Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Während der Infektion und Entzündung, lassen zirkulierenden Monozyten in die Blutbahn und wandern ins Gewebe, wo sie in Makrophagen zu differenzieren. Makrophagen exprimieren Oberflächen Toll-like Rezeptoren (TLRs), die molekulare Muster in einer Vielzahl von Mikroorganismen durch Evolution konserviert zu erkennen. TLRs spielen eine zentrale Rolle in Makrophagenaktivierung, die in der Regel mit Genexpressionsänderung verbunden ist. Makrophagen sind kritisch bei vielen Krankheiten und werden als attraktive Ziele für eine Therapie entwickelt. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir ein Verfahren, um murine peritoneale Makrophagen mit Brauerei Thioglykolat-Medium zu isolieren. Letzteres wird Monozytenmigration in das Peritoneum zu steigern, entsprechend wird dies Makrophagen-Ausbeute um das 10-fache zu erhöhen. Mehrere Studien wurden unter Verwendung von Knochenmark, Milz und peritoneale Makrophagen durchgeführt. Allerdings wurden peritoneale Makrophagen gezeigt reiferen auf Isolation zu sein und sind in ihrer funktionalen stabilerkeit und Phänotyp. So Makrophagen aus murinen Bauchhöhle isoliert präsentieren eine wichtige Zellpopulation, die in verschiedenen immunologischen und metabolischen Untersuchungen dienen kann. Nach der Isolierung wurden Makrophagen mit verschiedenen TLR-Liganden stimuliert und damit die Genexpression wurde ausgewertet.

Retikuloendothelialen phagozytische System von Zellen in verschiedenen Geweben und Organen, wie Knochenmark, Blut, Leber und Milz besteht. Makrophagen werden in großem Umfang um den Körper, wo sie vor allem in angeborenen teilzunehmen und adaptiven Immunantwort zu steuern und zu Infektionen klar verteilt. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Immunabwehr, Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und bei der Aufrechterhaltung Gewebshomöostase ^1,2. Darüber hinaus sind Makrophagen nicht nur die Immunfunktion wichtig, sondern auch aktiv in Eisenhomöostase ³ teilzunehmen. Im Körper ist etwa 80% der Eisen im Hämoglobin in Erythrozyten vorhanden ist, die bei seneszenten werden von Makrophagen phagozytiert ^4. Täglich, diese Makrophagen recyceln 25 mg von Erythrozyten-abgeleitete Eisen und bringt ihren Transport in das Plasma ^5. Darüber hinaus während der Infektion und Entzündung, proinflammatorischen Makrophagen maskieren Serum-Eisen auf Eisen VERFÜGBARK reduzierenty, um Krankheitserreger, die an beiden systemischen und lokalen Ebenen ^6-8. Wie gut, Studien haben gezeigt, dass vor allem Makrophagen und Hepatozyten erzeugen ein antimikrobielles Peptid namens Hepcidin, das als das Master-Regulator des Eisenstoffwechsels ^{9, 10} ist. Hepcidin wird hauptsächlich durch inflammatorische Stimuli erhöht und ist teilweise für die Eisenspeicherung in Makrophagen bei chronischen Entzündungen ^11-13 verantwortlich. Wie Hepcidin-Expression in Makrophagen ist nicht sehr gut verstanden, haben wir untersucht die mögliche Rolle von Toll-like Rezeptoren (TLRs) in dieser Regelung. Die TLRs sind in erster Linie auf Makrophagen und spielen eine zentrale Rolle in der Aktivierung. Zusätzlich ist LPS induzierte Hepcidin Expression in der Leber hängt von TLR4 ^13. Daher unserer Untersuchung auszuführen, verwendeten wir ein Verfahren, das auf die Isolierung von murinen peritonealen Makrophagen.

Makrophagen-Zelllinien werden im Großen und Ganzen in Makrophagen Zucht eingesetzter Jahren; dennoch ausgedehnte Kultur Genverluste provozieren und verringerte Immunfunktionen in diesen Zelllinien. Somit ist die Isolierung von Makrophagen aus der Peritonealhöhle entscheidend.

Die Maus Bauchhöhle stellt eine ideale Ort, um Makrophagen ^13-15 ernten. Isolated murinen peritonealen Makrophagen sind bequem für mehrere Studien in Bezug auf ihre immunologische Funktion. Jedoch ist die Anzahl von Makrophagen in das Peritoneum nicht ausreichend ist für umfangreiche Untersuchungen und wird geschätzt etwa 1 x 10 ⁶ Makrophagen pro Maus. Somit Makrophagen Ausgang zu erhöhen, wurde eine sterile Hervorrufen Mittel wie Thioglykolat in die Bauchhöhle vor der Zellernte injiziert. Nach Thioglycolat Injektion wurde die Ausbeute an Makrophagen pro Maus durch das 10-fache erhöht. Trotz der Zunahme der Makrophagen Ertrag, Thioglycolat-Medium wirkt Brewer als Reizmittel, die eine Entzündungsreaktion induziert, was zur Rekrutierung von Makrophagen, die may, aber nicht notwendig Auswirkungen auf die Genexpression. Daher muss eine Kontrollgruppe, bestehend aus nicht-behandelten Makrophagen in jedem Experiment eingeschlossen sein. In unseren Händen, wurde Hepcidin-Expression, die stark durch eine Entzündung stimuliert wird nicht in nicht-behandelten Thioglycolat erkannt ausgelöst Peritonealmakrophagen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass Brewer Thioglycolat rekrutiert zahlreiche Makrophagen, aber nicht ¹⁶ aktivieren. Andererseits löste Brewer Thioglycolat Makrophagen zeigten einen Anstieg der lysosomalen Enzyms, aber eine Verringerung in der Tötung von Mikroorganismen ¹⁷ eingenommen. Allerdings wurde die Phagozytose nicht, wenn sie mit nicht-ausgelöst Makrophagen ¹⁶ im Vergleich betroffen.

Einmal in Schalen kultiviert, die Peritonealmakrophagen verwachsen und ermöglicht damit ihre Trennung von einer anderen Art von Zellen, die aus der Peritonealhöhle isoliert wird. Anschließend wurden die isolierten Makrophagen mit verschiedenen TLR Agonisten herausgefordert.Schließlich mRNA wurde aus den kultivierten Zellen extrahiert, und die Genexpression wurde durch quantitative reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) analysiert.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitlinien nach Genehmigung durch die Institutional Animal Care Committee des Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) durchgeführt.

1. Isolierung, Identifizierung und Kultur von Murine Peritonealmakrophagen

1. Bereiten Sie 3,8% Brau Thioglykolat-Medium. Um dies zu tun, aussetzen 38 g Thioglykolat-Medium in 1000 ml destilliertem Wasser. Bringen Lösung zum Kochen bringen, um das Medium vollständig zu lösen. Sterilisieren durch Autoklavieren bei 121 ° C für 15 min. Speichern Sie bis zu 3 Monate in der Dunkelheit, bei RT ^18.
   HINWEIS: Verwerfen, wenn Trübung entwickelt, die eine bakterielle Kontamination zeigt. Die Lösung kann bis zu einem Jahr im Dunkeln gehalten werden, wenn steril gehalten.
2. Verwendung von 1 ml-Spritzen bis 23 G Nadeln befestigt injizieren 1 ml 3,8% Brewer Thioglykolat-Medium in die Peritonealhöhle jeder Vereinbarungse und warten Sie für 3 Tage. Verwenden Sie neue Spritze und Nadel für jede Maus.
3. Betäuben Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (100 mg / kg) und euthanize Mäuse durch Genickbruch. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Überprüfung der Atemfrequenz. In der Regel schnelle Atmung zeigen, dass die Maus nicht tief anästhesiert.
4. Den Unterleib jeder Maus mit 70% Ethanol waschen. Mit einer Schere, führen Sie einen seitlichen Schnitt entlang der unteren Mittellinie des Bauchfells.
5. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut, um die transparente Bauchhaut freizulegen. Verwendung von 5 ml Spritzen an 20 G Nadeln befestigt injizieren 5 ml kaltem DPBS in die Peritonealhöhle jeder Maus.
6. Führen Sie eine sanfte Massage auf der Bauchhöhle und dann sorgfältig absaugen Flüssigkeit ohne Punktieren jedes Organ. Entfernen Sie die Nadel und verzichtet der Peritonealflüssigkeit in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen.
7. Zentrifugieren für 10 min bei 400 × g in einer gekühlten Zentrifuge.Zellen müssen während des gesamten Verfahrens kalt bleiben. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in RPMI-Medium 1640.
8. Verwendung eines Hämozytometers zählen Zellen und einzustellen, um die Zelldichte auf 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
9. Charakterisierung des Phänotyps isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von 1 x 10 ⁶ Zellen pro Maus und antibodie gegen F4 / 80 (eine Oberfläche Antigens, das auf Makrophagen).

2. Zellbehandlungen

1. Direkt nach der Isolierung, fügen Sie 1 x 10 ⁶ Zellen in jede Vertiefung. Lassen die murine peritoneale Makrophagen durch Kultivieren für 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C in der 6-Well-Platten zu halten. Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen durch vorsichtiges Waschen 3 mal mit warmem PBS.
2. Anschließend Kulturzellen in 900 & mgr; l serumfreiem DMEM für 24 h in Gegenwart der folgenden TLR-Liganden: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml), Poly (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / ml); Flagellin-TLR5 (100 ng / ml); FSL1- TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM).
   HINWEIS: Bereiten Sie für jeden Liganden ein 10-faches Konzentrat. 100 l des letzteren in jede Vertiefung, wodurch die Durchführung einer 10-fachen Verdünnung.

3. RNA-Isolierung

1. Entfernen Sie alle mittleren und lysieren Zellen direkt in den sechs-Well-Platten durch Zugabe von 1 ml TRIzol in jede Vertiefung und das Bestehen der Zelllysat mehrmals in eine Pipette. Die homogenisierte Proben inkubieren 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die vollständige Dissoziation Nukleoproteinkomplexen ermöglichen.
2. Übertragen Lysat in 1,5 ml RNase- und DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen. 0,2 ml Chloroform pro 1 ml TRIzol. Durch kräftiges Schütteln Rohre von Hand für 15 Sekunden und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 bis 10 min. Zentrifuge bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Beachten Sie die Mischung getrennt wird in eine untere rote Phase (Phenol-Chloroform), eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase. RNA liegt ausschließlich in der wässrigen Phase.
3. Transfer sorgfältig die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen, ohne die Interphase zu stören. Ausfällung der RNA aus es durch Mischen mit 0,5 ml Isopropylalkohol. Proben Inkubation bei RT für 10 Minuten und Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Die RNA-Ausscheidungen bildet ein weißes Pellet an der Seite und am Boden des Röhrchens.
4. Überstand entfernen. Mit 1 ml 75% Ethanol waschen das RNA-Pellet einmal. Mischen Sie die Proben durch Vortexen und Zentrifugieren bei 7.500 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Kurz trocknen die RNA (Luft trocknen für 10 min). Lösen sich RNA in 0,1 ml DEPC (RNAse freies Wasser) und Inkubation für 10 min bei 55 ° C.
5. Quantifizieren RNA mit einem Spektralphotometer. Um dies zu tun, verdünnte Proben 100 Mal in DEPC Wasser und bei Wellenlängen von 260 nm gelesen. Die RNA-Konzentration ist dann: OD ₂₆₀ x 40 ng / ul x Verdünnungsfaktor.
6. RNA-Konzentrationen auszugleichen und zu synthetisieren cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von RT-PCR-System für First-Strand cDNA Synthesis Kit. Wieden Anweisungen des Herstellers, messen Gen-mRNA-Spiegel durch Echtzeit-PCR (45 Zyklen) in einer Echtzeit-DNA-Detektionssystem. Normalisierung der Genexpression Ebenen mit zwei Housekeeping-Gen beispielsweise β-Actin und GAPDH.
   HINWEIS: Normalisieren RNA-Konzentration auf 500 ug / ml und mit 0,5 & mgr; g für die cDNA-Synthese.

Zunächst gekennzeichnet die isolierten murinen peritonealen Makrophagen mittels Durchflusszytometrie. Um dies zu tun, haben wir (F4 / 80) Antikörper, die spezifisch Marker nur durch Makrophagen zu erkennen. Diese Charakterisierung wird benötigt, um die Prozentzahl der isolierten Makrophagen zu bestimmen und sie unter den Zellen während des Isolierungsprozesses erhaltenen unterscheiden. Wie in (1) gezeigt, ist der Prozentsatz von Zellen, die das Antigen F4 / 80 wurde übereinstimmend festgestellt, über 95% betragen. Als nächstes, um die Genexpression in Makrophagen zu untersuchen, werden die isolierten Zellen wurden mit verschiedenen TLR-Liganden behandelt: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), LPS (TLR4) und FSL1 (TLR6 / 2). Anschließend wurden die mRNA-Spiegel von Hepcidin (Hamp), unser Gen von Interesse, durch RT-PCR gemessen. Wie in (2), TLR1 / 2 gezeigt, waren TLR4 und TLR6 / 2-Liganden zur Stimulierung Hepcidin mRNA in Mausmakrophagen ^19. Zusammen zeigen diese Ergebnisse die Nützlichkeit dieses Protokoll, um erfolgreichely isolieren murinen peritonealen Makrophagen und genau die molekulare Regulation der Genexpression zu untersuchen.

Abbildung 1. Charakterisierung von Zellen aus der Bauchhöhle. Die Anreicherung der gewonnenen Makrophagen isoliert wurde durch durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung der F4 / 80-Antikörpers nach Blockierung unspezifischer Färbung mit CD16 / CD32-Antikörper bestätigt und wurde immer wieder festgestellt, über 95% betragen.

Abbildung 2. TLR-Liganden induziert Hepcidin-Expression in murinen peritonealen Makrophagen. Nach murinen peritonealen Makrophagen Isolation und Stimulation mit TLR1 / 2, TLR4 und TLR6 / 2-Liganden, Hepcidin-mRNA-Spiegel wurden durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt;nd (nicht nachweisbar); * P <0,05 versus Kontrolle (Strg). Ergebnisse sind repräsentativ für 3 ähnliche Versuche unabhängig voneinander durchgeführt.

Makrophagen sind von entscheidender Bedeutung für das Überleben und ein verlockendes Ziel, um den Host für immunologische Ziele zu manipulieren. Die Entdeckung von TLR und andere Erkennungsmoleküle das Makrophagen zur Mitte der immunologischen Debatte geführt. Makrophagen sind auf eine Vielzahl von Stimuli, einschließlich Cytokinen, Schadens-associated molecular pattern Moleküle (dämpft) ²⁰ und Moleküle mit Gruppen von Pathogenen (PAMPS) ²¹ verbunden. Diese Reaktionen unterschiedliche Stimuli stellen den Verlauf der Makrophagen-Aktivierung, und werden üblicherweise mit plötzlichen Änderungen in der Genexpression, ²² zugeordnet.

In nicht-entzündliche Zustände, die Mehrzahl von Makrophagen liegen an strategischen Orten im Körper. Sie können in allen Geweben und als Umlauf Monozyten im Blut gefunden werden. Daher sind Makrophagen in den meisten anfällig Standorte für mikrobielle Invasion vor.

Die Wirtsabwehr als i beschriebennflammatory Antwort auf die Beseitigung von intrazellulären Pathogenen mit klassischer Makrophagenaktivierung verbunden. Die klassische Aktivierung von Makrophagen durch mikrobielle Produkte wie Lipopolysaccharide in einer Th1 Zytokin-Umgebung, die proinflammatorische M1-Makrophagen Polarisation führen induziert. Die Persistenz der Entzündung führt zu Gewebeschädigungen und die Entwicklung von Anti-Entzündungsmechanismen notwendig für das Überleben des Wirts. Daher erlauben Th2 Zytokinen dann die Einführung der anti-inflammatory M2-Makrophagen Polarisation, die hemmt und regelt die M1 Antwort, und fördert auch die Reparatur von Gewebe. In dem hier beschriebenen Protokoll, Thioglycolat Injektion in die Bauchhöhle stimuliert die klassischen Entzündungskaskade und führt zur Rekrutierung von M1 Makrophagen.

Bisher haben mehrere Studien wurden unter Verwendung von Knochenmark, Milz oder peritonealen Makrophagen durchgeführt. Diese Makrophagen stellen heterogeneous Populationen mit verschiedenen Aktivitäten. Auf der Grundlage ihrer Morphologie und Oberflächen molekularen Eigenschaften, Studien haben festgestellt, dass Peritonealmakrophagen sind reifer als Knochenmark und Milz Makrophagen ^23. Im Gegensatz zu der Milz und Bauchfell Makrophagen präsentieren Knochenmark-Makrophagen eine bemerkenswerte Fähigkeit in pahgocytosis und Proliferation und vollständig von Makrophagen-Vorläuferzellen ^20,24,25 unterschieden werden. Darüber hinaus präsentiert die Isolierung von Knochenmark-Makrophagen eine homogene Ausbeute mit langer Lebensdauer. Andererseits sind diese Makrophagen nicht vollständig charakterisiert, und ihre Verwendung in experimentellen Studien präsentiert Komplikationen aufgrund der Unbeständigkeit der ihren Phänotyp und Funktionen ^26. Im Gegensatz zu Knochenmark-Makrophagen, Milz und Peritoneum Makrophagen scheinen mehr funktionell und phänotypisch stabil ²³ sein.

Daher ist die Isolierung von murinen peritonealen Makrophagen cein dienen verschiedene immunologische Untersuchungen und Genexpressionsanalyse. Darüber hinaus liefert die Maus Peritonealhöhle einen idealen Ort zum Ernten von Makrophagen ^27. Allerdings ist die Zahl hervorgerufenen moderate und um 1 x 10 ⁶ Makrophagen pro Maus geschätzt. Somit, um die Ernte von Makrophagen zu erhöhen, Hervorrufen Mittel wie Thioglycolat wurde in der Bauchhöhle, 3 Tage vor der Zellisolierung ²⁸ eingespritzt. Dieser Agent wird eine entzündliche Reaktion zu induzieren, und entsprechend zu erhöhen Makrophagenkulturen.

Es ist zwingend notwendig, um eine sanfte Massage auf die Bauchhöhle vor Widerruf der langsam die Peritonealflüssigkeit ohne Punktieren jedes Organ durchzuführen. Herausziehen der maximal mögliche Lautstärke ist erforderlich, um die größte Anzahl von Zellen zu sammeln. Im Falle von Blutkontamination kann ein Lysepuffer am Ende des Verfahrens verwendet werden, um rote Blutzellen zu verwerfen. Die ausgelöste Makrophagen kann dann durch Fließ cytometr charakterisiert werden y unter Verwendung von Antikörpern gegen Antigene, die spezifisch für Makrophagen F4 / 80 sind.

Während des gesamten Verfahrens, stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien sind Endotoxin-frei und alle Tiere dauerhaft unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Mit dem dieses Verfahren unter pathogenfreien Bedingungen ist kritisch, weil Makrophagenstimulation vor der bevorstehenden Experimente deutlich den Abgrenzungs ändern.

Nach der Isolierung können die Peritonealmakrophagen in mehreren Studien, einschließlich der Produktion von inflammatorischen Zytokinen, Phagozytose, Zellsignalisierung, Genexpression, Chemotaxis und Toxikologie ²⁹ verwendet werden. Zum Beispiel wird nach Stimulierung mit verschiedenen TLR-Liganden, der ausgelöst Makrophagen untersuchten wir die molekulare Regulation eines Schlüsselregulator der Eisenmetabolismus benannt Hepcidin. 24 Stunden nach der Zellbehandlungen wurde Gesamt-RNA mit Trizolreagenz isoliert und Genexpression wurde mit qRT-PCR analysiert.

Wenn auch RNA-Isolierung scheint ein einfaches Verfahren, muss RNase und DNA-Kontamination vermieden werden, um RNA-Abbau zu verhindern und zu erreichen genaue qRT-PCR-Ergebnisse. Der beste Weg, um DNA-Kontamination zu erkennen ist, eine "Minus-RT" Kontrolle für jede RNA-Probe in einer RT-PCR-Test einbezogen. Wenn ein PCR-Produkt wird von einer RNA-Probe, die nicht transkribiert wurde das Produkt von kontaminierender DNA verstärkten Rückwärts erzeugt. Im Falle von DNA-Kontamination, ist die Verwendung von DNase-Behandlung möglich. Jedoch muß DNase vollständig vor RT-PCR inaktiviert werden, so dass sie nicht neu synthetisierte DNA abbauen.

The authors have no competing financial interests.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada unterstützt (NSERC, gewähren keine 298.515-2011). AL ist der Empfänger eines Ph.D. Stipendium von den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) und MS wurde aus einem Zuschuss von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR, gewähren keine. MOP123246).