Method Article
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Isolierung von RNA mit hoher Integrität ist für die routinemäßige molekularbiologische Experimente wie Northern Blot 9, qRT-PCR 1 oder Genexpressions 5 erforderlich. Die meisten zeitgenössischen Methoden der RNA-Isolierung werden bei Änderungen der Guanidinthiocyanat Protokolle 2, 3 basiert. Guanidinthiocyanat ist eine starke Proteindenaturierungsmittel und effektiv stören die Aktivität der Ribonuklease unter den meisten Bedingungen. Die beliebte Methode der Chomczynski und Sacchi 3 kombiniert Phenol zu dem Guanidinthiocyanat Lyse-Lösung, die Verminderung der Isolation Zeit, über 4 Stunden. Viele im Handel erhältliche RNA-Extraktion Reagenzien werden von der Chomczynski und Sacchi Methode 3 basierend.
Ribonuklease reichen Geweben wie Mensch oder Maus Bauchspeicheldrüse stellt eine zusätzliche Herausforderung für die Isolierung von RNA. Maus Bauchspeicheldrüse kann bis zu 75 mg Ribonuklease 6 enthalten von denen einige Durin freigegeben werdeng Störung der nachfolgenden Gewebe Autolyse Pankreasgewebe. Modifikationen der Guanidinthiocyanat-Protokolle wurden erfolgreich verwendet, um RNA aus Pankreas mit hoher Integrität 2, 4, 7, 10. Infusion von RNA-Stabilisierung in Maus-Pankreas-Reagens erleichtert Isolierung von RNA mit hoher Integrität 4, 7, 10, jedoch Infusion isolieren Lösungen in der Bauchspeicheldrüse erfordert viel Geschick, können spezialisierte Instrumente wie einem Binokular und stören Gewebearchitektur während des Verfahrens kann in Zell-Lyse führen müssen. Perfusion Gewebes mit RNA-Stabilisierung Reagenz könnte mit anderen Anwendungen, einschließlich der Proteinisolierung und histologischen Färbung stören. Darüber hinaus ist diese Technik nicht geeignet zur Isolierung von RNA aus menschlichen Pankreas. Andere Protokolle erfordern die Herstellung von spezifischen Lösungen durch den Prüfarzt 2.
Wir berichten über ein Protokoll zur RNA mit hoher Integrität von Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. ThE-Protokoll verwendet Elemente der bisher veröffentlichten Methoden und wird weitgehend von den Standard-Phenol / Guanidinthiocyanat-basierte Lyse-Reagenz-Protokollen. Es erfordert nicht die Herstellung von Speziallösungen noch erfordert es Infusion von Reagenzien in die Bauchspeicheldrüse. Kritische Schritte für eine erfolgreiche RNA-Isolierung sind eine hohe Phenol / Guanidin-basierte Lyse-Reagenz, um Gewebe-Verhältnis, die Entfernung von unverdauten Gewebe vor der Trennung und Aufnahme einer Ribonuklease-Hemmstoff, um die resultierende RNA-Lösung auslaufen. Mit diesen und anderen Modifikationen, die wir in der Regel isolieren RNA mit RIN größer als 7 um Routine Genexpressionsanalyse verwendet werden.
1. Vorbereitung
Die folgenden Praktiken halten sich an die Richtlinien von Animal Care und Verwenden Ausschuss der Institution (IACUC) eingestellt.
2. Chirurgie, Bauchspeicheldrüse Dissection und Homogenisierung
3. Entfernen von Gewebe Unverdaute
Anmerkung: Nach der Homogenisierung werden kleine Stücke von Gewebe in dem Lysereagenz bleiben. Es ist wichtiger, die so dass einige Gewebe und nicht über Homogenisieren und Risiko Abbau von RNA unverdaut Gewebe schnell aufzulösen.
4. Reinigung der Homogenisator Blades
5. RNA-Isolierung
Der folgende Abschnitt ist identisch mit der Reinigungskits Protokoll. Der Vorteil des Reinigungs-Kits ist, dass sie die Gesamt-RNA auch kleine RNAs zu isolieren.
Die Gesamt-RNA-Ausbeute aus 1 ml Lyse-Homogenat ist 20-40 ug. OD 260/280 Verhältnisse sind in der Regel rund 2,0 und die RIN sind durchweg größer als 7,0. Wenn das RIN ≤ 6, wird die Isolation müssen wiederholt werden. Gelegentlich wird ein RIN, die höher als 8,0 ist erreicht.
Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden der euthanizing Mäuse vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse sind CO 2-Erstickung oder Inhalation von Isofluran. Beide Techniken werden durch zervikale Dislokation gefolgt. Da es möglich ist, dass das chemische Mittel und / oder Verfahren Zeit könnte die Integrität der RNA, die RIN von Maus Bauchspeicheldrüsen RNA isoliert, wobei beide Verfahren wurde im Vergleich zu beeinflussen. Die Mäuse wurden mit CO 2-Erstickung oder Isofluran-Inhalation betäubt; Beide Techniken wurden durch zervikale Dislokation gefolgt. Die Zeit der Betäubung der Tiere vor zervikale Dislokation war etwa 1 bis 2 Minuten länger für CO 2-Erstickung Vergleich zu isoflUrane. RNA isoliert nach Inhalation von Isofluran erzeugt eine RIN von 7,5 ± 0,31 im Vergleich zu einem RIN von 2,2 ± 0,3 (p <10 -4, Mittelwert ± SD, verdreifachen Isolierungen) für CO 2-Erstickung. Die Methode der Sterbehilfe hat einen dramatischen Einfluss auf die RNA-Integrität und die Technik der Isofluran-Inhalation ist bevorzugt, CO 2-Erstickung.
Die Integrität der RNA aus Maus-Pankreas, die in 2, 4 und 8 ml Lyse-Reagenz homogenisiert wurden isoliert wurden verglichen. Wir nahmen an, dass eine Erhöhung des Volumens des Lysereagenz wird zu einem höheren Grad der Ribonuklease Inaktivierung führen. Andere als das Volumen des Lysereagenz, waren alle Bedingungen die gleichen wie in dem Protokoll enthalten sind. Es eine direkte Korrelation zwischen dem Volumen des Lysereagenz in der Homogenisierung und die Integrität der RNA (Abb. 1) verwendet. Die RIN von RNA isoliert mit 2, 4 und 8 ml Lyse-Reagenz war 4,2, 6,5 bzw. 7,4 (Mittelwert, ist dreifacher Ausfertigungolations). Daher 8 ml Lyse-Reagenz sollte in diesem Protokoll verwendet werden.
Für einige Experimente, kann es notwendig sein, sowohl RNA und Protein aus der gleichen Pankreas sammeln. Zum Beispiel kann RNA für qRT-PCR verwendet werden, und Protein kann mittels Immunhistochemie sichtbar gemacht werden. Wenn dies der Fall ist, empfiehlt es sich, die Bauchspeicheldrüse in der Hälfte von Kopf bis Schwanz abgeschnitten. Dies ist wichtig, da die Bauchspeicheldrüse unterscheidet sich anatomisch von Kopf bis Schwanz. Um zu zeigen, ob irgendwelche Unterschiede in der RNA-Integrität zwischen RNA aus jeder Hälfte des Pankreas isoliert vorhanden ist, wurde das folgende Experiment durchgeführt. RNA wurde aus der ersten Hälfte der Bauchspeicheldrüse isoliert. Die RIN aus dieser RNA bestimmt wurde, dass der RNA aus der zweiten Hälfte der Bauchspeicheldrüse isoliert, nachdem es bei der Aufarbeitung der Anfangs Hälfte saß bei RT für ca. 30 Sek. verglichen. Die RIN für die erste Hälfte der Bauchspeicheldrüse betrug 7,4 ± 0,20 im Vergleich zu einem RIN von 6,9 ± 0,55 für die nachfolgende Hälfte. Beim Schneiden in die Bauchspeicheldrüsediese Weise nicht auf Ribonuklease und Verdauung von RNA frei erscheinen, wenn die Bauchspeicheldrüse zu schneidenden, empfiehlt es sich, die erste Hälfte für die RNA-Analyse und die zweite Hälfte für die Protein verwenden.
Lysereagens stört Proteinstruktur und reduziert Ribonukleaseaktivität daher. Aufgrund der großen Menge an Ribonuclease, die in der Bauchspeicheldrüse vorhanden ist, ist es möglich, dass einige aktive Ribonuklease bleibt bei der Lyse und das Homogenat Ribonuklease wird zu der wässrigen Phase zu äquilibrieren. Jede Ribonuklease, die im letzten RNA-Lösung wird bleibt Integrität beeinträchtigen. Um dies zu überwinden, haben wir eine Ribonuklease-Inhibitor zu der wässrigen Lösung von RNA. Die RNA-Integrität wurde von einer RNA-Lösung, die Ribonuklease-Inhibitor, eine, die nicht taten enthalten verglichen. Nach einem Frost-Tau, die RIN für die Lösung der RNA mit Inhibitor betrug 7,3 ± 0,15 im Vergleich zu 2,9 ± 0,65 (Abbildung 2, p <0,001, Mittelwert ± SD, verdreifachen Isolierungen) für denLösung, die nicht-Inhibitor enthielt. Ein weiteres Problem ist die Möglichkeit, dass wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Ribonukleasehemmers macht sie unwirksam zu denaturieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde eine Lösung von RNA, die Ribonuklease-Inhibitor wiederholt eingefroren und aufgetaut. Die RNA-Lösungen, die eingefroren und bis zu 5 Mal aufgetaut wurden noch erzeugt eine RIN von 7 oder höher, während die Lösungen, die eingefroren und 6-mal oder mehr aufgetaut wurden produziert eine RIN unter 7 (Fig. 2). Es wird empfohlen, die RNA-Lösung vor dem Einfrieren aliquotiert und die Anzahl der Gefrier-Tau-Zyklen zu beschränken.
Um die Nützlichkeit dieses Verfahrens zu demonstrieren, führten wir qRT-PCR der isolierten RNA. Der Mittelwert aus dreifachen RIN RNA-Isolierungen war 7,4 ± 0,20 (Mittelwert ± SD). Zufällig geprimte cDNA wurde aus RNA synthetisiert, und die Expression von drei Housekeeping-Genen wurde mittels qPCR unter Verwendung von Standardtechniken gemessen. Die in Abbildung 3 gezeigt, validiert Datenunsere Fähigkeit, Maus Bauchspeicheldrüsen RNA erfolgreich zu nutzen in einem molekularbiologischen Standardtechnik.
1. Hoch Lysereagenz Gewebe Verhältnis verbessert die Integrität der RNA. Die Integrität der RNA aus Maus Bauchspeicheldrüsen, die in 2 (A, D) homogenisiert wurde isoliert, 4 (B, E) oder 8 (C, F) ml Lyse-Reagenz war verglichen. Andere als das Volumen des Lysereagenz, waren alle Bedingungen die gleichen wie in der hier beschriebenen Protokoll. Eine direkte Korrelation zwischen dem Volumen des Lysereagenz in der Homogenisierung und die Integrität der RNA verwendet. (G), Mittelwert ± SD, dreifach-Isolationen. p <0,05, ** p <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Versiondieser Figur.
2. RNA abbaut schließlich nach wiederholtem Einfrieren Auftauen. RNA aus Maus-Pankreas isoliert wurde wiederholt eingefroren und in Gegenwart oder Abwesenheit von Ribonuclease-Inhibitor (RNase I) aufgetaut. Mittelwert ± SEM, ** p <0,001.
Abbildung 3. QRT-PCR von Maus-Pankreas-RNA. RNA wurde aus drei Maus Bauchspeicheldrüsen mit dem optimierten Protokoll isoliert. Die Expression von 18S rRNA, β-2-Mikroglobulin und snoRNA251 wurde mit qRT-PCR (Mittelwert ± SD) bestimmt.
Isolierung von RNA aus Gewebe, die Ribonuklease reich sind eine große Herausforderung für die Molekularbiologie Experimenten. Verschiedene Reagenzien und Kits sind kommerziell erhältlich, die in erster Linie von dem Phenol Guanidinthiocyanat-Methode der RNA-Extraktion basieren. Guanidinthiocyanat denaturiert Protein und verringert die Aktivität der Ribonuklease damit. Die schiere Größe der Ribonuklease in der Bauchspeicheldrüse benötigt jedoch zusätzliche Modifikationen Standardprotokollen der RNA-Isolierung. Ein Protokoll ist hier, dass auf der Standard-Guanidinthiocyanat Methode wird berichtet, enthält noch einige kritische Änderungen sowie Tipps für die erfolgreiche Isolierung von RNA aus Ribonuklease reichen Geweben wie der Bauchspeicheldrüse.
Standardrichtlinien für die Isolierung von RNA sind zu beachten. Diese Techniken sind entscheidend für die erfolgreiche Isolierung von RNA, auch aus Proben, die weniger Ribonuklease reicher als Bauchspeicheldrüse sind. Einige Beispiele sind mit Molekularbiologie water, Ribonuklease freie Hilfs-und Einweg-Kunststoff-Geschirr statt Glas. Es wird empfohlen, Handschuhe zwischen jedem Isolation ändern. Für jemanden, der unerfahren mit Isolierung von RNA ist, ist es empfehlenswert, dass sie Erfahrung mit Isolierung von RNA aus Ribonuklease-armen Proben wie Leber-oder Zellkulturen vor der Einschiffung auf der Arbeit, die Isolierung von RNA aus Pankreas erfordert zu gewinnen. Ausgezeichnet Protokolle existieren, die eine Vielzahl von Punkten bieten für ein erfolgreiches Arbeiten mit RNA-8.
Mehrere wichtige Faktoren für die Isolierung von RNA mit hoher Integrität von Maus Bauchspeicheldrüse sind hier berichtet. Dazu gehören die Lautstärke der Lyse Reagenz bei der Homogenisierung und die Aufnahme einer Ribonuklease-Hemmstoff, um die RNA-Lösung. Das Verfahren einschließlich der Ribonukleasehemmers gut funktioniert, wird aber wiederholtes Einfrieren und Auftauen schließlich reduzieren die RIN, wahrscheinlich aufgrund Denaturierung der Ribonuklease-Inhibitor. Es sollte beachtet werden, dass alle RNA-Lösungen used in dieser Studie ging durch ein Frost-Tau vor RIN Bestimmung. Ein weiteres Verfahren zur Verringerung des Abbaus bei Frost-Tau ist, die RNA-Lösung bei -20 ° C in einem gefällter Form 2 zu speichern. Dies bietet einige Nachteile, nämlich Entfernen des Ethanols und Wiederauflösen des Pellets vor der Verwendung des RNA. Im Vergleich zu den Phenol / Guanidinthiocyanat Reagenz Protokolle 2 Vorteile der Protokoll gemeldet hier ist die Einfachheit der Arbeit mit Lyse-Reagenz und Reinigung Kit, das nicht Herstellung von Speziallösungen und Puffer erfordern. Es sollte auch angemerkt, dass dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um kleine RNAs, die von der Bauchspeicheldrüse der Maus zu isolieren.
Weitere Tipps sind: die Geschwindigkeit der Bauchspeicheldrüse Dissektion und die Methode der Anästhesie vor der Euthanasie (Isofluran-Inhalation ist bevorzugt, 2 Ersticken CO). Mehrere Versuche bei der Durchführung der Bauchspeicheldrüse werden vor der Operation erwarten hohe Quali empfohlenty-RNA. Anpassung des Protokolls zu Ribonuklease-reichen Geweben wie der Milz oder Lunge sollte leicht erreichbar sein.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo und Satyanarayana Rachagani für ihre hilfreichen Kommentare, Anregungen und Austausch ihrer Protokolle. Diese Arbeit wurde durch Gewährung U01CA111294 und einer Idee Development Award von der Ohio State University Interne Research Program.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | Use to cut pancreas from attached tissues |
Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | Use to cut scin of mouse |
Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | Use to hold pancreas while dissecting |
Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
Molecular biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
70% ethanol | Fisher | ||
100% ethanol | Fisher | ||
200 µl pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
RNeasy spin columns | Qiagen | Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
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