Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfektion von Nukleinsäuren in Zellen hat eine vielfältige Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung. Beispiele umfassen (1) Reportergene, die Rolle des anderen Gen Elemente Genexpression zu untersuchen, (2) Protein-Expressionsplasmiden, um das Protein von Interesse überexprimiert, und (3) kleine interferierende RNA die Genexpression herunterregulieren. Durch Manipulation des Expressionsniveaus bestimmter Gene und Messen des Differentialwirkung solcher Manipulationen können Forscher die Genfunktionen in den ausgewählten biologischen Systemen abzuleiten. Nicht alle Transfektionsverfahren die gleichen Transfektionseffizienzen und sogar die gleichen Transfektionsverfahren nicht alle Zelltypen ebenso ¹ transfizieren. Daher verschiedene Transfektionsverfahren entwickelt worden, wie beispielsweise Calciumphosphat-Verfahren, DEAE-Dextran, kationische Lipid-Transfektion, kationische Lipid-Polymer nicht-Transfektion, Elektroporation und Nukleofektion ^2,3.

Transfektion in Makrophagen ist ESPEsondere schwierig aufgrund der Tatsache, dass Makrophagen sind professionelle Phagozyten, die sehr empfindlich gegenüber Fremdmaterialien einschließlich Bakterien stammt (methyliert) DNA ⁴ sind. Einführung fremder DNA aktiviert den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) Weg führt zu der Produktion von Cytokinen und Stickstoffmonoxid ^5,6. Diese aktivierten Makrophagen können dann weniger, die auf die Behandlung, die die Forscher beabsichtigen, zu untersuchen.

Unser Labor routinemäßig transfiziert den RAW264.7 Makrophagen-Zelllinie mit Luciferase-Reporter-Gene, und wir haben ein Protokoll, das robust genug ist, um die Luciferase-Signal deutlich höher als Hintergrund zu haben ist auch sanft genug für Makrophagen an ihren Ruhezustand bleiben entwickelt, aber. Die Verhaltensweisen der transfizierten Zellen wurden durch ein Glühwürmchen-Luciferase-Reporter-Gen beherbergen, das die Promotorregion des IκBζ (pGL3- IκBζ) bewertet. IκBζ Expression durch die Bakterienzellwand-Komponente Lippe hochreguliertopolyssacharide (LPS) ^7,8 und durch die anti-inflammatorische Cytokin regulierte, Interleukin-10 (IL-10) ^8. Um für die Transfektion Variation unter Brunnen Konto, kooperieren wir Transfektion ein Steuer Plasmid, das das Renilla-Luciferase-Gen (zB phRL-TK) zur Normalisierung Zwecke. Das beschriebene Protokoll wird nach der Prüfung verschiedener Parameter einschließlich Timing Transfektion Typ Transfektionsreagenzien Mengen von Transfektionsreagenzien und von Plasmid-DNA sowie Verhältnis von Transfektionsreagenz Plasmid-DNA optimiert. Die beiden Transfektionsreagenzien in diesem Protokoll enthalten sind (1) eine auf Lipid basierenden Transfektionsreagenz, und (2) ein Protein / Polyaminbasis Transfektionsreagenz.

1. Plasmid DNA Purification

1. Extrahieren von Plasmid-DNA unter Verwendung eines Maxiprep-Kit nach Vorschrift des Herstellers. Resuspendieren Plasmid-DNA in 500 ul TE Puffer.
2. Führen eine Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion und Isopropanol-Fällung Rest bakterielle Verunreinigungen zu entfernen. Die Anwesenheit von LPS stört Transfektion ^9.
   1. Gib 500 ul Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1, pH 8) mit der Plasmid-DNA und kräftig geschüttelt, für 15 sec. Phenol verursacht schwere Verätzungen der Haut und ist ein Narkosemittel so Verbrennungen sind nicht immer das Gefühl, bis es zu schweren Schäden. Führen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol-Extraktion in der Abzugshaube und seien Sie vorsichtig.
3. Inkubieren der Mischung für 5 min bei RT. Zentrifugieren bei 13.000 xg für 10 min bei RT. Übertragen Sie 350 ul der obere wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Collection-Tube.
4. Mit 350 ul TE-Puffer zu dem Rohr, das die untere organische Phase enthält. Kräftig schütteln für 15 Sekunden. Zentrifugieren bei 13.000 xg für 5 Minuten bei RT. Übertragen Sie 350 ul der oberen wässrigen Phase auf den gleichen 1,5-ml-Collection-Tube.
5. In 70 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und gut mischen. Add 700 ul 100% iges Isopropanol. Gut mischen und inkubieren 10 min bei RT. Zentrifuge bei 13.000 g für 10 MiNaT 4ºC. Entfernen Sie den Überstand.
6. Gib 500 & mgr; l 75% Ethanol zu dem Pellet. Wirbel Proben bei 5000 xg mischen und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. DNA in dem Pellet.
7. Öffnen Sie den Deckel des Röhrchens und der Luft trocknen das Pellet bei RT 5 - 10 min. Das Pellet sollte durchscheinend. Gib 500 ul TE-Puffer, um das DNA-Pellet zu resuspendieren. Erwärmen bei 50 - 60 ° C für 10 min, um das DNA-Pellet zu lösen.
8. Die Absorption bei 260 nm (A260) und 280 nm (A280) mit einem Spektrometer. Berechnen Sie die Konzentration von DNA durch Multiplikation der A260-Wert von 50 ng / & mgr; l. Bewerten Sie die Qualität der DNA durch calculating die A260 / A280-Verhältnis. 2.0 - DNA mit hoher Qualität sollte eine A260 / A280-Verhältnis von 1,8 zu ergeben.

2. Zellkultur und Seeding

1. Kultur RAW264.7-Zellen in DMEM, ergänzt mit 9% fötales Kälberserum (DMEM / 9% FCS) in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator. Bei jedem Durchgang, nehmen die Zellen von der Platte durch kontinuierliches Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Passage die Zellen alle 2 Tage, und Samen von 1,5 bis 2.000.000 Zellen auf einer 10 cm Gewebekulturschale behandelt als Lager. Tauwetter ein neues Lager von Zellen alle 5 - 6 wochen.
2. Am Tag der Transfektion wurden Samen 200.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen in einem Volumen von 500 & mgr; l DMEM / 9% FCS. Inkubieren der Zellen für 4 Stunden in den 37 ° C-Inkubator.
3. Transfektion von Zellen, die entweder mit dem Lipid-Reagens (Schritt 3.1) oder dem Protein / Polyamin-Reagens (Schritt 3.2).

3. Transfektion

1. Lipid basierende Transfektion:
   1. Aufwärmen der Transfektion reagent, um in der Dunkelheit auf RT. Warm up Serum-freien Medium und DMEM / 9% FCS auf 37 ° C.
   2. Mit 0,5 ug Plasmid-DNA in 50 ul serumfreiem Medium in einem 1,5-ml-Röhrchen. Add 2 ul Transfektionsreagenz mit der Pipettenspitze unterhalb der Oberfläche der Flüssigkeit. Vortex 6 Sek.
   3. Verlassen das Reagenz / DNA-Mischung im Dunkeln bei RT für 30 min.
   4. Während der 30-minütigen Inkubation, entfernen Sie die Medien aus dem Brunnen und fügen Sie 250 ul frischem DMEM / 9% FCS in jede Vertiefung.
   5. Nach 30 min, fügen 250 ul DMEM / 9% FCS zu dem Reagenz / DNA-Gemisch. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren.
   6. Werden 300 ul des verdünnten Gemisches in jede Vertiefung. Inkubieren für 2-4 h in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
   7. Entfernen Transfektionslösung und fügen Sie 500 ul DMEM / 9% FCS. Inkubieren für 24 bis 48 h in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator vor der Zellstimulation.
2. Protein / Polyamin basierende Transfektion:
   1. Warm up Serum-freienmittlere und DMEM / 9% FCS auf 37 ° C.
   2. Hinzuzufügen 0,75 ul Transfektionsreagenz auf 18,75 & mgr; l serumfreies Medium. Vortex kurz mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Mit 0,5 ul 1 ug / ul DNA in die verdünnte Reagenz transfiziert. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
   3. Während der 10-minütigen Inkubation, entfernen Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und fügen Sie 250 ul frischem DMEM / 9% FCS in jede Vertiefung.
   4. Nach 10 min, fügen 250 ul DMEM / 9% FCS in das Reagenz / DNA-Gemisch.
   5. Add 270 ul der verdünnten Mischung auf das gut. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator für 2-4 Stunden.
   6. Entfernen Transfektionslösung und fügen Sie 500 ul DMEM / 9% FCS. Inkubieren für 24 bis 48 h in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.

4. Zellstimulation und Luciferase Assay

1. Tauschen Sie Medien in den gut 250 ul frischem DMEM / 9% FCS.
2. In 50 ul LPS oder LPS + IL-10 In den gewünschten Konzentrationen zu der Bohrung. Gibt die Platte an die 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator. Regen Sie für 2 - 6 h.
3. Entfernen Stimulationslösung durch Absaugen, Waschen mit eiskaltem PBS, und fügen Sie 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Rock bei RT für 30 min. Kratzen und übertragen das Lysat auf 1,5-ml-Röhrchen und entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
4. Transfer 40 ul geklärtes Lysat (Überstand), um einen weißen, clear bottom Platte mit 96 Vertiefungen für die Bestimmung der Luciferase-Signalen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
5. Lesen Sie das Luciferase-Signal mit einem Luminometer über das gesamte sichtbare Lichtspektrum.

5. Datenanalyse

1. Berechnung der Firefly Renilla Verhältnis durch Dividieren einzelnen Werte von Firefly Luziferase durch die Werte von Renilla-Luciferase aus jeder Vertiefung.
2. Berechnen Sie die fache Änderung durch Division der Glühwürmchen: Renilla Verhältnis der behandelten gutder unbehandelten gut.

Figur 1 vergleicht die Transfektionseffizienz der beiden Transfektionsreagenzien in RAW264.7. Das Lipid-Reagens ergab typischerweise etwa 25% Transfektionsrate während das Protein / Polyamin-basierende Transfektion führte zu etwa 5% Wirkungsgrad (1A). Der Unterschied in der Transfektionseffizienz wurde auch in Luciferase Signale in RAW264.7-Zellen mit den pGL3-Promotorreporter IκBζ (1B) transfiziert beobachtet. Zugabe von LPS zu diesen transfizierten Zellen erhöhte Leuchtkäfer-Luciferase-Signal, ein direkter Hinweis auf erhöhte Transkriptionsaktivität des Promotors IκBζ Reporter. Mit anderen Worten, legten die Ergebnisse nahe, daß LPS hochreguliert, die Expression des Gens IκBζ Einklang mit früheren Berichten ^7,8 dar. 2 zeigt die in unseren Experimenten erhalten typische Ergebnisse mit Lipid basierende Transfektion als Beispiel. Nach Erhalt einzelner Signalwerte firefly Luciferase und Renilla Luciferase (2A und 2B), wurden die Leuchtkäfer-Luciferase-Signale normiert auf die Renilla Luciferase-Signal (Abbildung 2C). Die Normalisierung wird durch wohl auch Unterschiede in der Transfektionseffizienz empfohlen. Zu bestimmen, ob die Behandlungsbedingungen (LPS oder LPS + IL-10) verändert die Reportersignale, das Glühwürmchen: Renilla-Verhältnis (dh die normierten Signale) der Behandlungsgruppen wurden mit dem der unbehandelten (nicht stimulierten) Probe (2D gegen ). Unsere Daten zeigten, dass die Behandlung von RAW264.7-Zellen mit LPS hochreguliert, die Aktivität des pGL3-IκBζ Promotor-Reporter, die anzeigt, dass LPS erhöhte Transkriptionsebene des IκBζ Gens. In Anwesenheit von IL-10, hatte die IκBζ Promotorreporter geringere Aktivität, was nahelegt, daß IL-10 konnte die LPS- induzierte Transkription des IκBζ Gens inhibieren. Der / Polyamin-basierte Transfektion Protein in der Regelergab niedrigere Werte sowohl Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase-Signale, Fig. 3 vergleicht die Länge der Ruhezeit zwischen Transfektion und Stimulation (24 Stunden oder 48 Stunden), und zeigt, dass die Luciferase-Signale über die Zeit verringert. Die Abnahme des Signals nicht mit der Dateninterpretation stören, wenn das Lipid basierende Transfektion Reagenz verwendet wurde (3A); Induktion durch LPS und Hemmung von IL-10 noch nach 48 h Ruhe beobachtet. Jedoch ist die Abnahme der Signal signifikanter war, wenn das Protein / Polyamin-basierende Transfektion Reagenz verwendet wurde (3B), insbesondere die Renilla-Luciferase-Signale. Als Ergebnis wurde der Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen nicht nach 48 h Ruhe beobachtet.

Einen unerwünschten Effekt Transfektionsverfahren Zelltod so dass die Auswirkung jedes Transfektionsverfahren nach dem Grad der Apoptose wurde bestimmt. Zellen wurden transfiziert, oder nicht, und zum Annexin-V und Propidiumiodid unterworfen (PI)Färbung. Lysate aus diesen Zellen hergestellt wurden, wurden auch auf die Gegenwart von intakten und gespaltenen Poly ADP Ribose Polymerase (PARP) Protein analysiert. Durchflusszytometrische Analyse der Annexin-V / PI gefärbten Zellen vorgeschlagen, dass das Lipid basierende Transfektion leicht erhöht den Anteil von Annexin-V-positiven Zellen im Vergleich zu den nicht transfizierten Zellen, wobei das Protein / Polyamin-basierende Transfektion nicht (4A) . Auch die Lipidbasis leicht erhöht den Anteil der gespaltenen PARP während das Protein / Polyamin-basierende Transfektion nicht (4B) transfiziert. Trotz der erhöhten Anzahl von apoptotischen Zellen, die Morphologie der Zellen durch Lichtmikroskopie nicht geändert (4C). Noch wichtiger ist, die biologische Reaktion der Lipidbasis transfizierten Zellen blieben identisch mit denjenigen der nicht-transfizierten Zellen (Figur 4D). Die Zellen wurden mit LPS ± IL-10, und die Mengen an TNF stimuliert ^5; in den Kulturüberstand sezerniert wurden durch ELISA quantifiziert. Sowohl die nicht-transfizierten und lipidbasierte transfizierten Zellen ähnliche Mengen an TNF in Antwort auf LPS und wurden durch die Zugabe von IL-10 inhibiert. Kein TNF wurde, wenn die Zellen nicht stimuliert (4D) darauf hindeutet, dass die Zellen blieben naiven nach Transfektion.

Abbildung 1. Die Lipidbasis Transfektion ergab höhere Transfektionseffizienz als der / Polyamin-basierte Transfektion Protein. (A) RAW264.7-Zellen wurden ein GFP-exprimierenden Plasmid entweder mit den Lipidbasis oder das Protein / Polyaminbasis Transfektionsreagenzien transfiziert. GFP-Signal wurde durch Flusszytometrie nach 24 Stunden gemessen. (B) RAW264.7-Zellen wurden mit den pGL3-Promotor IkBζ Reporter transfiziert. Nach 48 Stunden Ruhe, cells wurden mit LPS für 6 Stunden stimuliert. Leuchtkäfer-Luciferase-Signal wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Typische Luciferase-Assay-Daten. RAW264.7 Zellen wurden mit TK-Renilla und IkBζ Promoter-Reporter transfiziert. Nach 24 Stunden Ruhe, Zellen wurden mit LPS ± IL-10 für 2 Stunden stimuliert. (A) Firefly Luciferase und (B), Renilla Luciferase-Signale wurden nach Luciferasetest Anweisungen des Herstellers gemessen. (C) Reporter-Aktivität war normiert auf die TK-Renilla-Signal und aufgetragen als Firefly / Renilla-Verhältnis. (D) fache Änderung wird berechnet, indem der berechneteGlühwürmchen:. Renilla Verhältnis der stimulierten Proben durch, dass der nicht-stimulierten Probe Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Die Stärke der Luciferase-Signal zeitabhängig ist. (A) Lipid-basierte transfiziert und (B) Protein / Polyaminbasis transfizierten Zellen wurden entweder ruhte 24 h oder 48 h vor der Stimulierung mit LPS ± IL-10 2 Std. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4. Wirkung der Transfektion auf RAW264.7-Zellen. (A) RAW264.7-Zellen wurden mit dem IkBζ Promotor-Reporter transfiziert. Nach 24 Stunden Ruhe Zelltod wurde durch Annexin-V und Propidiumiodid (PI) Färbung mit einem Durchflusszytometer bestimmt. (B) Die transfizierten Zellen wurden zu Immunoblotting-Analyse für PARP zogen (in voller Länge und gespalten) und GAPDH (Ladekontrolle). Bandenintensitäten wurden dann mit Imaging-Software quantifiziert. L = Lipid basierende Transfektion / Polyamin-basierende Transfektion P = Protein, STP = 0,1 uM staurosporin. (C) Mikroskopbilder von Zellen, die mit dem Lipid-basierte Transfektionsreagenz transfiziert. (D) Zellen, die mit dem Lipid-basierte Transfektionsreagenz transfiziert wurden mit LPS ± IL-10 für 6 Stunden stimuliert, und die Pegel der pro-inflammatorischen Cytokins TNF wurden unter Verwendung von ELISA gemessen. Bitte klicken ererneut, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das hier beschriebene Protokoll nicht allein auf die Transfektionseffizienz zu konzentrieren, sondern zielt darauf ab, einen Ausgleich zwischen Effizienz und Erhaltung der physiologischen Zustände der Zellen zu schlagen. Insbesondere gelingt es unserem Verfahren bei der Minimierung der Toxizität von Transfektionsreagenz und Maximierung der Luciferase-Signal.

Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Gesundheit der Zellen. Wuchert Kulturen nicht geeignet sind für die Transfektion als ihre Physiologie Änderungen und kontinuierliche Kultivierung von RAW264.7-Zellen für einen langen Zeitraum können auch den Phänotyp und die Funktion der Zellen ¹⁰ zu ändern. Frisch aufgetauten Zellen, die einen niedrigen Durchgang Nummer haben wird empfohlen, für die Transfektion verwendet.

Eine weitere wichtige Überlegung ist die Wahl der Transfektionsreagenzien. Lipidbasis Transfektionsreagenzien sind in der Regel in der Forschung aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit und Verfügbarkeit im Handel eingesetzt. Allerdings sind einige dieser Reagenzien verursacht unintended (und in der Regel unerwünschte) Veränderungen in der globalen Genexpression in transfizierten Zellen ^11,12. Um dieses Problem anzugehen, werden die Zellen nur mit den Transfektionsreagenzien für ein paar Stunden statt der typischen O / N inkubiert, oder ein Nicht-Lipidbasis Reagenz zur Transfektion ausgewählt. Längere Inkubationszeit mit dem Transfektionsreagenz wird Transfektionseffizienz zu erhöhen, aber es kann auch schädlich für die Zellen entweder Zelltod oder Zellaktivierung, die beide mit dem Versuchsaufbau stören. 4A und 4B zeigen, dass das Protein / Polyamin- basierte Transfektion nicht verursacht Apoptose oder Nekrose, im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen. Das Lipid basierende Transfektion, auch mit der kurzen Inkubationszeit, verursacht höhere Zelltod. Es wird auf die höhere Transfektionseffizienz der Lipidbasis Transfektionsreagenz korreliert. Jedoch, wenn die transfizierten Zellen unter dem Mikroskop beobachtet wurde, gab es keine bemerkenswerten morphologischen Veränderungs (4C). Aktivierten Makrophagen in der Regel übernehmen eine ausgedehnte Form, aber sowohl die nicht-transfizierten und transfizierten Zellen haben Zeichen der Aktivierung nicht vor der Stimulation zeigen, was darauf hinweist, dass sie in ihrer Ruhezustände waren. Darüber hinaus reagiert die transfizierten Zellen ähnlich wie LPS und IL-10-Stimulation wie die transfizierten Zellen (Figur 4D). Diese Beobachtungen zeigen, dass diese gemeinsam Transfektion Verfahren nicht das natürliche Verhalten der Zellen zu verändern.

Die Zeit zwischen Transfektion und experimentelle Behandlung (die Ruhezeit) ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Genug Zeit muss für die Luciferase-Gene zum Ausdruck zu bringen und für die Zellen zur Wiederherstellung ihrer Ruhezustand gegeben werden; kann jedoch eine lange Inkubationszeit Luciferase Signalen zu reduzieren, insbesondere wenn die Transfektionseffizienz nicht hoch ist.

Die Vorgehensweise gilt für die spezifischen Luciferase-Reportergens in unserem Labor verwendet. Kleinere Anpassungen wird nee seinded, wenn ein anderer Reporter verwendet. Parameter, die getestet werden müssen, gehören verschiedene Luciferase Reporter: Renilla Luciferase-Verhältnis, die Ruhezeit zwischen Transfektion und Behandlung sowie die Behandlungsbedingungen. Ein 50: 1-Verhältnis von pGL3-IκBζ: phRL-TK wird normalerweise verwendet, jedoch ist das Verhältnis im Bereich von 1: 1 bis 100: 1 beträgt. Es wurde festgestellt, dass ein 24-Stunden-Rest zwischen der Entfernung der Transfektionslösung aus den Zellen und dem Beginn der experimentellen Behandlung ergab das beste Signal. Nach 48 Stunden ist der Autor Luciferase Signale rückläufig, und die Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen wurden reduziert oder sogar abgeschafft.

Die beschriebene Transfektionsverfahren ist nicht auf Luciferase-Reporterassays. Andere experimentelle Designs, die keine homogene Population brauchen wird profitiert werden; zum Beispiel Fluoreszenz-Mikroskopie, die auf Beobachtungen aus einzelnen Zellen beruht. Ein Nachteil besteht darin, die erfolgreich transfizierten Zellen bei untransfizierten Pendants zu finden, aber dieVorteile, daß sie weniger zeitaufwendig und arbeitsintensiv und können mehr erwünscht sein. In Fällen, in denen stabile Zelllinien bevorzugt werden, bietet unser Protokoll für eine mittlere anfängliche Versuche, in denen experimentelle Verfahren optimiert, wenn stabile Zelllinien werden erzeugt werden.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.