Method Article
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.
Endothelzellen (ECs) sind die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und eine pro-inflammatorischen Phänotyp aufweisen. Obwohl die Entwicklung von Mikrofluidik-Vorrichtungen hat von den Ingenieuren mehr als zwei Jahrzehnten, ihre biologischen Anwendungen beschränkt bleiben gut angenommen. Eine physiologisch relevanten in vitro microvessel Modell durch biologische Anwendungen validiert ist wichtig , um das Feld zu fördern und um die Lücken zwischen in vivo- und in vitro - Studien überbrücken. Hier präsentieren wir detaillierte Verfahren für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einer langfristigen Perfusions-Fähigkeit verwenden. Wir zeigen auch , ihre Anwendungen für die quantitative Messung von Agonist-induzierter Veränderungen in EC [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in Echtzeit konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Das gebildete microvessel NetzArbeit mit kontinuierlicher Perfusion zeigte gut ausgebaute Verbindungen zwischen ECs. VE-Cadherin war Verteilung zu beachten, dass eine engere in intakten microvessels als statisch kultivierten EC Monolayern. ATP-induzierte vorübergehende Erhöhung des EC [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden bei einzelnen Zellebenen quantitativ gemessen, die die Funktionalität der gezüchteten microvessels validiert. Diese mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht ECs unter einer gut kontrollierten, physiologisch relevanten Strömungs zu wachsen, die die Zellkulturumgebung näher an in vivo als bei den herkömmlichen, statischen 2D - Kulturen macht. Das Mikrokanalnetzdesign ist sehr vielseitig, und der Herstellungsprozess ist einfach und wiederholbar. Das Gerät kann einfach an die konfokale oder konventionellen mikroskopischen System integriert werden ermöglicht hochauflösende Bildgebung. Am wichtigsten ist, weil das kultivierte microvessel Netzwerk kann durch primären humanen ECs gebildet werden, wird dieser Ansatz als ein nützliches Instrument dienen zu untersuchen, wiepathologisch veränderten Blutkomponenten aus Patientenproben beeinflussen menschliche ECs und Einblick in die klinische Fragen bieten. Es kann auch als Plattform für Arzneimittelscreening entwickelt werden.
Endothelzellen (ECs) , um die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und weisen eine pro-inflammatorischen Phänotyp 1,2. Die Mikrofluidik - Technologie ermöglicht eine präzise gesteuerte Fluid durch eine geometrisch eingeschränkten mikroskaligen (Submillimeterbereich) Kanäle 3, die die Möglichkeit für die kultivierten Zellen bietet, insbesondere für vaskulären ECs unter gewünschten Strömungsbedingungen zu wachsen. Diese Eigenschaften machen die Zellkulturbedingungen näher an in vivo als die herkömmlichen, statischen 2D - Zellkulturen. Sie sind äußerst wichtig, wenn die Mikrofluidik-Vorrichtungen verwendet werden, um verschiedene Arten von Gefäßsystemen modellieren und EC Reaktionen auf mechanische und / oder chemische Reize zu studieren.
Trotz der Vorteile, die durch die Mikrokanalnetzwerk über eine statische Zellkultur zeigten, die Anpassung und Anwendung von Mikrofluidik in der biomedizinischen field begrenzt bleiben. Berichtet von einer kürzlich erfolgten Überprüfung, die Mehrheit der Veröffentlichungen dieser Bereich (85%) sind nach wie vor in den Ingenieurzeitschriften 4. Die Leistung von mikrofluidischen Systemen ist nicht überzeugend genug gewesen, um für die meisten Biologen von aktuellen Techniken zu wechseln wie die Transwell-Assay und der Makroebene Kulturschale / Glasträger auf diese miniaturisiertes Gerät. Mikrofluidik ist ein multidisziplinäres Feld, das interdisziplinäre Zusammenarbeit erfordert uns darauf, dieses Feld zu bewegen. Das Ziel dieser technischen Artikel ist es, die Wissenslücken zwischen den Disziplinen zu reduzieren und die Herstellungsverfahren verständlich von Biologen machen, während die biologische Anwendung und funktionale Validierung der mikrofluidischen microvessels bereitstellt. Die visualisierten experimentelle Protokolle umfassen die Herstellung von sowohl Mikrofluidik-Vorrichtungen und deren biologische Dienstprogramme, die eine enge Zusammenarbeit zwischen Ingenieuren und Biologen darstellt.
Vor kurzem berichteten wir einigebiologische Anwendungen , die in vitro microvessel Netzwerk mit mikrofluidischen Vorrichtung 5 verwendet wird . Um in geeigneter Weise die Dimensionen des Mikrokanalnetz entwerfen und anwenden, um das gewünschte Schubspannung, ein numerisches Modell mit Computational Fluid Dynamic Software gebaut, um genau das Strömungsprofil abzuschätzen. Primäre humane Nabelschnurvenen - Endothelzellen (HUVECs), die in die Mikrokanäle erreicht Konfluenz ausgesät wurden, dh bedeckt die gesamten Innenflächen des Mikrokanals, in 3-4 Tagen mit kontinuierlicher Perfusion. Die geeignete Barrierebildung wurde durch VE-Cadherin-Färbung nachgewiesen, und im Vergleich mit denen unter statischen Zellkulturbedingungen und in intakten microvessels gebildet. Durch die Anwendung der experimentellen Protokolle einzeln durchbluteten intakten microvessels entwickelt 6-8, gemessen wir quantitativ die Veränderungen in der EG [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) in Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) mit Fluoreszenz - inindikatoren und konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Die Agonist-induzierten Anstieg der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden als notwendig intrazelluläre Signale für Entzündungsmediator-induzierten Anstieg der microvessel Permeabilität 6-15 berichtet. Obwohl einige frühere Studien Bilder zeigten DAF-2 DA geladen mikrofluidischen Geräte 16,17, entsprechende Auflösung und Datenanalyse war noch nicht erreicht 18. Unseres Wissens zeigt diese Studie die erste quantitative Messungen von Agonisten induzierte dynamische Veränderung der endothelialen [Ca2 +] i und NO - Produktion unter Verwendung von Mikrofluidik - basierten System.
Mikrofabrikationstechniken haben die Flexibilität , Mikrokanäle bis zu wenigen Mikrometern herzustellen und die Entwicklung von komplexen Mustern zu ermöglichen , um die Geometrien der in vivo microvasculature imitieren. Hier präsentierten wir ein typisches Mikrokanalnetz mit drei Ebenen der Verzweigung. DiesNetzwerk wird durch die Kombination von Photolithographie hergestellt, die in einem Mikrofabrikations Reinraum- und Weichlithographie durchgeführt wird.
1. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication
Supplemental Video 1 (Rechtsklick zum Download).
Supplemental Video 2 (Rechtsklick zum Download).
2. Endothelzell Säen und Kultur
3. ichmmunofluorescent Anfärben
4. Fluoreszenz - Imaging von Endothelial [Ca 2+] i
5. Fluoreszenz-Imaging von Stickoxid-Produktion
6. Datenanalyse
Dieser Abschnitt zeigt einige der Ergebnisse mit dem kultivierten microvessel Netzwerk mit diesem Protokoll entwickelt erhalten. Die Mikrokanalmuster ist ein Dreipegel - Verzweigungsnetzwerk (1A). In diesem Entwurf ein 159 & mgr; m breiten Mutterkanal verzweigt sich in zwei 126 & mgr; m breite Kanäle und Äste wieder in vier 100 & mgr; m breit Tochter Kanäle. Eine 3D numerische Simulation wurde durchgeführt , um die Scherspannungsverteilungen unter der Strömungsgeschwindigkeit von 0,35 & mgr; l / min (1B) zu schätzen, die in diesem Mikrokanalnetzwerk drei unterschiedlichen Ebenen der Scherspannung zeigt. Die laminare Strömung innerhalb der Mikrokanäle vorhergesagt wird ohne das Vorhandensein von gestörten oder Sekundärströmung hydrodynamisch stabil. Nach einem SU-8 - Master - Form mit einem Standard - Photolithographieverfahren (1C) hergestellt wurde, wurde ein PDMS - Gerät durch Softlithographie hergestellt , um die Mikrokanal ne zu replizierentwork Design in einen transparenten, luftdurchlässige Gerüst (1D - E). Nach EC seeding (1F - G) und 3-4 Tage kontinuierlicher Perfusion erreicht ECs Konfluenz und erfolgreich die Innenflächen der Mikrokanäle bedeckt.
EG F-Actin und Kerne wurden innerhalb des Netzwerks fluoreszierend markierten und konfokalen Bildern dargestellt. Unter der Scherspannung von 1,0 dyne / cm 2, etwa 30% der HUVECs länglich entlang der Strömungsrichtung mit einer erhöhten zentralen Stressfasern, während der Rest 70% ihrer Pflastersteinmuster mit dominiertem peripheren F-Aktin 5 gehalten. Die Scher-induzierte Zellformänderung erscheint weniger prominent als die üblicherweise in statischen 2D-Zellkulturen beobachtet. Eigentlich unter in vivo - Bedingungen haben die ECs verschiedenen Zellformen in verschiedenen Arten von Schiffen, aber nicht leicht Zellform als Reaktion auf den Fluss cha ändernnges. Weitere Studien werden benötigt , um zu bestimmen , ob diese Differenz die Ergebnisse der Kanalgeometrie und Perfusions - Umgebung war, die in vivo - Bedingungen näher sind.
Wir maßen auch erfolgreich ATP - induzierten Veränderungen in EG [Ca 2+] i und NO - Produktion (4 und 5). ATP induziert eine vorübergehende Erhöhung des EC [Ca 2+] i und NO - Produktion. Die mittlere Spitzen FI fluo-4 betrug 187 ± 22% der Basislinie, die bei 35 ± 10 sec nach Beginn der Perfusion ATP auftrat. Die NO-Produktionsrate wurde aus einem Grundniveau von 0,15 ± 0,05 AU pro min auf 1,18 ± 0,37 AU pro min innerhalb der ersten fünf Minuten der ATP Belichtung erhöht. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler (SE) angegeben. Sie sind vergleichbar mit den Ergebnissen aus einzeln perfundiert intakten Venolen abgeleitet 6,9,14,19.
Abbildung 1: Mikrofluidikvorrichtung Fabrication und EC Belastung (A) Die schematische Ansicht des Mikrokanalnetzwerk.. Die Breite und die Verzweigungswinkel der Mikrokanäle sind an jedem Verzweigungsstufen angegeben. (B) Die numerische Simulation von Schubspannungsverteilung. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,35 & mgr; l / min. Die Höhe des Mikrokanals nach der Entwicklung beträgt 80 & mgr; m. Diese beiden Zahlen wurden aus früheren Veröffentlichung mit zusätzlichen Details modifiziert 5. (C) Die Entwicklung der Master - Form. Die Urform des Mikrokanalnetz ist mit SU-8 Photoresist auf Silizium-Wafer hergestellt. (D) Der Prozess der Softlithographie. PDMS-Mischung wird auf die Masterform gegossen und in einem Ofen ausgehärtet. (E) Bonding PDMS Kanal zum Substrat. Das Substrat für dieses Gerät verwendet wird, ein Deckglas spin mit einer dünnen Schicht aus PDMS beschichtet. Der Einlass und Auslass sind mit einem Loch-Puncher erstellt. (F und G) EC Belastung. Etwa 10 & mgr; l der Zelllösung wird am Einlass platziert. Eine sanfte Strömung wird dann induziert durch eine Pasteur - Pipette am Ausgang über Kapillarfluss platzieren. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Konfokale Bilder von EC F-Aktin in kultivierten Mikrokanalnetzwerk (A) eine schematische Ansicht der Netzgestaltung.. Die ausgewählten Bereiche in B gezeigt - D sind in dem Diagramm angegeben. (B - D) Konfokale Bilder von EG F-Aktin (rot) und Kerne (blau) der in vitro microvessel Netzwerk B 1. , C 1 und D 1 sind die projizierten Bilder von der oberen Hälfte der Mikrokanal - Bildstapeln und B 2, C 2 und D 2 die Bild Projektionen aus der unteren Hälfte der Bildstapel werden. E. Der Querschnitt angegeben als 1-1 ', 2-2' und 3-3 'in B 1 - D 1, Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Diese Bilder werden aus früheren Veröffentlichung 5 angepasst. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Vergleiche von VE-Cadherin Verteilung in kultivierten microvessel Netzwerk mit statisch kultivierten EC - Monoschicht und intakte Ratte mesenteric venule (. A) Die schematische Darstellung des Netzwerk - Design mit ausgewählten Regionen in B gezeigt - D. (B - D) VE-Cadherin (grün) und Zellkerne (blau) Färbung des in vitro microvessel Netzwerk D 1 und D 2 sind die obere und untere der projizierten Bilder von derselben Verzweigungsregion gesammelt, respectively.. (E) VE-Cadherin - Färbung von statisch kultivierten ECs. (F) VE-Cadherin - Färbung von individuell intakten Ratte venule perfundiert. Diese Zahl bisher 5 veröffentlicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: ATP-induzierten Anstieg der EG [Ca 2+ p>] i. Die Experimente wurden von 4 Geräten durchgeführt und 7 bis 12 ROIs (Einzel ECs) pro Gerät wurden für die Datenanalyse ausgewählt. (A) Der zeitliche Verlauf der ATP (10 uM) induzierte Veränderungen in der EG [Ca 2+] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) von einem repräsentativen Experiment. (B) Die Bilder des repräsentativen Experiment (Daten in A gezeigt ist). Dies ist eine bisher veröffentlichten Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: ATP-induzierte NO - Produktion Die Experimente wurden in 3 - Geräten durchgeführt , und 11 bis 12 ROIs (Einzel ECs) pro Gerät wurden für die Datenanalyse ausgewählt.. (A ) Zeitabhängige Änderungen von DAF-2 - Fluoreszenzintensität (FI DAF SE ±. Die NO - Produktionsrate (df / dt, gestrichelte Linie), wurde aus dem ersten Differenz Umwandlung der akkumulierten FI DAF (rechte Y - Achse) abgeleitet. (B) Repräsentative Bilder von einem Experiment. Der FI DAF weiter erhöht nach einer NO - Donator, Natriumnitroprussid (SNP), wurde zu dem Perfusat zugesetzt, um eine ausreichende Menge an intrazellulärem DAF-2 angibt , mit NO reagieren. Dies ist eine bisher veröffentlichten Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk, die Charakterisierung von EC Kreuzungen und Zytoskelett F-Actin - Verteilung und die quantitative Messungen der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion eine Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet wird . Perfundierten mikrofluidischen Vorrichtung stellt ein in vitro - Modell , das eine enge Simulation der in vivo mikrovaskulärer Geometrien und Scherströmungsbedingungen ermöglicht. Da die kultivierten microvessel Netzwerk von primären humanen ECs gebildet werden kann, kann dieser Ansatz als ein nützliches Instrument dienen zu untersuchen, wie krankhaft veränderten Blutkomponenten aus Patientenproben durch direkte Perfusion von Patienten Blutproben zu den kultivierten microvessels menschlichen ECs beeinflussen und einen Einblick in die klinische bieten Probleme. Die humanen ECs entwickelt microvessels kann auch für Wirkstoff-Screening verwendet werden, die mögliche Unterschiede bei Arzneimittelreaktionen zwischen menschlichen und tierischen Gewebe zu vermeiden.
ve_content "> Das Substrat der Mikrofluidik-Vorrichtungen in diesem Protokoll gezeigt ist ein Glasdeckglas (150-180 & mgr; m) durch Schleuderbeschichtung mit einer dünnen Schicht aus PDMS. Diese dünne Schicht von PDMS wesentlich für hohe Auflösung und lebendem Gewebe in Echtzeit Bildgebung, da die größere numerische Apertur Ziele der Regel kurzen Arbeitsabstand hat. die laminare Strömung innerhalb des Mikrokanals (Submillimeterbereich) hat einen sehr niedrigen Reynolds-Zahl, und die Druckdifferenz linear mit der Strömungs bezogen, damit die Schubspannungsverteilung ist allein abhängig auf der Kanalgeometrie. Daher kann es durch hochgenaue Perfusionspumpe 20. In unserer vorliegenden Studie die Scherspannung , die auf die HUVEC kultiviert microvessel Netz wurde zwischen 1 bis 10 dyne / cm 2, die in die gut kontrolliert werden ist Bereich der Scherspannung in das venöse System gemessen 21,22. die Makro fluidische Systeme , wie beispielsweise parallele Strömungskammer fehlt komplexen Strömungsmuster. in größerem Maßstab Strömungskammern (mm-cm - Bereich) ECs sind typischerweise nur in der unteren Oberfläche (2D einschichtigen), fehlt die geometrischen Ähnlichkeiten zu microvessels in vivo gewachsen. Wenn die Breite der Strömungskammer mehr als 2 mm ist, wird der homogene Strömung in einem Bereich beschränkt, der von dem Auslass / Einlass der Regel mehrere Millimeter entfernt ist, und ein paar hundert Mikrometern von der Seitenwand 23 weg. Wenn die Breite der Kammer auf den Bereich von Zentimetern erhöht wird, wird die Strömung in verschiedene Stromlinien differenzieren und die Strömungsgeschwindigkeiten werden 24 über die gesamte Fläche ändern. Zusätzlich verbraucht der größeren Maßstab Strömungskammer zumindest 100-mal mehr Perfusat die gleiche Scherspannung wie die in Mikrokanälen zu erreichen. Die Scherspannungsverteilung innerhalb des Mikrokanalnetzwerk kann unter Verwendung eines numerischen Modellierungswerkzeug simuliert werden, und die feststehenden inkompressiblen Navier-Stokes-Gleichungen können von den meisten Finite-Elemente-Software gelöst werden.Die Mikrofluidik-Vorrichtung kann mit einem singl gemacht werdene Maske Mikrofabrikationsprozess. Der Erfolg von kultivierten microvessel Entwicklung erfordert jedoch besondere Aufmerksamkeit auf die Details. Nachdem die Lösung in die Mikrokanäle laden, muss jedes Gerät für die Blasenfallen unter dem Mikroskop vor EC Aussaat überprüft werden. Wenn eine Blase auftritt, ist es noch möglich, es in dieser Phase zu zwingen, indem ein hydraulischer Druck am Einlass mit einem geschlossenen Auslass Anwendung als PDMS ein luftdurchlässiges Material ist. Um eine gewünschte Perfusionsrate, eng anliegende ohne Leck aufrechtzuerhalten ist notwendig, dass alle der Nadel / Schlauchanschlüsse. Das abgestimmte Loch-Puncher und Schlauchgröße sind entscheidend, um eine eng anliegende zu erreichen. Um eine präzise Abgabe der Strömungsgeschwindigkeit, die Spritze auf der Perfusionspumpe und der Vorrichtung sicherzustellen, sollten auf dem gleichen Niveau angeordnet werden. Um das Perfusat ändern, sollten die eingelegte Schlauch vorsichtig aus dem Gerät getrennt werden, um eine Dehnung zu vermeiden. Scherspannung, Schritt erhöht (beispielsweise 10 Stufen der Erhöhung in 18 Stunden) zu erhöhen, sind Empded plötzliche Stromänderung Peeling verursacht EG zu vermeiden.
Frühere Studien einzeln perfundiert intakten microvessels durchgeführt auf zeigten , daß Agonist-induzierte Erhöhungen der EC [Ca 2+] i, und die anschließende endothelialen Stickoxid - Synthase (eNOS) Aktivierung und NO - Produktion erforderlich Signalisierung für erhöhte mikrovaskuläre Durchlässigkeit unter Entzündungsbedingungen 6,7 , 9-13,25. In diesem Protokoll wählen wir ATP als Vertreter Agonisten, da sie häufig von roten Blutkörperchen, Blutplättchen aggregiert, und das verletzte Gewebe oder unter Entzündungsbedingungen in vivo freigesetzt wird. Ein Fluoreszenzcalciumindikator, Fluo-4 AM, wurde verwendet , um die Änderungen in endothelial [Ca 2+] i nach der Einwirkung von ATP zu messen. Die EG [Ca 2+] i Antworten in kultivierten microvessels sind ähnlich denen in intakten microvessels gefunden 7,9. EG NO-Produktion Messung wurde für Biologen technisch anspruchsvoll gewesen.Bis heute hat es keine Fluoreszenzindikator, der die Erfassung von dynamischen Veränderungen in der NO-Konzentration in einer ähnlichen Weise zu den Calciumindikatoren ermöglicht. DAF-2 DA wurde die NO-Produktion zu beurteilen, weit verbreitet. Allerdings müssen die richtige Verwendung, Datenauswertung und Datenanalyse der Nutzer aufmerksam machen. Da die chemische Umwandlung von DAF-2 DAF-2T in Gegenwart von NO ist irreversibel (one way conversion) 26, die detektierte DAF Fluoreszenzintensitätsprofil nicht die Veränderungen der NO - Konzentration darstellen wird. Stattdessen gibt es die akkumulierte DAF-2T Produktion mit der Zeit. Auf der Grundlage dieser kumulierten DAF-2 - Fluoreszenz (FI DAF) -Kurve, die NO - Produktionsrate (df / dt) durch die erste Differenz Umwandlung des FI DAF 7,11 abgeleitet werden. Zeigt nämlich an, die Steigung der FI-Kurve, die Produktionsrate NO und die Plateauphase nicht erkennbar wird die NO-Produktion erhöht. Nach der Konvertierung erzeugten Daten aus diesem Protokoll presented sowohl die basale NO Produktionsrate und die Veränderungen in der NO-Produktion in Reaktion auf ATP mit zeitlicher und räumlicher Auflösung in den einzelnen EG-Ebenen innerhalb des microvessel Netzwerk.
Derzeit wurde PDMS weithin für mikrofluidische Anwendungen verwendet, da es eine optisch transparente, nicht - toxisch ist und gasdurchlässigen weichen Elastomer 27-30. Da jedoch PDMS nicht wasserdurchlässig ist, konnten wir nicht direkt die Permeabilität der EC-Monoschicht zu messen. Um diese Einschränkung zu überwinden, modifiziert einige Anwendungen , die Kanalwandstrukturen wie eine durchlässige Membran in den Kanal zu integrieren 31, oder ein durchlässiges "Fensteröffnungen" mit Mikrosäulen oder Mikrolöcher 32,33 zu schaffen, während andere auf die konzentriert Modifikation von Vorrichtungsmaterialien , wie beispielsweise die Hydrogel Vorrichtungen oder Hydrogel / PDMS Hybridvorrichtungen 17,34-36 verwenden. Die Nachteile solcher Vorrichtungen sind ihre Natur schwächsten Dehydratation und ihrer relativ schwachen mechanische Eigenschaften Stress oder Druck zu stehen. Die zukünftige Entwicklung aus durchlässigem Material mit mechanischer Festigkeit verbessert weiter das Gerät und sein Potenzial für eine breitere biologische Anwendungen.
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte offen zu legen.
Diese Arbeit wurde von National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL56237, National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 und EPS-1.003.907).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
Scalpel | Exel Int | 29552 | |
Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
Silicon wafer | VWR | 14672 | |
SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
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