Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.
Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.
Eine Änderung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration in Ei (Eizelle) Aktivierung ist ein konserviertes Bestandteil aller untersuchten Organismen 1,2. Dieses Ereignis löst eine breite Palette von Ca 2+ -abhängigen Prozessen des Zellzyklus und Übersetzung von gespeicherten mRNAs einschließlich Wiederaufnahme. Aufgrund dieser Anforderung für Ca 2+, hat die vorübergehende Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen Visualisierung gewesen Zentrum des Interesses.
Historisch wurden Modellorganismen für Studien über Eiaktivierung ausgewählt basierend auf der Größe und Verfügbarkeit ihrer Eier. Verschiedene Visualisierungs Ansätze wurden verwendet , um folgen und zu quantifizieren Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ -Konzentrationen in diesen Systemen, einschließlich: das Photoprotein Aequorin in Medaka - Fisch 3; Ca 2+ empfindliche fluoreszierende Farbstoffe wie Fura-2 in Seeigel und Hamster 4,5; und Calcium - Grün-1-Dextran in Xenopus 6.
Die Erzeugung und Verbesserung von genetisch kodierte Kalzium - Indikatoren (GeCIS) hat die Fähigkeit , Ca zu visualisieren umgewandelt 2+ Dynamik in vivo 7. Diese genetischen Konstrukte werden in spezifischen Geweben und begrenzen die Notwendigkeit für invasive Gewebezubereitungen 8 ausgedrückt.
GCaMPs sind ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -basierten Klasse von GeCIS , die aufgrund ihrer hohen Affinität Ca 2+ sehr effektiv gewesen sind, Signal-zu-Rausch - Verhältnis und die Kapazität zu 9-11 angepasst werden. In Gegenwart von Ca 2+ erfährt der GCaMP Komplex eine Reihe von Konformationsänderungen, wobei der Ca 2+ Bindung an Calmodulin ausgehend , dass die Ergebnisse in einer erhöhten Fluoreszenzintensität der GFP - Komponente 9.
GCaMPs wurden in der Forschung über Drosophila Neuronen zu visualisieren Änderungen in intrazellulärem Calcium 12 extensiv verwendet. Die jüngsten applicatiauf der GCaMP Technologie Ca 2+ in reifen Drosophila Eier zu visualisieren hat einen einzigen transienten Ca 2+ Welle bei Eiaktivierung 13,14 enthüllt. Die Ca 2+ Welle kann während des Eisprungs in vivo 13 oder bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines ex vivo - Aktivierungs - Assay 13,14 bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden. In dem ex vivo Assay werden Einzel reifen Eizellen aus den Ovarien isoliert und aktiviert , um eine hypotonische Lösung, bezeichnet als Aktivierungspuffer, der die Ereignisse in vivo Aktivierung 15-17 zu rekapitulieren gezeigt wurde.
Diese Ex - vivo - Test ermöglicht eine einfache hochauflösende Visualisierung der Ca 2+ Welle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen einschließlich pharmakologische Unterbrechung, physikalische Manipulationen und genetische Mutanten. Dieser Artikel zeigt die Herstellung von reifen Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung und the nachfolgende Mikroskopie die Ca 2+ Welle mit GCaMP zur Visualisierung verwendet. Dieser Ansatz kann verwendet werden , um die Initiierung und Kontrolle der Ca 2+ Welle zu testen und nachgelagerten Ergebnisse zu untersuchen.
Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben.
1. Vorbereitung für Dissection
Hinweis: Die beschriebenen Schritte sind hier in Übereinstimmung mit E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. 18. Führen Sie die folgenden Schritte zwei Tage vor Bildgebung.
2. Präparieren Drosophila Ovarien
Anmerkung: Die beschriebenen Schritte sind hier gemäß Weil et. al. 18.
3. Isolierkanne Einzelne Ältere Eier
4. Vorbereitung für Imaging
5. Imaging Ex Vivo Eiaktivierung
6. Nach der Akquisition Bildverarbeitung
Hier haben wir gezeigt , wie reif Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung vorzubereiten. Eier Exprimieren eines GECI ermöglichen Abbildung von Ca 2+ Dynamik bei Ei - Aktivierung und den Beginn der Embryonalentwicklung (Abbildung 1). Es sollte , daß auf der GCaMP je bemerkt werden , verwendet, und zwar das Vorhandensein einer Myristoylgruppe, Ergebnisse haben kann leichte qualitative Unterschiede 13 14. Wir haben auch eine Rolle für die funktionelle Aktin während Ei Aktivierung durch die Zugabe eines Inhibitors der Aktin - Polymerisation nachgewiesen, Cytochalasin D, auf den Aktivierungspuffer (Abbildung 2) 14.
Eine Voraussetzung für das Zytoskelett bei Eiaktivierung konserviert. In C. elegans, nach der Befruchtung werden Zytoskelett - Komponenten neu organisiert 21,22 die Ein-Zellen Embryo zum ersten asymmetrischen Teilung vorzubereiten. In Seeigel, Störung der cytoskeletal Umorganisation nach Aktivierung wurde durch Verhindern kontraktilen Ringbildung 23 in den Zellzyklus zu beeinflussen , gezeigt. Die Rolle von Aktin in vermittelnde bleibt ein Ca 2+ Welle und ihrem stromabwärtigen Funktion bei Eiaktivierung in Drosophila vollständig aufgeklärt werden.
In Drosophila, Co-Visualisierung der Ca 2+ Wellen- und Aktin - Zytoskelett können mit dieser ex vivo - Aktivierungs - Assay erreicht werden. Zeitreihen von mehreren Kanälen kann der intrazellulären Ca erworben und Dynamik werden 2+ kann mit Änderungen in Actin - Organisation in der Eizelle (Abbildung 3) angepasst werden.
Abb . 1: A Single Ca 2+ Welle von Drosophila Eiaktivierung Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 nach dem einddition der Aktivierungspuffer (AH). Der Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2+ entsteht am hinteren Pol (B) und pflanzt (BF) mit einer mittleren Geschwindigkeit von ungefähr 1,5 & mgr; m / sec. Initiierung der Welle wird in der Regel innerhalb von 3 min von der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung liefert die intrazellulären Calciumspiegel des reifen Eizelle Voraktivierung Ebenen (G, H). Siehe ergänzende Film 1 (Gesamtzeit 33 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Zugabe von Cytochalasin D zu Activation Buffer stört Ca2+ Wellenausbreitung. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei UASt- myrGCaMP5 exprimierenden Puffer nach Zugabe von Aktivierungs 10 ug / ml Cytochalasin D Endkonzentration (AH) enthält. Während der Ca 2+ Welle am hinteren Pol (A) eingeleitet wird, beeinträchtigt wird , und erreicht nicht die anteriore des Eies (F) (weiße Pfeilspitzen bezeichnen die Vorderseite der Welle). Keine weiteren Änderungen Ca 2+ wurden über 30 min beobachtet). Siehe ergänzende Film 2 (Gesamtzeit 30 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die gleichzeitige Visualisierung von Actin und Ca 2+ bei Egg Aktivierung in Drosophila. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 (Cyan) und UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) nach Zugabe von Aktivierungspuffer (AH). Die Ca 2+ Welle von dem hinteren Pol initiiert und stellt , wie in Fig . 1 erscheint Actin im Laufe der Zeit zu ändern, weiße Pfeilspitzen (A vs H). Der Mangel an Ca 2+ Signaldetektion in der Mitte des reifen Eizelle ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme durch. Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Wir sind dankbar, dass Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya für die Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts; Mariana Wolfner für Diskussionen über die Ei-Aktivierung; Matt Wayland für die Bildgebung zu unterstützen; und Nan Hu für die allgemeine Unterstützung im Labor.
Diese Arbeit wurde von der University of Cambridge, ISSF TTW [Gewährungsnummer 097814] unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
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