Method Article
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta - Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo - Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.
Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen - Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist.
Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.
AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]).
1. Medienvorbereitung
2. murine embryonale Fibroblasten-Ableitung
3. Lentivirale Vector Produktion in 293T-Zellen
Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt.
4. Fibroblast Transduction mit 4 Faktoren und mCherry Steuervektor
Hinweis: Alle Schritte werden in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt.
5. Fibroblast zu ITSC Conversion
Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt.
6. Isolierung einzelner ITSC Linien
Hinweis: Für Schritt 6.3 eine Gewebekultur Haube ist nicht erforderlich. Es wird empfohlen, den inversen Mikroskop mit 70% Ethanol abzuwischen, um die Chancen auf eine bakterielle Kontamination zu minimieren. Einzel ITSC Kolonien können zwischen den Tagen 21 und 28 Tagen nach der Transdifferenzierungs isoliert werden.
Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (2D). 4F-iTSCs Fleck positiv für trophoblast Transkriptionsfaktoren Cdx2 und Tfap2c (Abbildung 2E). Diese ITSC Leitungen können nun für die anschließende in vitro verwendet werden oder in vivo - Analysen, dh in vitro Differenzierungsassays oder Plazenta Chimärisierung Experimenten.
Abbildung 1. Timeline von MEF zu ITSC Conversion. Grafische Darstellung von transdifferentiation von MEF in iTSCs. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Veränderungen der Morphologie Während MEF zu ITSC Conversion.
(A) Mikroskopische Aufnahme rtTA-MEFs. (B) : Mikroskopische Aufnahme transdifferentiated 4F-MEFs. Beispiel einer transdifferentiated Bereich, rot markiert. (C) Beispiel 2 einer transdifferentiated Kolonie am Tag 21 von transdifferentiation nach zehn Tagen Dox Induktion in 4F-MEFs. Die Umgebung geeignet für Unter Kultivierung rot hervorgehoben. (D) : Mikroskopische Aufnahme von 4F-iTSCs nach Subkultivierung. Alle Maßstabsbalken zeigen an 100 & mgr; m. Bilder wurden taken auf einem inversen Mikroskop ein 10fach-Objektiv und Phasenkontrast mit. (E) Immunfluoreszenzfärbung gegen den Transkriptionsfaktoren Cdx2 und Tfap2c in 4F-iTSCs. Nuclei sind mit Hoechst gefärbt. Maßstabsbalken zeigen an 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zellen (Passage zwei vor drei) zu verwenden, genommen werden.
Die Stärke dieses Protokolls ist die Verwendung von Doxycyclin-induzierbaren Vektoren, die für die zeitliche Steuerung der Expression des Transgens ermöglichen. Dies ermöglicht die Erzeugung stabiler ITSC Linien, die die endogene Transkriptionsfaktor Netzwerk aktivieren, die Aufrechterhaltung TSC Schicksal unabhängig von Transgen-Expression. Dies steht im Gegensatz zu zuvor veröffentlichten Protokollen, beschreibt die Induktion von TSC Schicksal aus embryonalen Stammzellen, ein Verfahren That bis heute ergibt nur unvollständig reprogrammierten Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen 1.
Jedoch ist eine bekannte Einschränkung des hier beschriebene Protokoll die variable Anzahl von Schwellen transdifferentiated Kolonien, was es schwierig macht, die transdifferentiation Effizienz vorhersagen. Diese Einschränkungen sind durch mehrere stark variable Faktoren, die für die Transdifferenzierungsergebnis kritisch sind: die Transduktionseffizienz der einzelnen lentiviralen Vektoren, die Menge der Proliferation der Ausgangszellpopulation, und die Menge an Zelltod während transdifferentiation. Unter bestimmten Umständen transdifferentiated scheitern ITSC Kolonien entstehen. In diesem Fall Medien und Reagenzien sollten auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung der echten TSC Kultur getestet werden, vor ihrem Einsatz in ITSC Generation. Zusätzlich Transduktion mit dem 4F kann, da zu hohe Mengen an Transgen-Expression führt zu Zelltod titriert werden. Im allgemeinen Subkultivierung einzelner ITSC lines erfordert einige Übung. In dem Fall , dass Schwierigkeiten bei der Subkultur von iTSCs auftreten (dh., Versagen Unter kultivierten Zellen selbst zu erneuern und stattdessen spontan differenzieren zu halten), einzelne isolierte Kolonien alternativ auf Gerichte mit 50% Zelldichte von Wachstum inaktivierten Feeder plattiert werden kann Zellwachstum und die Anbindung von Zellen zu unterstützen. Die ITSC Linien dann werden allmählich von Feeder während der nachfolgenden Passagierbarkeit entwöhnt. Zu beachten ist, gelang es uns nicht in direkt MEFs in iTSCs mit definierten TX Medium Bedingungen, Umwandlung seit TX Medium ITSC / TSC Linien etabliert unterstützt nur.
Bisher ist das Protokoll für die ITSC Induktion von Fibroblasten nur für murine Zellen etabliert. Daher wird es jetzt von großem Interesse sein, dieses Protokoll auf andere Arten, sich anzupassen und Ableitung von ITSC Linien aus menschlichen oder anderen Modellsystemen ermöglichen. Des weiteren Analyse der genauen Mechanismen der Fibroblasten wird ITSC Umwandlung neue Einblicke in die Natur zu bieten hatdes somatischen gegen extraembryonalen Linie Barriere und Hilfe bei der Prinzipien der Zellschicksal Bestimmung während der normalen und pathologischen Entwicklung zu verstehen.
The authors have nothing to disclose.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
129S2SV | Charles River | 129 |
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