Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Die Mechanismen zur Regulierung der mRNA Übersetzung sind in verschiedenen biologischen Prozessen, wie z. B. Entwicklung von Keim, Zelldifferenzierung und Organogenese, sowie mehrere Krankheiten beteiligt. Zahlreiche Publikationen haben überzeugend gezeigt, dass spezifische Mechanismen eng mRNA Übersetzung regulieren. Verstärktes Interesse an der Übersetzung-induzierte Verordnung der Proteinexpression führte zur Entwicklung neuer Methoden zu studieren und de Novo Protein Synthese in Cellulofolgen. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex, so dass sie kostspielig und häufig Begrenzung der Anzahl der mRNA-Ziele, die studiert werden kann. Dieses Manuskript schlägt eine Methode, die erfordert nur grundlegende Reagenzien und konfokale Fluoreszenz-imaging-System zu messen und zu visualisieren, die Änderungen in der Übersetzung der mRNA, die in jede Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen auftreten. Diese Methode wurde vor kurzem zur lokalisierte Übersetzung in die subzellulären Strukturen der adhärenten Zellen über einen kurzen Zeitraum hinweg, bietet somit die Möglichkeit der Visualisierung de Novo Übersetzung für eine kurze Zeit während einer Vielzahl von biologischen zeigen Prozesse oder Änderungen in translational Aktivität in Reaktion auf bestimmte Reize zu validieren.

Die Regulierung der Übersetzung durch verschiedene Zellfunktionen veranlasste viele Forschungsgruppen zu entwickeln, neue Werkzeuge und Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von mRNA Übersetzung und regulierte Protein Synthese^{1,2 ,3,4}. Diese jüngsten technologischen Fortschritte ermöglichen ein besseres Verständnis der Mechanismen, bei denen Übersetzung Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs bei biologischen Prozessen wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung^{5 ,6,7,8}. Die meisten dieser Methoden erfordern jedoch teuer oder gefährlichen Reagenzien und spezielle Ausrüstung, die möglicherweise nicht die meisten Laboratorien zur Verfügung. Als solche wurde eine kostengünstige Methode ermöglicht die schnelle Beurteilung der Übersetzung Veranstaltungen entwickelt, um speziell diese potenzielle Probleme zu umgehen. Diese Methode erkennt akute translationale Modulationen, die auftreten, während spezifische zelluläre Prozesse und ermöglicht auch für die Lokalisierung der Übersetzung mit der konfokalen Mikroskopie.

Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um lokalisierte Übersetzung innerhalb subzelluläre Kompartimente genannt Verbreitung Einleitung-Center (SIC)⁵zu überwachen. SICs sind vorübergehende Strukturen gefunden in gesetzte Zellen, die auf der Oberseite entstehende Haftung komplexe lokalisiert sind. Obwohl SICs und Adhäsion komplexe unterscheiden, sind ihre Schicksale eng verbunden. In der Tat SICs bekannt, um auf komplexe fokale Adhäsion Reifung zu einem Haftung während der Anfangsphase der Adhäsion allmählich. Wir fanden, dass RNA-bindende Proteine bekannt, um mRNA Übersetzung (z. B. Sam68, FMRP und G3BP1) gezielt zu steuern und Polyadenylated RNAs, innerhalb dieser angereichert wurden Strukturen⁵. Mit den beschriebenen Methoden hier, haben wir gezeigt, dass die Regulierung der SIC-assoziierte mRNA Übersetzung wirkt als ein Checkpoint erlaubt Zellen zur Konsolidierung der Zelladhäsion gesät. Diese Methode, basierend auf Puromycin Aufnahme konnte eine angepasste Version der Oberfläche Sensing Übersetzung Assay (Sonnenuntergang) betrachtet werden. Ursprünglich entwickelt, um globale Protein Synthese mit einem nicht radioaktiv markierte Aminosäure messen, bietet Protein Puromycilation eine effiziente Möglichkeit, de Novo Protein Synthese⁹zu visualisieren. Diese Methode beruht auf das innere Verhalten von Puromycin, ein Antibiotikum, das Übersetzung durch vorzeitigen Kettenabbruch in den Ribosom¹⁰blockiert. In der Tat ist Puromycin strukturell analog zu Tyrosyl-tRNA, wodurch für den Einbau in Peptidketten über die Bildung einer Peptidbindung verlängern. Puromycin Bindung an eine wachsende Peptid-Kette verhindert jedoch eine neue Peptidbindung gebildet wird mit der nächsten Aminoacyl-tRNA, da Puromycin eine nicht wasserlöslicher Amid-Bindung anstelle der wasserlöslicher Esterbindung in tRNAs gefunden hat. So entsteht die Einbeziehung von Puromycin in Polypeptide verlängern in der vorzeitigen Veröffentlichung von zahlreichen abgeschnittene Puromycilated Polypeptide entsprechend aktiv übersetzten mRNA^9,11,12 .

Mit dieser Methode war es möglich, innerhalb kurzer Zeit Witwe aktive Übersetzung bewerten (z. B. 5 min.) während zellulare Adhäsion über einen spezifischen Antikörper gegen Puromycin auf Zellen, die über einen Zeitraum von 5 Minuten mit dem Antibiotikum ergänzt wurden verarbeiten Sie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Zelladhäsion⁵. Die Genauigkeit dieser Assay stützt sich auf hochspezifische Antikörper gegen die Puromycilated glyko-gerichtet. Immunofluorescent Erkennung des Polypeptids Puromycilated bietet eine allgemeine subzelluläre Verteilung der neu übersetzten mRNA, die auch mit großer Genauigkeit mit konfokale bildgebenden Systemen quantifiziert werden kann.

Daher bietet diese Methode eine entsprechende Option für eine große Anzahl von Laboren Studium translationale Regulationsmechanismen in Prozesse wie neuronale Granulation^{6,13,14, 15}, Morphogen mRNA Lokalisierung und Übersetzung während der Entwicklung^16,17. Es eignet sich auch gut zum Studium lokalisierte oder unterteilte Übersetzung während der schnellen biologischen Ereignisse, wie Zellwanderung, Haftung oder Invasion oder einfach beurteilen medikamentöse Behandlungen, die translational Änderungen^5, induzieren könnte ^{7 , 18}. insgesamt ermöglicht diese Methode zur Visualisierung von lokalisierten oder kontrollierte Übersetzung Ereignisse auf eine schnelle, genaue und kostengünstige Weise.

1. Bestimmung der Puromycilation Bedingungen

Hinweis: Diese Technik beschreibt die Methode verwendet, um lokalisierte Übersetzung während der MRC-5 Zelle Adhäsion Prozess ⁵ bewerten. Als Puromycilation in einer beliebigen Zelle getan werden kann, ist es wichtig, die Puromycilation Bedingungen für die spezifische Zelllinien verwendet werden, zu optimieren, da die Behandlungsbedingungen für jede Zelllinie in Bezug auf die Puromycin-Konzentration und die gewünschte nicht identisch Inkubationszeit. Um zu zeigen, wie diese Bedingungen definiert werden, drei Beispiel-Zelllinien (z. B. HeLa, MRC-5 und Huh-7) mit steigenden Konzentrationen von Puromycin für unterschiedliche Inkubationszeiten behandelt wurden ( Abbildung 1).

1. Wachsen identische Zahl von Zellen in einer 24-Well-Platte in 0,5 mL der entsprechenden runden Kulturmedium 16 h vor dem Test. 30.000 MRC-5 Samenzellen, 50.000 HeLa-Zellen oder 50.000 HuH-7 Zellen pro Bohrloch. Vermeiden Sie mehr als 60-70 % Zusammenfluss (Abbildung 1A).
2. Rohre vorbereiten 6 mit 1,5 mL komplette Zellkulturmedium mit steigenden Konzentrationen von Puromycin (0, 5, 10, 15, 20 und 30 µg/mL). Bereits bei 37 ° c warme
3. Für jede Konzentration von Puromycin Medium (vorbereitet in Schritt 1.2), transfer von 0,5 mL jeweils Tubus in 6 neue Rohre und alle 6 neue Rohre Cycloheximide auf eine Endkonzentration von 50 µg/mL hinzufügen. Bereits bei 37 ° c warme
4. Das Medium mit 0,5 mL komplette Kulturmedium (Zeile 1 und 2) verändern. Für die dritte Zeile hinzufügen 0,5 mL komplette Kulturmedium ergänzt mit 50 µg/mL Cycloheximide ( Abbildung 1 b).
   Hinweis: Cycloheximide Behandlung etablierte als die beste Negativkontrolle für Protein Puromycilation wegen seiner Fähigkeit, Übersetzung Dehnung zu blockieren. Da Puromycin Einbeziehung Übersetzung Dehnung erfordert, Cycloheximide Behandlung führt zu einem Verlust von Puromycilated Protein Signale ^{5 , 18}.
5. 15 min bei 37 ° C (5 % CO ₂) inkubieren.
6. Hinzufügen 0,5 mL des Mediums Puromycin vorbereitet in Schritt 1.2 der zweiten Zeile zu Endkonzentrationen von 0, 2,5, 5, 7,5, 10 und 15 µg/mL, bzw. in den Spalten A, B, C, D, E und F. Zum gleichen Zeitpunkt hinzufügen 0,5 mL Puromycin Cycloheximide ergänzt Medium (Schritt 1.3) in der dritten Zeile ( Abbildung 1).
7. 5 min bei 37 ° C (5 % CO ₂) inkubieren.
8. Hinzufügen 0,5 mL des Mediums Puromycin vorbereitet in Schritt 1.2 in die erste Zeile zu Endkonzentrationen von 0.0, 2,5, 5, 7,5, 10 und 15 µg/mL ( Abbildung 1).
9. 5 min bei 37 ° C (5 % CO ₂) inkubieren.
10. Waschen jeweils gut von Zeilen 1 bis 3 mit 1 mL eiskaltes 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 5 min nach der Zugabe von Puromycin in Vertiefungen der ersten Zeile (zweimal waschen). Fügen Sie 75 µL 1 X Laemmli-Puffer (4 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 4 % 2-Mercaptoethanol, 0.120 M Tris-HCl pH 6,8, 0,004 % Bromophenol blue und 10 % Glycerin), ganze Zelle Lysates für jede Kondition zu erhalten.
11. Run 10 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit 1/3 der vorbereiteten Proben Puromycin Aufnahme zu beurteilen.
    1. Bestimmen Sie die Höhe der Puromycin Einbeziehung von Western-Blot Analyse mit einem Anti-Puromycin Antikörper (12 D 10) in einem Verhältnis von 1: 25.000 in Primärantikörper Inkubation Puffer (2 % Rinderserumalbumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 und 0,01 % verdünnt Natriumazid).
       Hinweis: Repräsentative Bilder entsprechend verschiedenen Zellextrakte Linie gemacht, wie in Schritt 1 beschrieben sind beispielhaft in Abbildung 2 gezeigt.

2. In Cellulo Lokalisierte Übersetzung Visualisierung

Hinweis: die hier beschriebene Technik wurde verwendet, um lokalisierte Übersetzung innerhalb von SICs im MRC-5 Zellen während der Adhäsion Prozess ⁵ zu bewerten. Obwohl hier MRC-5 Zellen verwendet werden, können andere Zell-Linien mit der gleichen Methode im Schritt 2.1 beschrieben verwendet werden.

1. Handy-Vorbereitung.
   1. Trennen MRC-5 Zellen mit 0,25 % Trypsin/2,21 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in Hank ' s ausgewogen Salz Lösung (HBSS). Pellet-Zellen durch Zentrifugation (5 min bei 200 X g) in einem 15 mL konische Zentrifugenröhrchen und hängen Sie sie in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 40.000 Zellen/mL nach Auszählung mit einer Zählkammer.
   2. Brüten die suspendierten Zellen bei 37 ° C unter sanften Drehung mithilfe einer Rohr-Rotator für 20 min, um sie in der Schwebe zu halten.
      Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um die vollständige Dissoziation der komplexe fokale Adhäsion zu ermöglichen.
   3. Platte 2 mL der suspendierten MRC-5 Zellen (40.000 Zellen/mL) in zwei 35-mm-Glasboden-Gerichte. Verwenden Sie das erste 35-mm-Glasboden-Gericht für die Puromycilation-Assay (siehe Punkt 2.1.5) und die zweite als eine negative Kontrolle verwenden (siehe Schritt 2.1.6).
   4. Halten die Zellen bei 37 ° C (5 % CO ₂) 55 min., um zelluläre Adhäsion und SIC Bildung zu ermöglichen.
   5. Add Puromycin auf das Medium in der 35-mm-Glasboden-Gerichte (Assay) mit der Konzentration, die zuvor definiert in Abschnitt 1. MRC-5 Zellen zu behandeln, verwenden Sie 10 µg/mL Puromycin für 5 min bei 37 ° C (5 % CO ₂).
   6. Als Negativkontrolle, hinzufügen Cycloheximide in die zweite Schale 35 mm Glasboden 40 min nach der Aussaat der Zellen, um sie mit 50 µg/mL Cycloheximide ( Abb. 2 b) vorzubehandeln. 15 min nach Cycloheximide hinaus fügen dann Puromycin, das Medium mit der gleichen Konzentration und Inkubation Zeit wie in Schritt 2.1.5 (z. B. Verwendung 10 µg/mL Puromycin für 5 min bei 37 ° C (5 % CO ₂) für die MRC-5).
   7. Waschen jede Platte zweimal mit 2 mL eiskaltes 1 X PBS und befestigen Sie die Zellen mit 1 mL 4 % Formaldehyd (in 1 X PBS verdünnt) für 15 min bei Raumtemperatur (RT).
      Achtung: Paraformaldehyd muss ausschließlich verwendet in einer chemischen Kapuze.
2. Immunostaining.
   1. Nach Paraformaldehyd Fixierung, dreimal mit 2 mL 1 X PBS waschen und in 500 µL PBS-TritonX-100 (0,5 %) für 20 min bei RT in den Zellen permeabilize inkubieren.
   2. Um unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, blockieren die Probe mit 500 µL PBS – BSA (1 %) für 20 min bei RT
   3. Waschen Sie dreimal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und inkubieren Sie mit 300 µL Anti-Puromycin Antikörper (12 D 10) verdünnt 1:12,500 mit 1 X PBS-Puffer für 1 h bei RT.
   4. Waschen 3 Mal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und inkubieren Sie mit 300 µL Anti-Maus IgG konjugiert zu einem Fluorophore (hier, 488 nm) verdünnt mit PBS-Puffer Puromycilated Polypeptide zu visualisieren und mit Phalloidin konjugiert zu einem anderen Fluorophor (hier, 555 nm) F-Aktin zu visualisieren. 1 h bei RT inkubieren
   5. Waschen dreimal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und inkubieren Sie für 5 min bei RT in 300 µL PBS-Tween20 (0,1 %) ergänzt mit 1 µg/mL 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
   6. Waschen dreimal mit 2 mL PBS-Tween20 (0,1 %) und dann mit 2 mL 1 X PBS waschen. Verhindern, dass Zellen trocknen, indem man die Probe in 2 mL 1 X PBS während der Bildaufnahme.

3. Immunofluorescent Bildaufnahme

Hinweis: die folgende Methode kann mit jedem handelsüblichen konfokale imaging-System verwendet werden.

1. Bestimmen Sie die entsprechenden Einstellungen für jede Fluorophor, den Dynamikbereich für die Quantifizierung zu maximieren.
   Hinweis: Repräsentative Quantifizierung kann nur erreicht werden, wenn Pixel Sättigung vermieden wird und die Signalschwelle entsprechend werden korrigiert. Diese Einstellungen können werden erreicht durch sorgfältig anpassen der Laserleistung, Hochspannung (HV), erlangen, und ausgeglichen.
   1. Stellen Sie den Zoom-Faktor (5 X) und die Anzahl der Pixel (512 x 512) zur Optimierung der Pixelgröße.
      Hinweis: Dies sollte mindestens 2,3 - Mal kleiner als die optische Auflösung nach Nyquist Theorem.
   2. Verringern Sie die Scangeschwindigkeit (12,5-20 µs/Pixel) und zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis entsprechend den oben genannten Einstellungen verwenden im Durchschnitt (2-3 Mal).
2. Manuell bestimmen die entsprechenden oben und unten fokale Flächen entlang der z-Achse mit der optimalen Schrittweite (0,4 µm/Slice).
   Hinweis: Schritt Größe Flugzeug wird durch die axiale Auflösung geteilt durch 2.3, nach dem Nyquist-Theorem bestimmt. In der Regel 20-25 Schichten sind notwendig, um die gesamte Zelle Tiefe der adhärenten Zellen decken.
3. Erwerben eine konfokale Bild einer gesamten einzelnen Zelle mit einem 60 X Plan Apo Öl eintauchen Ziel (1,42 numerische Apertur).

4. Immunofluorescent Bild Quantifizierung

1. Ermittlung der Bereicherung.
   1. Öffnen Sie ein Bild entspricht der Z-Ebene Schicht von Interesse aus der erworbenen Zelle Datendatei mit ImageJ-Software (Freeware erhältlich bei http://fiji.sc).
   2. Zeichnen Sie eine Linie mit dem Zeichnen von Linien-Werkzeug (Tool-Bar → geraden) durch die Regionen der Zelle wo Quantifizierung ist erwünscht. Ändern Sie die Linienstärke durch Doppelklick auf " gerade; " die Intensitätswerte werden durch die Breite der Linie (eingestellt auf 8 in Abbildung 3) gemittelt werden.
      Hinweis: Eine dünnere Linie wird bevorzugt, um Signal Überschneidungen aus unterschiedlichen Strukturen zu vermeiden.
   3. Nach die Zeile korrekt eingestellt ist, Profil Signaldichte entlang der festgelegten Achse (Menüleiste → Analyze → Plot-Profil).
      Hinweis: Ein neues Fenster wird geöffnet, die ein Profil entsprechend der Signalintensität für jedes Pixel eines neu selektierten Kanals (spezifische Fluorophor) entlang der Linie für den ausgewählten Abschnitt der Z-Ebene zeigt.
      1. Wiederholen Sie den Vorgang für jeden Kanal entspricht der Fluorophor verwendet (d. h. eine Quantifizierung für 488, eines für 568 und eines für 405).
         Hinweis: Die Intensität Signalwert wird immer bestellt werden nach der Ausrichtung der gezeichneten Linie.
   4. Um die numerische grau skaliert Werte für jedes Pixel des Profils entspricht die Quantifizierungen der ausgewählten Ebene Z-Ebene zu erhalten, kopieren Sie die Profildaten (Menüleiste im Bildfenster → kopieren) und fügen Sie ihn in jedem Tabellenkalkulations-Software.
   4.1.1-4.1.4
   5. Wiederholen Sie die Schritte für jeden Z-Plane-Abschnitt des erworbenen konfokale Bild und jeden Kanal wo Quantifizierung erwünscht.
      Hinweis: Die Quantifizierung der verschiedenen Schichten der Z-Ebene kann gebündelt werden, um eine allgemeine Bewertung der besondere Bereicherung des Signals durch die Berechnung der Summenwert der einzelnen Pixel entlang der Linie für jede Z-Ebene Schicht zu erhalten. Diese Art der Bündelung kann nur erreicht werden, wenn die Linie gezogen für jeden Z-Ebene Layer enthalten in den Mittelwerten identisch ist.
   6. Als alternative Methode für die gesamte Zelle Quantifizierung verschiedener Kanäle mit einer großen Anzahl von Schichten, verwenden Sie das Makro StackprofileData aufgerufen (siehe die Zusätzliche Datei).
      Hinweis: Dieses Makro ist https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt frei abrufbar und können wie folgt verwendet werden:
      1. fügen Sie das Makro in eine Textdatei und speichern Sie it.
      2. Öffnen Sie die Image-Datei, die alle die konfokalen Schichten der Zelle einschließt.
      3. Zeichnen Sie eine Linie, wie im Schritt 4.1.2 beschrieben, öffnen ein neues Fenster, um das Makro zu importieren (Menü-Leiste → Plugins → Makros → ausgeführt), wählen Sie die zuvor gespeicherte Textdatei entspricht das StackprofileData-Makro, und klicken Sie auf " offen. "
         Hinweis: Nach Makro Einfuhr, ein neues Fenster namens " Ergebnisse " wird geöffnet und alle die Quantifizierung der ermittelten Achse wird für jede Z-Ebene Schicht aufgeführt werden und Kanal in die Image-Dateien vorhanden.
      4. Kopieren Sie die Daten für jeden Kanal (Menüleiste → bearbeiten → Kopie) die Grafikprofil Darstellung entspricht dem Signal Quantifizierungen zu erhalten. Fügen sie jedem Tabellenkalkulations-Software. Berechnen Sie den Summenwert der einzelnen Kanäle für jedes Pixel entlang der Linie für jede Schicht der Z-Ebene. Diese Werte verwenden, um eine grafische Darstellung ähnlich der in Abbildung 3 dargestellten erstellen.
2. Quantifizierung des Signals in einem bestimmten zellulären Bereich oder Volume.
   1. Öffnen Sie die Bilddatei mit ImageJ Software.
   2. Zeichnen Sie einen Bereich, um den gewünschten Bereich mit Hilfe der geometrischen Formularfunktion bezeichnen (Tool-Bar → " Rechteck, " " Oval, " oder " Polygon ").
      Hinweis: Der Quantifizierung Wert wird für den Bereich entspricht die gezeichnete Form ermittelt werden.
   3. Der Schwelle Pegel um jede Hintergrundsignal zu vermeiden (Menüleiste → Bild zu justieren, → Schwelle); ein neues Fenster erscheint die Pixelintensität im Histogramm Form darzustellen. Ändern Sie die Werte um Pixel in der Quantifizierung mit Hilfe des Schiebereglers einschließen/ausschließen. Wählen Sie eine Schwelle, die roten Pixel außerhalb der Zelle beseitigt, wie Pixel rot markiert in der Quantifizierung aufgenommen werden.
   4. Definieren die Messparameter zur Quantifizierung der Pixel-Signal innerhalb des ausgewählten Bereichs ohne Hintergrundsignal (Menüleiste → Analyze → Messungen festgelegt), und überprüfen Sie die " Grenze für die Schwelle " und die " integrierte Dichte " Boxen.
   5. Messen die quantitative Werte für den ausgewählten Bereich (Menüleiste → Analyze → Maßnahme).
      Hinweis: Signal Intensität Quantifizierung präsentiert werden in einem neuen Fenster unter der " IntDen " Identifikation, die das Produkt aus grauen Mittelwerte und die Anzahl der Pixel innerhalb des ausgewählten Bereichs darstellt.
   6. Zeichnen ein Gebiet, das die gesamte Zelle mit einer geometrischen Form enthält (Tool-Bar → " Rechteck, " " Oval, " oder " Polygon ") und fahren Sie mit den Schritten 4.2.3-4.2.5, einen Wert, der am Gesamtsignal zu erhalten. Berechnen Sie das Verhältnis des Signals innerhalb des ausgewählten Bereichs über das gesamte Signal Prozent des Signals im Bereich von Interesse zu erhalten.
   7. Wiederholen Sie Schritte 4.2.2-4.2.6, die Quantifizierung des Zellvolumens für jede Z-Ebene zu erhalten. Die geometrische Form anpassen, je nach Bedarf.
   8. Kopieren/Einfügen der Daten aus der " Ergebnisse " Windows für jeden Z-Ebene Layer in eine Tabellenkalkulation für die grafische Darstellung und einen Mittelwert zu finden.

Um Übersetzung Ereignisse mithilfe von Puromycin Aufnahme genau zu beobachten, ist es wichtig, die optimale Bedingungen für jede Zelllinie zu bestimmen, da jeder unterschiedliche Puromycin Einbeziehung Kinetik (Abbildung 1)^{9,11 zeigt ,12,18}. Daher um Puromycin Aufnahme zu überprüfen, ist es notwendig, die gewünschte Zell-Linie mit einem standardisierten Spektrum von steigenden Konzentrationen von Puromycin zu behandeln (1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10.0 und 15,0 µg/mL) für verschiedene Zeiträume (5 bis 10 min). Um lokalisierte Übersetzung oder eine frühzeitige Reaktion auf medikamentöse Behandlung zu beurteilen, ist eine kürzere Inkubationszeit bevorzugt (z. B. weniger als 5 min), da es die direkte Auswertung der translationalen Veranstaltungen direkt im Anschluss an einer spezifischen Behandlung ermöglicht. Im Idealfall sollte das Puromycin Signal leicht nachweisbar aber sollten auch vermeiden, den Sättigungspunkt (Abbildung 2). Wie in Abbildung 2 (linken Panels) dargestellt, ist eine akzeptable Puromycin Konzentration 7,5 bis 10,0 µg/mL für MRC-5 und HeLa, während 5,0-7,5 µg/mL von Puromycin für Huh-7 vorgeschlagen wird. Optimierung der experimentellen Parameter ist entscheidend, denn das Ziel dieser Methode ist nicht vollständig alle translationale Dehnung zum Zeitpunkt der Einleitung hemmen, sondern neu taggen können Polypeptidketten während der Übersetzung zu akuten erkennen Variationen in der Übersetzung. Diese erste Phase des Protokolls sollte nicht vernachlässigt, wie übermäßige Puromycin Verfügbarkeit und längere Behandlungszeit wird dazu führen, dass schwerwiegende unerwünschte Folgen. Wie in Abbildung 2 (richtigen Platten) beobachtet, werden Zellen für 10 min mit einer hohen Puromycin Konzentration behandelt vor allem kleinere Puromycilated Polypeptide (z. B. Huh-7, 7,5 µg/mL oder mehr für 10 min) erzeugen. Diese kleinere Polypeptide werden schneller in die Zelle diffundieren die präzise Bewertung subzelluläre Lokalisation stören könnte. Ein weiteres Problem ist, dass erhöhte Proteolyse auf übermäßige Puromycin Behandlung¹⁹auftritt. Dieses Ergebnis wurde bei MRC-5 und HeLa-Zellen für 10 min, die verminderte Signalintensität in Anwesenheit von 10 bzw. 15 µg/mL von Puromycin zeigte behandelt beobachtet. Beide dieser Phänomene sind irreführend, wenn Puromycin Einbeziehung von Immunfluoreszenz bewertet wird, weil erhöhte Verbreitung verhindert, die exakte Visualisierung der Übersetzung Lokalisierung dass während Puromycin-induzierte Degradation stark sinkt Nachweisempfindlichkeit. Diese unerwünschten Folgen sind leicht durch die Definition richtig optimale Versuchsbedingungen vermieden, wie beschrieben in Abschnitt 1 des Protokolls.

Bei der Visualisierung von Puromycin Aufnahme, ist es auch wichtig, geeignete Kontrollen durchführen. Wie in Abbildung 3Agezeigt, kann Puromycin Einbau effizient durch die Zugabe von 50 µg/mL Cycloheximide, eine Verbindung bekannt, Übersetzung Dehnung²⁰ und damit Puromycin Aufnahme hemmen blockiert werden. Dieses Verhalten zeigt Abbildung 3 b, was zeigt, dass Cycloheximide Behandlung effizient die meisten des Signals entspricht Puromycin Einbindung in adhärenten MRC-5 Zellen verhindert. In der Tat, während Puromycilated Peptide in Zellen behandelt mit Puromycin nur visualisiert werden können, ein schwaches Signal in Zellen detektiert, die auch mit Cycloheximide unter identischen Bedingungen Färbung behandelt wurden. Alternativ kann ein anderes Antibiotikum (Anisomycin) auch als eine Negativkontrolle verwendet werden wie es die Fähigkeit hat, Peptidyl-Transferase-Aktivität-⁵ zu blockieren und gezeigt hat, dass so effizient wie Cycloheximide blockieren Puromycin Einbeziehung^{5 ,18}

Nach immunofluorescent Bildaufnahme ist es möglich, die allgemeine Lokalisierung von Puromycilated Polypeptide neu können Proteine (Abbildung 4) entsprechend zu beurteilen. Bildebenen werden in unterschiedlichen Tiefen innerhalb der adhärenten Zellen, so dass die Signalintensität in subzelluläre Kompartimente in andere Zelle Ebenen beurteilt werden ausgewählt. So ist es möglich, vergleichen Sie die lokalisierten Puromycilation Reaktion am unteren Rand der Zelle (Abb. 4A), der Mitte der Zelle (Abbildung 4 b) oder am oberen Rand der Zelle (Abbildung 4). Im Entstehen begriffenen und maturating Adhäsion Strukturen leicht oberhalb, werden SICs meist in der Mitte der Zelle beobachtet. Wie erwartet, intensive Puromycilation in SICs, darauf hindeutet, dass mRNA Übersetzung isoliert an diesen subzellulären Strukturen erkannt. Wie bereits erwähnt, ist es möglich, Signalintensität entlang einer gewünschten Achse zu vergleichen. Dieser Vergleich ist nur möglich, wenn die Bilder erworben nicht gesättigten Pixel beinhalten die roten in den Graustufenbild angezeigt werden (zweite Platten von oben) erhalten das Mikroskop Betriebssoftware. Diese Bilder können in die ImageJ-Software zur Quantifizierung und Analyse der Pixel Intensität entlang einer bestimmten Achse importiert werden. Die Pixel Quantifizierung kann grafisch dargestellt werden (mittleren Feld), um die relative Pixel Intensität an bestimmten Positionen entlang der Achse veranschaulichen. Ein genauer Blick auf die Einlage in die oberen Platten zeigt SIC-Aktin Grenzen (in rot) und ein grünes Signal innerhalb der Struktur, die hochaktive Übersetzung Veranstaltungen, entspricht die innerhalb dieser Strukturen (Unterteil) angereichert sind. Obwohl diese Quantifizierungsmethode nicht die beste Methode zum Ermitteln des genauen Prozentsatzes der Gesamtkosten für Übersetzungsleistungen in diesen Strukturen auftreten ist, es ist visuell informativ, indem für die schnelle Beurteilung der Signalintensität und ist eine gute Annäherung an die Signalverteilung in der Zelle.

Um eine quantitative Verteilung des Signals über die gesamte Zelle zu erhalten, sollte eine andere Methode verwendet werden. Wie in Abbildung 5gezeigt, ist einer der wichtigsten Schritte kennzeichnen die Bereiche von Interesse, die für jeden Z-Plane komponieren die konfokale Bilddateien quantifiziert werden müssen. Diese Zuordnung kann über ein anderes Zeichenwerkzeug gefunden in ImageJ erreicht werden. Mit dieser Methode ist es möglich, entweder einen einzelnen Bereich oder mehrere Bereiche, die dann verglichen, abgezogen, oder sogar zusammengestellt zu quantifizieren. Die Hauptschwierigkeiten sind: (i) finden Sie die optimale Bildgebung, die Bedingungen zu vermeiden, Pixel-Sättigung und Hintergrundsignal, die möglicherweise falsch den quantitativen Wert des erhaltenen Signals, und (Ii) optimale Kalibrierung der Schwelle in ImageJ etablieren. Geht man davon aus, dass beide Bedingungen optimal sind, ist diese Quantifizierungsmethode hoch reproduzierbare zwar noch immer einfach durchzuführen. Vor der Bildaufnahme ist es auch wichtig, die unteren und oberen Grenzen der Z-Ebenen der Zelle ausgewählt für die Quantifizierung sorgfältig zu bestimmen. In dem Fall, in Abbildung 4dargestellt entspricht der untere Abschnitt der Auflösungsgrenze des Ziels, die häufig verunreinigen evaneszenten Fluoreszenz, die die SIC/Zelle Körper Signalverhältnis verringern kann. Wie bereits erwähnt, SICs beteiligt sind Adhäsion Website Bildung und Reifung; Daher sind SIC Strukturen leicht oberhalb von neu bilden Adhäsion komplexe, die flüchtige Fluoreszenz aus den untersten Schichten ausschließt. Somit ist die SIC-gebundenen Puromycilation Signal kaum sichtbar in den unteren Abschnitten, wohingegen wir klar Obs könnenErve es im Mittelteil, erklärt die erhöhte Verhältnis aus SIC/Zellkörper signal in der mittleren Region im Vergleich zu den unteren bzw. oberen Ebenen.

Abbildung 1. Experimentelle Darstellung der Puromycin Behandlung Optimierung in Abschnitt 1 beschrieben.
(A) einer 24-Well-Darstellung der Zellen ausgesät für das Experiment (Schritt 1.1). (B) schematische Darstellung der Schritt 1.4 zeigt die mittlere Veränderung in den Zeilen 1 und 2 von 24-Well-Platte und die Zugabe von Cycloheximide (CHX) in jede Vertiefung der dritten Zeile für eine Endkonzentration von 50 µg/mL. (C) schematische Darstellung der Puromycin Behandlung in der zweiten und dritten Zeile (Schritt 1.6) 15 min nach Schritt 1.4. (D) schematische Darstellung der Puromycin Behandlung in der ersten Zeile (Schritt 1,8) 5 min nach Schritt 1.6. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2. Bestimmung der optimalen Bedingungen für Puromycin Einarbeitung.
Western-Blot Analyse der gesamten Zelle extrahieren von (A)MRC-5, Huh-7 (B) und (C) HeLa-Zellen inkubiert mit steigenden Konzentrationen von Puromycin (0, 2,5, 5, 7,5, 10 und 15 µg/mL) für einen Zeitraum von 5 min (linken Panels) oder 10 min (rechts Paneele). Puromycilated Peptide wurden mit einem Antikörper gegen Puromycin nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Hemmung der Puromycilation mit Cycloheximide.
(A) Western-Blot, die die Wirkung von Cycloheximide auf einen 5-min-Puromycilation-Assay. Einbau-Effizienz bei MRC-5, Huh-7 und HeLa-Zellen nach Mock (1 X PBS) oder Cycloheximide Behandlung. (B) konfokale Bild zeigt die Wirkung der Cycloheximide Puromycin Aufnahme. MRC-5 Zellen vorbehandelt mit PBS (mock) oder Cycloheximide für 15 min und dann ergänzt mit 10 µg/mL Puromycin + 1 X PBS (linken) oder 10 µg/mL von Puromycin + 50 µg/mL Cycloheximide (rechte Abbildung) für 5 min. Puromycilated Proteine wurden erkannt verwenden einen Antikörper gegen Puromycin (grün). F-Aktin wurde gefunden mit Phalloidin (rot), und der Kern war mit DAPI (blau) gefärbt. Einsätze auf der rechten Seite entsprechen einer 2,5-fache Vergrößerung von das weiße Feld. Balken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Quantifizierung der translationalen Aktivität in SICs in adhärenten MRC-5 Zellen.
(A-C) Repräsentatives konfokale Bild von adhärenten Zellen der MRC-5 mit 10 µg/mL Puromycin für 5 min behandelt. Die präsentierten Bilder entsprechen der unteren (A), mittleren (B)und oberen (C) Teilen der Zelle. Die oberen Platten zeigen die Puromycilated Proteine mit einem Antikörper gegen Puromycin (grün) nachgewiesen. F-Aktin wurde gefunden mit Phalloidin (rot), und der Kern war mit DAPI (blau) gefärbt. Einsätze auf der rechten Seite entsprechen einer 2-fach-Vergrößerung von das weiße Feld. Balken = 10 μm. Die mittleren Bereiche zeigen das Fehlen von gesättigten Pixel, in rot hervorgehoben worden wäre. Die unteren Platten zeigen eine grafische Darstellung der Puromycilated Proteinanreicherung in einer haftfesten MRC-5-Zelle durch den Vergleich der Signalintensität für Puromycin (grün), F-Aktin (rot) und DAPI (blau) entlang der Achse der Zelle mit dem weißen Pfeil angezeigt. (D-F) Die präsentierten Bilder entsprechen der 4,4 x Vergrößerung Einfügen von der SICs in (A-C) vorgestellt. Die Quantifizierung zeigt die SIC-Grenze (rote Spitzen: Aktin), sowie lokalisierte Übersetzung innerhalb der SICs (grüne Gipfel: Puromycin) in der niedrigsten (D), Mitte (E), und den oberen Regionen der (F) der Zelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. Gesamte Mobilfunksignal Quantifizierung der Puromycilated Proteine in adhärenten MRC-5 Zellen.
(A) Bestimmung des Signals in verschiedenen Bereichen der Z-Ebene Unterschicht aus einer haftfesten MRC-5-Zelle. (Linken) Auswahl des Bereichs (I) für die Gesamtheit der Zelle um einen quantitativen Wert entsprechend der zellulären Gesamtsignal für diesen Layer Z-Ebene zu erhalten. (Mitte Platte) Auswahl des zellulären Bereichs entspricht dem Kern und der cytoplasmatischen Teil, der nicht schließt SIC (II). (Rechte Abbildung) Visualisierung der Fläche entspricht, SICs (III) durch Subtraktion den Wert Bereich II aus dem Wert, der für die gesamte Zelle entnommen (Bereich ich). Balken = 10 μm. (B) Quantitative Pixelwerte für die einzelnen Bereiche sind in der Tabelle für das Bild der Darstellung der Bereichsauswahl in (A), gefolgt von einem Diagramm zeigt den Anteil (%) des Signals gefunden in SICs. aufgeführt (C) Bestimmung des Signals in verschiedenen Bereichen der Z-Ebene-Zwischenschicht einer haftfesten MRC-5-Zelle. (Linken) Auswahl des Bereichs (I) für die Gesamtheit der Zelle um einen quantitativen Wert entsprechend der zellulären Gesamtsignal für diesen Layer Z-Ebene zu erhalten. (Mitte Platte) Auswahl des Bereichs Zelle entspricht dem Kern und der cytoplasmatischen Teil, der nicht schließt SIC (II). (Rechte Abbildung) Visualisierung der Fläche entspricht, SICs (III) durch Subtraktion den Wert für Bereich II aus dem Wert, der für die gesamte Zelle (Bereich ich). (D) Quantitative Pixelwerte für die einzelnen Bereiche sind in der Tabelle für das Bild der Darstellung der Bereichsauswahl in (C), gefolgt von einem Diagramm zeigt den Anteil (%) des Signals gefunden in SICs. aufgeführt (E) Bestimmung des Signals in verschiedenen Bereichen der oberen Schicht der Z-Ebene einer haftfesten MRC-5-Zelle. (Linken) Auswahl des Bereichs (I) für die Gesamtheit der Zelle um einen quantitativen Wert entsprechend der Ergebniszelle Signal für diesen Layer Z-Ebene zu erhalten. (Mitte-Panel) Auswahl an den Zellbereich entsprechend den Zellkern und der cytoplasmatischen Teil, die nicht umfasst SICs (II). (Rechte Abbildung) Visualisierung der Fläche entspricht, SICs (III) durch Subtraktion den Wert für Bereich II aus dem Wert, der für die gesamte Zelle (Bereich ich). (F) Quantitative Pixelwerte für die einzelnen Bereiche sind in der Tabelle für das Bild der Darstellung der Bereichsauswahl in (E), gefolgt von einem Diagramm zeigt den Anteil (%) des Signals gefunden in SICs. aufgeführt (G) Quantifizierung für alle der Z-Ebene Schichten aus der Zelle oben dargestellten Werte, darunter eine für Z-Ebenen präsentiert in A berechnet (Z = 1), C (Z = 9), und E (Z = 19), die hervorgehoben sind in rot auf dem Tisch. (H) grafische Darstellung des Prozentsatzes des Signals in SICs während der gesamten Zellvolumens gefunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Jüngsten technologischen Fortschritte haben für ein besseres Verständnis der Mechanismen translationale Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs in biologischen Prozessen, wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung zulässig. Die kostengünstige Methodik, die hier beschriebenen lässt die Übersetzung Ereignisse in Zellen zu studieren, wie RNA-bindende Proteine regulieren metastatische Prozesse, wie z. B. zelluläre Adhäsion, Migration und Invasion visualisiert werden.

Obwohl zahlreiche Methoden, um de Novo Protein Übersetzung bewerten entwickelt worden sind, teilen sie alle die gleiche Strategie, in der spannungsreicher Polypeptid modifizierte Aminosäuren, die mit dem Stichwort nachweisbar Abstimmungsunterlagen enthält. Die erste dieser Methoden beruht auf ³⁵S radioaktiv Arginin Eingliederung in das neu übersetzten Protein. Obwohl es für den Vergleich von allgemeiner Rates von Übersetzung unter bestimmten Bedingungen effizient ist, macht den Einsatz von radioaktiven Aminosäuren diese Methode unsympathisch, die meisten Forschungsteams. Daher die Entwicklung neuartiger Methoden mit nicht-radioaktiven Labels, wie Sonnenuntergang, Klick-It oder der TRICK-Ansatz bot neue Möglichkeiten zu beurteilen und in Vivo Übersetzung Ereignisse zu beobachten. Obwohl genial, erlauben die meisten dieser Methoden nur für die Bewertung der Übersetzung Ereignisse nach, dass medikamentöse Behandlung oder spezifische zelluläre Ereignisse, die mit einer bestimmten exogenen cDNA konkreter Zielvorgaben, Begrenzung der Experimente auf bereits identifizierte Ziele zu konstruieren . Dies gilt auch für den TRICK Ansatz⁴, wodurch für die translationale Regulierung von EXOGEN ausgedrückt mRNA Einzelziel beurteilt werden. Obwohl es für die Validierung der translationalen Aktivierung des endogenen mRNAs zulässt, ist die "Click-IT" Methode minimale Inkubationszeit für AHA Einbeziehung mindestens 1 h¹³, zu lange am akutesten Übersetzung Mechanismen gilt.

Während sehr vielseitig und einfach einzurichten, erfordert die hier beschriebene Methode, dass die entscheidenden Schritte in der Anfangsphase des Protokolls eingehalten werden. Wie in die repräsentativen Ergebnisse gezeigt, haben verschiedene Zelllinien unterschiedliche Puromycin Einbeziehung Kinetik, die einfach durch den Stoffwechsel jeder Zelle Zeile, wie bei MRC-5 Zellen^5,21der Fall zu sein scheint sein könnte. In der Tat nicht transformierten Zellen sind nicht so proliferativer als HeLa und Eiweiß Masse Erneuerung deshalb weniger robust als entartete Zellen. Dies sollte berücksichtigt werden, wenn Sie das Protokoll zu verwenden. Dementsprechend ist der erste Teil des Protokolls für den Rest der Methode von entscheidender Bedeutung. Sorgfältig Bestimmung der Konzentration von Puromycin und die Länge der Ausbrütung ermöglicht eine bessere Beurteilung der Übersetzung, die während des Experiments. Wie oben erwähnt, Behandlung mit einem Übermaß an Puromycin erhöht sich das Verhältnis von kleinen Puromycilated Polypeptide und Proteolyse, stimulieren, die leicht zu einer Fehlinterpretation der normalerweise auftretenden führen könnte scheint translationale Veranstaltungen¹⁹ . Als Faustregel gilt je länger die Inkubationszeit der weniger Puromycin braucht man eine kürzere Inkubationszeit erfordert eine höhere Konzentration von Puromycin. Die Konzentrationszeit können an bestimmten experimentellen Einschränkungen angepasst.

Die hier vorgestellten Methoden sind sehr anpassungsfähig und kann problemlos geändert werden, nach der Behandlung oder der biologischen Prozess untersucht. Puromycin Aufnahme ermöglicht die schnelle Beurteilung von Änderungen in Übersetzung Kinetik über einen kurzen Zeitraum hinweg, während die Quantifizierungsmethode hochinformativen Bildern der zelluläre Ereignisse bietet. Diese Verfahren haben zwar mächtig, Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Puromycin fließen in Proteine neu synthetisiert aus alle mRNAs, die aktiv übersetzt werden. Aus diesem Grund die hier beschriebene Puromycilation-Methode möglicherweise nicht geeignet, um spezifische Ziele (z.B. einzelne mRNAs) zu studieren, aber es ist ideal, um einen allgemeinen Überblick der übersetzerischen Tätigkeit innerhalb einer einzelnen Zelle oder einer Zellpopulation zu erhalten. Wie oben erwähnt, übermäßige Puromycin hat wesentliche Nachteile und Puromycin Dosierung und Behandlungsdauer sollte sorgfältig definiert werden, wie im Protokoll vorgeschlagen. In der Tat, wie in Abbildung 2dargestellt, übermäßige Puromycin Verfügbarkeit bei der Bildung von kleineren Puromycilated Polypeptide führt, die schneller in die Zelle diffundieren führt zu ungenauen subzelluläre Lokalisation Daten. Darüber hinaus erhöhte Proteolyse bekanntermaßen nach übermäßiger Puromycin Behandlung¹⁹, ein Effekt auftreten, die in einem vollständigen Verlust des Signals führen können.

Obwohl nicht so spezifisch wie die Klick-It oder TRICK Methoden, der hier vorgeschlagene Ansatz ist sehr zugänglich und ermöglicht die schnelle Beurteilung der allgemeinen Veränderungen in Übersetzung Kinetik. Auch wenn andere Methoden für bestimmte Anwendungen besser geeignet sind, können Puromycin Einbeziehung Assays als zusätzliche Kontrolle durchgeführt werden. In der Tat, wenn das Experiment muss zeigen, dass die mRNA gezielt nur in einem bestimmten Zustand betroffen ist, ist es notwendig zu zeigen, dass dies nicht auf eine allgemeine Zunahme der Übersetzung zurückzuführen ist. Als solche könnte negative Puromycin Aufnahme für diesen Fall nachweisen. Diese Methode eignet sich darüber hinaus zur Einhaltung der allgemeinen Übersetzung Steuersatzänderungen. Daher können verwendet werden, einen Übersetzung Unterdrückung Mechanismus, wie im Fall von Stress Granulat Bildung⁹, zu zeigen oder zu überprüfen, ob Cycloheximide Behandlung in der Anfangsphase der translationalen komplexe Fraktionierung verwendet effizient blockiert Dehnung²². Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass, obwohl die in Abschnitte 2.3 und 2.4 beschriebenen Quantifizierungsmethoden beziehen sich auf Experimente mit Schwerpunkt auf Puromycin Färbung, sie auf jede Art von unterteilte Färbung mit verschiedenen Arten von Fluorophore angewendet werden könnte. In der Tat, diese Quantifizierungsmethoden könnte verwendet werden, um die zelluläre Verteilung eines Moleküls oder Protein zu quantifizieren und können sogar die Lokalisierung eines Ziels in einem bestimmten Fach, subzelluläre überprüfen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir danken Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Zelle Bildtrommel des Forschungszentrums für ihre technische Unterstützung. M.-É. Huot ist ein Junior 1 Research Scholar des Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (Anzahl CIHR, MOP-286437, M.-É zu gewähren. Huot).