10) (siehe Referenz-¹¹).
   Hinweis: Die MaSigPro-Software-Paket ist eine Regression basierenden Ansatz entwickelt, um signifikante gen Ausdruck Profil Unterschiede in Zeit Kurs Daten²³erkennen. Beispielcode und Ergebnisse für die MaSigPro stehen an: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
3. Gene, die eine Log-lineare Verfall Modellanpassung nicht herausfiltern. Dies kann mit einem ANOVA F-Test erreicht werden.
   Hinweis: der F-Test basiert auf der F-Statistik, definiert als die Variation zwischen Probe dividiert durch die Variation innerhalb der Proben. Korrigieren Sie die p-Werte für multiple Vergleiche durch die Anwendung der linearen step-up Benjamini und Hochberg false Discovery Verfahren²⁴. Ein Q-Wert größer als 0,05 mit dem F-Test als eine Abkürzung für Gene verwendet werden kann, die kein Log-lineare Verfall Modell passen.
4. Führen Sie einen ANOVA F-Test um Abschriften mit eine signifikante Wechselwirkung Laufzeit zwischen einem kategorischen Zellzyklus Zustand und die Zeit zu bestimmen (false Discovery Rate, FDR < 0,05).

Zuvor haben wir die Ergebnisse der Microarray Analysen der Abschrift Zerfall Sätze in wuchernden und Kontakt gehemmt primären menschlichen Fibroblasten über einen 8-Stunden-Kurs¹²berichtet. Eine Liste von Genen mit eine signifikante Veränderung im Transkript Stabilität Vergleich wuchernde und Kontakt gehemmt Fibroblasten dient in ergänzenden Tabelle1. Die Fluoreszenz-Intensitäten zum Zeitpunkt Null und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behandlung stehen zur Verfügung. Gene wurden in die Liste aufgenommen, durch die Bestimmung der Gene, die deutlich unterschiedliche Steigungen im wuchernden und Kontakt gehemmt Bedingungen mit einem ANOVA F-Test haben. Beispiele von Genen mit unterschiedlichen Zerfall in proliferierende und ruhende Fibroblasten sind in Abbildung 5dargestellt.

Abbildung 1 : Schaltplan des Protokolls für die Festlegung der wuchernden und Kontakt gehemmt Platten für Kurs Zeitanalysen ActD. Tag für Tag ist die erforderlichen Maßnahmen, um die Kulturen der Zellen für ActD Behandlung zu etablieren beschrieben unter der Annahme, dass vier Zeitpunkte für den zeitlichen Verlauf verwendet werden. Der Einfachheit halber eine Platte ist pro Timepoint gezeigt, aber Zusatzplatten zugesetzt werden, um biologische Wiederholungen zu erzeugen. Das Protokoll kann auch eingestellt werden, um mehr Platten Zellen hinzuzufügen, wenn mehr als vier Zeitpunkte gewünscht werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Schematische Darstellung des ActD zeitlichen Verlauf und Verfall bewerten Berechnungen in ruhenden im Vergleich zu den wuchernden menschlichen Fibroblasten. Der erwartete Anteil der mRNAs bleiben im Laufe der Zeit für eine hypothetische Abschrift nach Behandlung mit einem transkriptionelle Inhibitor angezeigt wird. Unten, Probeflächen des Bruchs der mRNA verbleibenden im Laufe der Zeit sind Gene, die stabiler sind vorgesehenen Ruhestrom als wuchernden Zellen und Gene, die stabiler im wuchernden als ruhende Zellen sind. Für jeden Datenpunkt wird aus Gründen der Übersichtlichkeit nur ein einzelner Wert angezeigt. In das eigentliche Protokoll werden drei Datenpunkte für jedes Timepoint. Diese Zahl wurde von Elizabeth Pender Johnsons Dissertation mit ihrer Zustimmung geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Fotos von Phenol-Guanidin-Herstellung-Reagenz und Chloroform mischen vor und nach der Zentrifugierung. Die Mischung wird angezeigt wenn die Phenol-Guanidin-Herstellung-Reagenz und Chloroform zunächst, nach dem Mischen und nach Zentrifugation kombiniert werden. Nachdem die Mischung zentrifugiert wird, ist die untere Phase, die rot ist, die organische Phase. Die Interphase in der Mitte ist weiß und trübe. Die obere Phase ist die wässrige Phase und es ist klar. Die RNA ist in der wässrigen Phase, die mit einer Pipette zur Fällung gesammelt werden sollten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Probe RNA Gel, RNS-Qualität zu überwachen. Eine Abbildung von einer RNA-Gel Proben mit intakten RNA zeigt. Intakte RNA hat prominente Bands für die 28 s und 18 s rRNAs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Beispiele von Genen mit unterschiedlichen Verfall Raten im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten. Fluoreszenz-Intensitäten (Genexpression) im Laufe der Zeit sind für vier Gene angezeigt, die anders in proliferierenden versus Ruhestrom Fibroblasten zerfallen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Tabelle1: Gen-spezifischen Fluoreszenz-Intensität im wuchernden und ruhenden Fibroblasten. Daten sind Kontakt gehemmt und zur Verfügung gestellt für Zeitlosigkeit und über einen zeitlichen Verlauf nach ActD Behandlung in proliferierenden Fibroblasten. P-Werte, Q-Werte und falsche Entdeckung Preise stehen zur Verfügung. Tabelle wird aus seiner ursprünglichen Veröffentlichung im BMC Genomics¹²abgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Stille kann durch externe Signale einschließlich Rücknahme Mitogene oder Serum, mangelnde Zelladhäsion und Kontakt Hemmung induziert werden. Kontakt-Hemmung, einer von mehreren möglichen Methoden zur Induktion der Ruhe, ist ein höchst evolutionär konservierte Prozess in dem Zellen der proliferativen Zellzyklus in Reaktion auf Zell-Zell-Kontakt beenden. Wir konzentrieren uns hier auf Kontakt Hemmung als Beispiel für eine Methode, um Ruhe zu induzieren. Frühere Studien haben berichtet, dass Zell-Zell-Kontakt MicroRNA Biogenese²⁵beeinflussen kann, so die Ergebnisse Auskunft über eine Ruhe-Methode geben und weitere Studien erforderlich sind, um festzustellen, welche Änderungen mit Ruhe verbunden sind per se.

Wir verwendeten primären menschliche diploide Fibroblasten, die wir von Neugeborenen Haut isoliert. Wir initiierten diese Experimente mit Fibroblasten, die weniger als 10 mal passagiert wurden. Wir später-Passage Fibroblasten verworfen, weil sie Senesce. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf proliferierende und ruhende dermalen Fibroblasten, können die beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Verfall Tarife in verschiedenen Arten von Zellen und unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen.

Wir überwachen mRNA Decay Preise genomweite mit einem Transkription Abschaltzeit Kurs. Abschaltzeit Kurse sind die am weitesten verbreitete Methode zur Entkopplung von mRNA Zerfall von mRNA-Transkription um mRNA Halbwertszeiten^1,26zu berechnen. In der Methode beschriebenen ActD, ein Medikament, dass komplexe mit der B-Form der DNA zu blockieren, Dehnung der RNA-Polymerase II, wird verwendet, um die Transkription von mRNAs²⁷zu verhaften. Die Rate, die Transkripte in Hülle und Fülle über einen 8-Stunden-Zeitraum verringern kann als das Transkript Zerfallsrate ermittelt werden.

Eine wichtige Einschränkung des ActD-basierte Ansätze für die Überwachung der Abschrift Verfall ist, dass ActD globale Transkription wird verhindert, dass die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken wird. Dies sollte im Auge behalten werden, bei der Interpretation ActD-basierte Daten, wie Zerfall Preise in Zellen festgelegt werden, die mehr als ihren Heimatstaat gestresst sind. Ein weiteres wichtiges Anliegen ist, dass die Auswirkungen des ActD für Zellen in verschiedenen Staaten, einschließlich der wuchernden versus Kontakt gehemmt Fibroblasten abweichen können. Ein Ansatz zur Minimierung der Nebenwirkungen des ActD-Behandlung ist Zeit Kurse kurzer Dauer zu halten. Aus diesem Grund haben wir einen 8 h Zeit Kurs ausgewählt.

Für die Überwachung der Abschrift Verfall Preise^28,29gibt es alternative Ansätze ActD. Hefestämme mit temperaturempfindlichen RNA Polymerase II Allele wurden zur Abschrift Decay Rate³⁰zu überwachen. Eine Abwandlung dieser Ansatz namens "Anker-away" wurde in der Hefe zur bedingten Abbau der RNA-Polymerase II als Reaktion auf Rapamycin Behandlung^31,32zu erreichen. Es ist auch möglich, Zerfall in den Zellen mit aktive Transkription zu überwachen. Zum Beispiel Thio ersetzt Uracil Nukleotide können in Zellen eingebracht werden, mRNA eingearbeitet und anschließend erkannt^33,34,35. Mit diesem Ansatz kann die Rate, an der verschiedene Transkripte synthetisiert werden, in Zellen ermittelt werden, die weiterhin mRNA synthetisieren. Solche Ansätze haben einen deutlichen Vorteil gegenüber ActD-Behandlung, weil sie nicht giftig sind. In unserer Erfahrung kann es jedoch Variabilität bei der Wiedergewinnung der Transkripte mit diesen Methoden. ActD-Behandlung ist eine einfache und reproduzierbare Ansatz für die Überwachung der Abschrift Verfall.

Ein paar Schritte in das Protokoll zur Verfügung gestellt sind entscheidend für ihren Erfolg. Ein wichtiges Thema ist RNA-Abbau während RNA Isolierung verhindert. Bei Schritt 4.1 sollte für den Abbau die RNA überwacht werden. Wenn die RNA nicht zwei klare Spitzen für 18 s und 28 s rRNAs (Abbildung 4) enthält, ist dies ein Zeichen, dass die Abschrift Verschlechterung eingetreten ist. Einige Geräte bieten RNA Integrität Anzahl (RIN) Noten von 1 bis 10. Proben mit RIN Noten im Bereich von 7 bis 10 sind akzeptabel für die weitere Analyse. Wenn die RNA abgebaut wird, ist es wichtig, weitere Vorkehrungen treffen, um zu verhindern, dass RNA-Abbau, wie sichergestellt wird, die Lösungen und Sterileware RNase-frei sind, und die Handschuhe sind beim Umgang mit RNA Pipetten. Wasser kann mit 0,1 % Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) für mindestens 2 h bei 37 ° C inkubiert vorbehandelt und autoklaviert für mindestens 15 min. beachten Sie nicht, dass DEPC mit Tris-basierte Puffer verwendet werden. RNase dekontaminierende Lösungen auch verwendet werden, können zu entfernen RNase von Arbeitsflächen, Zentrifugen, Pipetten und Reagenzien, die RNases hemmen kann Proben hinzugefügt werden.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Trennung der Phasen der Phenol-Guanidin-Herstellung-Lösung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass nur die obere Phase für RNA gesammelt werden verarbeitet. Enthält die resultierende RNA residual Phenol, das Verhältnis der Extinktion bei 230, 260 und 280 nm werden nicht im Verhältnis 1:2:1 wie erwartet. Höher als erwarteten Extinktion bei 230 nm kann zeigen Phenol Belastung. In diesem Fall kann die RNA Ethanol wieder ausgefällt und zusätzliche mehrmals um jede verbleibende Phenol zu entfernen gewaschen.

Schließlich kann wenn die RNA pelleted und der Überstand wird entfernt, das Pellet klebrig, dünn und leicht gestört werden. An dieser Stelle ist es wichtig, besonders vorsichtig in die Flüssigkeit ausziehen. Es kann wichtig sein, visualisieren Sie das Rohr mit guter Beleuchtung zu lokalisieren das Pellet und stellen Sie sicher, dass sie nicht gestört wird. Zusätzliche Glykogen kann helfen, um sicherzustellen, dass die Pellets an dieser Stelle sichtbar ist.

Die Auswahl der Zeitpunkte für den zeitlichen Verlauf des Zerfalls ist auch ein wichtiges Thema zu berücksichtigen. Während der vier Zeitpunkte von die uns ausgewählten Decay für mehr als 10.000 Gene Kontrolle erlaubt, einige Gene nicht erheblich im Laufe 8 h Zeit zerfallen. Wenn kurzlebige Transkripte eine hohe Priorität sind, können die Ermittler weitere Musterkollektionen vor 120 min, zum Beispiel bei 30 min hinzufügen möchten. Für bessere Beurteilung der langlebigen Transkripte können die Ermittler weitere Musterkollektionen an späteren Zeitpunkten hinzufügen möchten.

Ein weiteres potenzielles Problem könnte wenn die Karies-Preise nicht die zu erwartende Verteilung folgen. Zum Beispiel gibt es möglicherweise zu viele oder zu wenige Gene zeigt einen Log-lineare Zerfall bewerten über 8 h. In diesem Fall ist es hilfreich, den Verfall Tarife von Genen zu überwachen, die bekannt sind, zu kurze oder langlebig sein, um festzustellen, ob sie das erwartete Muster folgen.Wenn Gene im Laufe der Zeit eine eher positive als negative Neigung aufweisen, können sie von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden, da sie keine Log-lineare Zerfallsrate erkennen lassen. Ein letztes Problem könnte auftreten, wenn die Zellen in den beiden verglichenen sehr unterschiedliche Antworten auf die ActD haben so, dass viele Gene schneller in einen Zustand verfallen. In diesem Fall kann es hilfreich sein, bezieht sich nicht nur auf die Differenz in Zerfallsrate zwischen den beiden Staaten, sondern auch auf die Spike-Steuerelemente, die wir vorschlagen, auch vor RNA-Isolierung, über absolute Verfall Preise in den beiden Staaten zu informieren.

Die Fähigkeit, Transkript Verfall Tarife proliferierende und ruhende Zellen oder irgendwelche zwei ähnliche Zustände zu überwachen hat das Potenzial, weiter Einblick in die Bedeutung der Niederschrift Verfall bei der Regulierung der physiologischer Veränderungen. Einsatzgebiete sind Zellen mit und ohne Onkogene Aktivierung, vor und nach der Seneszenz oder virale Infektion, mit und ohne Zuschlag eines bestimmten Gens oder in zwei verschiedenen Zuständen der Differenzierung. Die Ergebnisse können mit RNA-Seq, Informationen über Isoform-spezifische Steuersatzänderungen Transkript Verfall, die Einblick in die Veränderungen in Isoform Expression beobachtet, wie Zellen physiologischen Übergänge durchlaufen bieten können gekoppelt werden.

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse zu HAC vom National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grant P50 GM071508 (p.i. David Botstein), PhRMA Foundation Grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879, David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, die Eli & Edythe breit Zentrum für Regenerative Medizin & Forschung an Stammzellen, die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, und die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.