Method Article
Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Lymphocyte Extravasation in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist entscheidend für die Immunüberwachung. Krankheitsbedingte Veränderungen der Lymphozyten-Extravasation könnten in pathophysiologischen Veränderungen im ZNS führen. So Untersuchung der Lymphozytenmigration in das ZNS ist wichtig, entzündlichen ZNS-Erkrankungen zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein in vitro - Modell der menschlichen Blut-Hirn - Schranke Lymphozyten - Extravasation zu studieren. Human brain mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMEC) sind konfluent auf einem porösen Polyethylenterephthalat gewachsenen Transwell einzufügen das Endothel der Blut-Hirn-Schranke zu imitieren. Barrierefunktion durch Zonula occludens Immunhistochemie, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen sowie Analyse von Evans-Blau-Permeation validiert. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Diapedese von seltenen Lymphozytteilmengen wie CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen. FurthermErz, die Auswirkungen von anderen Zellen, Zytokinen und Chemokinen, krankheitsbedingte Veränderungen und unterschiedliche Behandlungsschemata auf die Migrationsfähigkeit von Lymphozyten untersucht werden. Schließlich kann die Wirkung von Entzündungsreizen sowie unterschiedliche Behandlungsschemata auf der endothelialen Barriere analysiert werden.
Lymphozytenmigration aus dem Blut in das Gewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Immunüberwachung. Eine Folge von spezifischen molekularen Wechselwirkungen stellt sicher , ortsspezifische Extravasation in Dünndarm, Haut, Lymphknoten, das zentrale Nervensystem (ZNS) und andere Gewebe 1. Veränderungen in der Lymphozytenmigration sind in der Pathophysiologie einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten 2 beteiligt. Migration in die Immunprivilegierten CNS ist streng reguliert und entsprechend Veränderungen dieses Verfahrens sind in CNS-bedingten Krankheiten wie Enzephalomyelitis 3, Neuromyelitis optica, Schlaganfall und Multiple Sklerose (MS) , 2, 4, 5, 6, 7 beteiligt. Daher ist es wichtig, Lymphozyten-Extravasation besser zu verstehen Krankheit Pathophysiologie und Entwicklung von Instrumenten für ein Studium Melioration von Krankheitsbelastung 8, 9, 10, 11, 12.
Lymphozyten wandern in das ZNS über verschiedene Routen. Extravasation durch postkapillaren Venolen in den Subarachnoidalraum über die Blut-Liquor - Schranke innerhalb des Plexus choroideus und über die Blut-Hirn - Schranke hat 1 beschrieben worden ist , 13, 14, 15. Migration durch die Blut-Hirn - Schranke wird durch die Wechselwirkung von Lymphozyten mit Endothelzellen 14 durchgeführt. Im Gegensatz Zellen in der Peripherie, Endothelzellen des ZNS äußern an endotheliale hohe Mengen an tight junction-Moleküle, um dadurch genau die Menge von Zellen und Proteinen Begrenzen der Lage Überquerung der Blut-Hirn-Schrankelass = "xref"> 16. Entzündung führt Lockerung der tight junctions und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen; Somit verbessert Lymphozytenmigration in das ZNS 1, 17, 18.
Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Haltegurt - Lymphocyten an die Endothelzellen und dann entlang dem Endothel in einem Fertigungsrolle hauptsächlich durch Selectine 1, 15 vermittelt. Anschließend Wechselwirkungen zwischen durch das Endothel sekretiert Chemokine und Chemokin den jeweiligen auf Lymphozyten induzieren Konformationsänderungen exprimierten Rezeptoren der Integrine, wodurch feste Adhäsion an die Endothelzellen 1 zu fördern. Schließlich, Lymphozyten entweder Durchforstungs entlang der endothelialen Barriere gegen den Blutstrom, bevor sie in den perivaskulären Raum transmigrating oder abgewürgt sofort und direkt transmigrate an der Stelle der festen Haftung 1, 19, 20. All diese Schritte der Lymphozyten Extravasation kann in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Techniken 21 analysiert werden. Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet , um das anfängliche Tethering zu studieren und Walzen 15. Adhäsions - Assays bieten detaillierte Informationen über feste Verhaftung Barrieren endothelialer 22. Transmigrationsassays als 21 hier erlauben Analyse von Immunzellen - Transmigrations demonstriert, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Unter Verwendung der humanen in vitro - Modell Blut - Hirn - Schranke, konnten wir kürzlich zeigen , dass eine höhere migrAtory Kapazität von CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + Pendants durch ein Vorherrschen dieser NK - Zell - Untergruppe in der intrathekalen Kammer 21 reflektiert wurde. So ist unser Versuchsaufbau scheint geeignet zu sein , die in vivo - Situation zu imitieren.
1. Zellkultur von Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC)
2. Herstellung der Zellkultur-Einsätze
3. Qualitätskontrolle mit Evans Blue am Tag des Auswanderungs Assay
4. Migration Assay
5. Durchflusszytometrie
Repräsentative Ergebnisse zeigen Transmigration von NK-Zell- und T-Zell - Untergruppen mit dem menschlichen Blut-Hirn - Schranke - Modell (1A) gezeigt. Die Integrität der HBMEC Monoschicht wurde durch Anfärben des tight junction Moleküls ZO-1, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen validiert, und Evans - Blau - Permeation (1B). Folgende 3 - 4 Tage Kultur ausgedrückt HBMEC das tight junction Molekül ZO-1 (1B, links). Außerdem wuchs HBMEC in Monolayern transendotheliale elektrischen Widerstand (1B Mitte) sowie reduzierte Permeation für Evans - Blau (1B, rechts) aufweist. HBMEC Monoschichten wurden verwendet , um die Transmigration von NK - Zellen zu studieren , einschließlich CD56 hell CD16 dim / - und CD56 dim CD16 + NK-Zell - Untergruppen und T - Zellen , einschließlich CD4 + und CD8 + T - Zellen als zwei examples (1D + E, jeweils). Der prozentuale Anteil der migrierten Zellen wurde durch Strömung basierend auf Zellzahl erhalten wurde , berechnet und normiert Zytometrie unter Verwendung von Durchflusszahl Fluorospheres als eine interne Kontrolle (Abbildung 1C). Die HBMEC Monoschicht wurde mit IFN-γ und TNF-α 24 h vor dem Assay stimuliert entzündlicher Zustände nachahmen. Cytokinstimulierung führte zu einer erhöhten Migration aller analysierten Lymphozyten-Populationen. Dies könnte durch eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen, einschließlich ICAM-1 (Daten nicht gezeigt). CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen eine höhere Migrationskapazität zeigten im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + NK über beide unstimulierten (10,88% vs. 0,86%) und IFN-γγ / TNF-α stimulierte (18,22% vs. 2,94%) HBMEC (1D). Allerdings war die relative Zunahme der Seelenwanderung als Folge der Entzündung höher für die CD56 dim CD16 + NK-Zell - Untergruppe (+ 342% gegenüber + 167% für CD56 hell CD16 dim / -). Diese Ergebnisse ahmen die in - vivo - Beobachtungen , dass CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen werden in dem intrathekalen Fach angereichert. So scheint das Blut-Hirn - Schranke Modell geeignet zu sein , um Grundlagen der Immunzellen Diapedese von seltenen Lymphozyten - Populationen in die 21 ZNS zu analysieren. Schließlich wird die Transmigratory Kapazität von CD4 und CD8 - T-Zell - Untergruppen gezeigt (Figur 1E).
Abbildung 1: differentielle Migration von NK-Zell - Subpopulationen in uninflamed und entzündeten HBMEC Monoschichten. A. Ein Bild von Transwell - Einsätzen (links) und Darstellung des experimentellen Aufbaus (rechts). B. Validierung von HBMEC Barrierefunktionen. Links: immunhistochemischen Färbung der tight junction molecule ZO-1 unter Verwendung von Kaninchen anti-human-ZO-1 (Abcam, 1: 200) und Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Cy3 (1: 300) auf HBMEC für 3 Tage kultiviert. Center: transendothelialer elektrischer Widerstand (TEER) von HBMEC zwischen Tag 2 und Tag 4 der Kultivierung. Recht: Standardkurve für Evans Blau Permeation für HBMEC mit ( "entzündet", rot) oder ohne ( "uninflamed", Schwarz) Stimulation mit 500 U / ml IFN-γ und TNF-α für 24 Stunden. 96 Stunden nach der Aussaat der HBMEC (schwarzer Pfeil) - Trans Assays werden 72 durchgeführt. CE. PBMC von 16 gesunden Individuen abgeleitet wurden Migrationstests unterzogen, wie in dem Protokoll beschrieben. 24 h vor dem Assay wird die Hälfte der Zellkultur-Inserts wurden stimuliert mit 500 IU / ml IFN-γ und TNF-α. Transmigrierten Zellen wurden durch Flusszytometrie geerntet und analysiert. C. Repräsentative Ergebnisse für PBMC abgeleitet von der in vitro Kontrollvertiefung (oben) und nach der Migration über uninflamed HBMEC (unten). NK cel CD56 + Zellen und weiter unterscheidet in CD56 hell CD16 dim / - - ( "CD56 hell ") und CD56 dim CD16 + (" CD56 dim") NK-Zell - Untergruppen ls wurden aus Gesamt - Lymphozyten als CD3 gated. Flow Count Fluorospheres ( „Perlen“) wurde gated basierend auf FSC / SSC Eigenschaften und ihre Zahl wurde in einer FL3 gegen die Zeit Handlung bestimmt. Beispielhafte Berechnung des Prozentsatzes der migrierten CD56 hell und CD56 dim NK - Zellen zu bestimmen , werden auf der rechten Seite gezeigt. D. Prozentsatz der migrierten NK - Zellen sowie CD56 hell und CD56 dim NK-Zell - Untergruppen, und E. Prozentsatz der migrierten T - Zellen , einschließlich CD4 + und CD8 + T-Zell - Untergruppen folgender Transmigrations über uninflamed (schwarz) oder entzündete (rot) HBMEC dargestellt als Mittelwert ± SEM. P-Werte wurden durch gepaarten Student t-Test berechnet; ** p <0,01, *** p <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Hier präsentieren wir eine Technik, um die Seelenwanderung von Lymphozyten über die menschliche Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. In - vitro - Analyse von Lymphozyten - Migration auf das ZNS ist wichtig , grundlegende Prozesse der Lymphozyten - Extravasation, potentielle krankheitsbedingte Veränderungen und neue therapeutische Ansätze zu studieren.
Mehrere Modifikationen der Blut-Hirn-Schranke Modell möglich. So könnten beispielsweise Zellen aus dem oberen Kompartiment analysiert werden, um die Zusammensetzung der nicht-umgelagerten Zellpopulation zu untersuchen. Weiterhin kann die Behandlung der HBMEC Monoschicht mit IFN-γ und TNF-α 24 Stunden vor dem Test kann verwendet werden , um eine entzündete Blut-Hirn - Schranke , um ahmte die Wirkung von entzündlichen ZNS - Störungen 21, 25 zu untersuchen. In ähnlicher Weise Behandlung von HBMEC oder Lymphozyten mit anderen Substanzen erlaubt , ihre Auswirkungen auf die Lymphozyten - Extravasation zu untersuchen (zB ihreWirkung auf die Adhäsionsmoleküle) 30, 31. Die Beteiligung bestimmter Adhäsionsmoleküle kann unter Verwendung von blockierenden Antikörpern für Integrine oder ihre Liganden 32 werden untersucht. Weiterhin hier präsentierte Der experimentelle Aufbau ermöglicht die Analyse von chemotaktischen Wirkungen von Chemokinen oder von Astrozyten oder anderen Zellen abgeleiteten Überständen 33, 34 auf . Ersatz von HBMEC mit primärem menschlichem Gehirn stamm Epithelzellen erweitert das Spektrum dieser Versuchsanordnung zur Untersuchung der Blut-Liquor - Schranke 15. HBMEC sollte nicht mit immortalisierten Endothelzellen oder Zellen von anderen Organen abgeleitet ersetzt wird ZNS-Spezifität des Modells zu erhalten. Jedoch brain-derived endothelial Zellen von anderer Spezies verwendet werden könnten Transmigrations in den jeweiligen Tieren 35 zu analysieren. Zusätzlich Retinsäure oder hydrocortisone wurden zu erhöhen Barrierefunktionen beschrieben und könnten somit 36 eingesetzt werden, 37. Im Fall einer begrenzten Zellzahl der Menge der das Assay unterzogen Zellen könnte reduziert werden, weil unser Modell Raten lineare Wiederherstellung bietet zwischen 2 x 10 5 und 1 x 10 6 PBMC (Daten nicht gezeigt). Zur Analyse seltenen Zellpopulationen folgende Transmigrations könnte es zu Pool-Zellen aus mehreren Brunnen erforderlich sein, um eine ausreichende Zellen zu erhalten, die für die Durchflusszytometrie. Schließlich unsere Versuchsanordnung auch verwendet werden, um die Arzneimittelabgabe in das ZNS 38 zu studieren. Eine Porengröße von 3 & mgr; m wird verwendet , typischerweise Lymphozytentransmigrations zu ermöglichen, während eine Porengröße von 0,4 um Lymphozyten Transmigrations verhindert, aber erlaubt , 39 Arzneimittelabgabe zu studieren, 40, 41, 42.
Trotz der verschiedenen Anwendungen des experimentellen Aufbaus hier beschrieben, haben einige Punkte im Auge behalten werden, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten. Die Integrität des porösen Membran sowie die HBMEC einschichtigen ist kritisch. Daher ist es zwingend notwendig, physikalische Beschädigung der Membran zu vermeiden, zum Beispiel mit Pipettenspitzen. Die Zugabe von Flüssigkeiten oder Zellsuspension mit dem oberen Teil des Zellkultureinsatzes sollte ohne direkten Kontakt durchgeführt werden. Droplets könnte an der Grenze des Zellkultureinsatzes abgewischt. Horizontale Anordnung der Pipettenspitze gewährleistet den Schutz des Membran, wenn der abluminalen Membran am Ende des Migrationstest gespült wird. Die Qualität der HBMEC einschichtigen kann durch mikroskopische Auswertung der Einmündung sowie Evans - Blau - Permeation untersucht werden , wie für die Bewertung der Blut-Hirn - Schranke Integrität in rodent Experimenten 43 gezeigt. Zentrifugation von HBMEC bei niedrigeren g - Kräften und Nutzung von frühen Passagen (dh 1 - 15) sorgt für die Qualität und die Einheitlichkeit der Monoschicht. Um die Auflösung von dem porösen Membran zu verhindern, ist es wichtig, auf die beschriebenen Reihenfolge der Aspiration und Zugabe von Medium zu halten, wenn sie mit der einschichtigen HBMEC arbeiten.
Obwohl die Einhaltung der hier beschriebenen Protokoll sinnvolle und reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet, hat diese Technik einige Einschränkungen. Erstens, in vivo die Blut-Hirn - Schranke wird durch eine Anzahl von Zellen gebildet ist , die 1 durch Beeinflussung der Bildung von tight junctions in verschiedener Weise und zur Stärkung der Barrierefunktion in Wechselwirkung treten. Daher wird , obwohl dieses Blut-Hirn - Schranke Modell eine gute Annäherung an die in - vivo - Situation ist, fehlen wichtige Aspekte. Zusätzlich Lymphozyten Extravasation in das CNS durch die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Während jeder kann einzelne Schritt separat untersucht werden, präsentiert die Technik hier bietet keine Informationen über die, diele Prozess der Extravasation unter dem Einfluss von Scherkräften , 2, 44, 45, 46. Schließlich Analyse der migrierten Zellen aus PBMC könnte in Abhängigkeit von der Frequenz der Zellen von Interesse einer Herausforderung sein, da in der Regel nur einstellige Frequenzen von Zellen transmigrieren. Daher wird die Trennung der Populationen von Interesse vor dem Test oder Bündelung von Zellen über mehrere Zellkultureinsätze migriert erforderlich sein. Andere Modelle für die Analyse von Leukozyten-Migration in das ZNS decken einige der Aspekte in unserem Modell fehlen. Co-Kultur mit Astrozyten, Perizyten und / oder Neuronen verwendet , um die Komplexität der Blut-Hirn - Schranke 47 besser zu imitieren. Modelle einschließlich Scherkräfte wie DIV-BBB reflektieren mehr die physiologischen Bedingungen, damit eine komplexere Analyse von Lymphozyten - Diapedese 48 ermöglicht.
Zusammenfassend stellen wir eine leicht zugängliche Technik geeignet für die Untersuchung von qualitativen und quantitativen Lymphozyten Diapedesis über das menschliche Blut-Hirn-Schranke.
The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
Fibronectin 1 mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
HBMEC | ScienCell | 1000 | |
Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
FBS | ScienCell | 1001-b | |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size |
96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
Infinite M200Pro | Tecan | ||
96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
48-well plate | Corning | 3526 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
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