Method Article
Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.
Testen das Schicksal der embryonalen oder pluripotenten Stammzellen-Derivate in in-vitro-Protokolle hat zu kontroversen Ergebnissen, die nicht ihre in vivo Potential nicht unbedingt geführt. Vorzugsweise sollten diese Zellen in einer geeigneten Umgebung embryonalen um ihre definitive Phänotyp erwerben platziert werden. Zudem hat Zelllinie Tracing Studien in der Maus nach der Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren meist auf frühzeitig Maus-Embryonen mit noch schwach entwickelten Organe geblieben. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Standard-und Ultraschall-vermittelten Mikroinjektion Protokolle verschiedener Mittel in den Zielregionen des Herzens in Maus-Embryonen an E9.5 und späteren Entwicklungsstadien zu injizieren. Embryonale Explantat oder Embryonen werden dann kultiviert oder links, um in utero weiter zu entwickeln. Diese Mittel umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Virus, shRNA oder Stammzellen abgeleiteten Vorläuferzellen. Unsere Ansätze ermöglichen die Erhaltung der funktion der Orgel während der Überwachung der Migration und das Schicksal von markierten und / oder injizierten Zellen. Diese Technologien können auf andere Organe ausgedehnt werden und wird sehr hilfreich sein, wichtige biologische Fragestellungen in der Biologie der Entwicklung zu befassen.
Vor mehr als einem Jahrzehnt haben menschliche embryonale Stammzellen (HuESCs) aus menschlichen Blastozysten 1 abgeleitet. Seitdem haben sich diese Zellen zum Gegenstand einer wichtigen Forschungsgebiet, das unerfüllte Fragen in der menschlichen Entwicklungsbiologie befasst. HuESCs haben ferner vorgesehen Hoffnungen in der regenerativen Medizin. In den letzten Jahren wurden menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus patientenspezifische Körperzellen erzeugt worden ist, die Bereitstellung von Modellen Erbkrankheit 2. Viele Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen zu verschiedenen Zelllinien, einschließlich Herz-Abstammungslinien 3, wurden berichtet. Die differenzierten Zellen werden oft durch Analyse von RNA und Protein-Expression, Immunfärbung und / oder in-vitro-Funktionstests phänotypisiert. Allerdings haben pluripotente Stammzelle Derivate in einem richtigen embryonalen Umgebung, um zu testen, ob sie die cel vollständig erwerben platziert werdenl Schicksal ihrer embryonalen Gegenstück, und ob sie den echten in vivo Funktion als Reaktion auf regionale Hinweise zu rekapitulieren. Während Tissue Engineering ist vielversprechend, ist es noch nicht bieten alle bekannten und unbekannten Signale der richtigen In-vivo-Entwicklung embryonalem Gewebe 4,5.
Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren in Embryos, einschließlich Maus-Embryonen wurden wichtige Informationen über die Herkunft der embryonalen Zelllinien während der Herzentwicklung 6 gebracht. Beispielsweise Farbstoffinjektion in die Perikardhöhle von Maus-Embryonen ex vivo, gefolgt von in vitro-Kultur von isolierten Herzen, wurde zur epikardialen Zellen und deren Nachkommen 7 beschriftet. Allerdings Farbstoff und retroviralen Zell Kennzeichnung wurden meist auf frühe Mausembryonen mit noch schwach entwickelten Organen oder Hühnerembryonen, die leichter zugänglich sind 8 angewendet. Eine Ausnahme ist das Gehirn, die einfacher in E zum Ziel istmbryos 9,10. Ein solcher Ansatz ist noch nicht zu der embryonalen Mäuseherzen schlagen angewendet.
Um mit Farbstoffen oder Virus ergänzen direkte Markierung und Linienverfolgung in weiter fortgeschrittenen Stadium Maus-Embryonen und erwachsenen Mäusen durchzuführen, hat sich die Zellmarkierung Ansatz mit der Analyse von transgenen Mäusen mit Hilfe des Cre / lox-Technologie kombiniert. Das Cre / Lox-Ansatz jedoch 11 verfügt über einige Einschränkungen aufgrund der räumlich-zeitlichen Spezifität der genomischen regulatorischen Regionen verwendet, um die Expression der Rekombinase zu fahren, und die Effizienz des Cre / Lox Rekombination 12. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht vollständig die spezifischen Fragen der Zellmigration gesteuert erfasst Zellschicksal ehen, da es nur eine Vorstufe zu kennzeichnen nach der Aktivierung der regulatorischen Region zur Cre-Expression zu fahren. Es kann auch nicht an menschlichen Embryonen zu offensichtlichen ethischen Probleme gelten.
Angesichts dieser Einschränkungen, haben wir eine Reihe von neuen protocols, um eine Vielzahl von Zellmarkierungsmittel, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Viren, Modulatoren der Genexpression wie shRNA und DNA-basierte Zellmarkierung Vektoren oder Zellen der Maus Embryo E9.5 und späteren Stadien der Entwicklung in den Zielregionen der injizieren Herz.
Die DNA / Zellinjektionen mit einem Stereomikroskop und eine einfache Mikroinjektionsvorrichtung kombiniert mit ex vivo Embryokultur bis zu 48 h, oder isolierte Herz-oder embryonale Explantatkultur für 48-72 Std. Wir haben auch ein Ultraschall-vermittelte Mikroinjektion Protokoll in embryonalen Maus-Herzen in utero zu melden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Entwicklung von Embryonen 13 und ermöglicht Langzeit-Follow-up der Injektate und / oder markierten Zellen.
Wir fanden, dass diese Ansätze die Erhaltung der Funktion des Organs und liefern eine repräsentative Umgebung als in-vitro-Tests der Stammzellpotential. Es bietet auch die Möglichkeit, Migration folgenvon markierten und / oder injizierten Zellen, ihr Schicksal zu überwachen. Letztendlich sollten diese ein besseres Verständnis der regionalen Gewebemusterbildung und biologische Schlüsselprozesse ergeben.
1. Vorbereitung
Tierverfahren
Holen Sie die Genehmigung aus einem Tierethikkommission und folgen den Richtlinien des Instituts für die Arbeit mit dem Virus, HuESC und / oder iPSC (wenn zutreffend), sowie Maus Handhabung, den Erhalt Maus-Embryonen und die Durchführung Maus Chirurgie. Für den Zeit Paarungen, wird der Tag des Steckers als embryonalen Tag (E) 0,5 / 0,5 Tage post-coitum.
2. Sammlung von E9.5 und E10.5 Embryonen für Ex-vivo-Injection
3. DNA oder Zellinjektion unter einem Stereomikroskop
4. Embryo, Isoliert Herz und Explantation Kultur
5. Ultraschall-gesteuerte Injektion in der Herz-I n utero
Unter Verwendung der oben beschriebenen Injektionsprotokolle können Zellen markiert und / oder in die embryonalen Maus-Herz injiziert werden. Als Proof of Concept, werden mehrere Beispiele gezeigt, in dem die Injektionsprotokoll und die Ex-vivo-AVC Explantation, isoliert Herz, oder ganze Embryokultur wurden kombiniert (Abbildung 1).
Figur 1 zeigt die Herstellung des Embryos vor der Zellinjektion. Die E9.5 Embryo aus seiner Dezidua entfernt, während die Integrität des Dottersacks (Fig. 1A). Der Dottersack befindet sich direkt über dem Herzen (1B) eröffnet. Die Pipette angefahren (Fig. 1C), und die Zellen injiziert. Das Herz behält seine Form (1D) und bleibt schlagen.
Um eine spezifische biologische Frage in der Entwicklungsbiologie, wie die Epithelzellen des Übergangs (EMT) Mesenchym adressieren, wurde ein E9.5 AVC Explantat mit einer SH spritztRNA, die herunterreguliert ein Protein für Endothelzellen-mesenchymale Transition von endokardialen Zellen (Fig. 2A) erforderlich. Das Steuer Embryo wurde mit einer leeren Rückgrat Vektor injiziert. Ebenso wurden Farbtönen Zellen abgeleiteten endothelialen Vor-Klappen Zellen, die GFP unter der Kontrolle des Promotors in der Sox9 AVC an E10.5 injiziert, gefolgt von 48 h explantierten Herzen Kultur. Diese Zellen erwerben Marker der EMT wie Periostin ähnlich den endogenen endokardialen Zellen (Fig. 2B und 2C).
Diese Ex-vivo-Ansätze sind relativ einfach, aber die kurzfristigen Follow-up (maximal 48-72 h) begrenzt. Die Ultraschall-gesteuerte Injektionsverfahren bietet ein technisch anspruchsvoller Ansatz, aber mit der Möglichkeit, langfristige, auch nach der Geburt, in utero Follow-up. Die in utero Injektion von Farbstoff oder viralen Vektoren an spezifische Zellen in Herzbereiche zu kennzeichnen, ist in den 3A-3 gezeigt C. Mit diesem Verfahren können spezifische Markierung von epikardialen Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen (Fig. 3D und 3E) oder Virus (Abbildung 3F) erreicht werden, und das Verfahren kann auf die mit Zellen oder alternative Injektate erweitert werden.
. 1 Zellinjektion in das Herz A:.. E9.5 Embryo im Dottersack B: Visualisierung des Herzens nach dem Öffnen der Dottersack unmittelbar über dem Herzen. Die folgende Einschub zeigt eine Vergrößerung des Herzens und weist den AV-Kanal C:. Ansatz der Pipette auf die AVC D:. Embryo nach 48 Stunden Kultur (H = Herz) injiziert.
. Abbildung 2 Injektion eines shRNA in der AVC eines E9.5 Embryo, der Ex-vivo-EMT endokardialer Zellen in einem Herz Explantation verhindert, dass A:. Kontrolle Backbone-Vektor oder ein shRNA wurde zusammen mit lipotectamine in der AVC eines E9.5 eingespritzt Maus-Embryo; 3 Stunden später wurde das AVC geführt, um EMT der endokardialen Zellen auslösen präpariert und auf einem Kollagengel gezüchtet. Die shRNA herunterreguliert ein Protein, das für EMT BC erforderlich ist:. Farbtöne Zellen abgeleiteten Zellen Klappen entworfen um GFP unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Sox9 wurden in der AVC von E10.5 Embryonen injiziert. Das Herz wurde kultiviert für 2 Tage (B) und anschließend fixiert und mit einem Anti-Antikörper Periostin (C) gefärbt. Der Einschub zeigt eine Vergrößerung der Region AVC.
.. Abbildung 3 In utero Injektion A: Schema der Darstellung der Versuchsanordnung. Die schwangere Maus in Rückenlage positioniert und eine Petrischale mit Silikonmembran über der Einschnittstelle stabilisiert. . 1 = Mikroinjektor, 2 = Wandler, 3 = Petrischale mit Silikonmembran, 4 = Ultraschall-Gel, 5 = Maus mit Uterushörner (rot), 6 = Play-Doh Ton, 7 = Maus Handhabung Tabelle B: Standbild eines Ultraschall-Film (M-Modus), die die Position der Nadel und embryonalen Herzens vor der Injektion. Die weibliche EKG am Boden (grün), Herz-und Atemfrequenz in der unteren rechten (gelb) gezeigt. H = Herz C:. Ultraschallbild, das die Position der Nadel und embryonalen Herzens während der Injektion. Einschub: die Spitze hat den Herzbeutel vergangen, aber das Myokard nicht berührt, so dass die Einspritzaß in den perikardialen Raum des atrioventrikulären Nut eingespritzt werden. Schwarz gepunkteten Linien markieren die Grenzen der Vorhof (A) und Ventrikel (V) D:. Whole mount Bild eines E11.5 Maus-Embryonen, die starke Fluoreszenz des Farbstoffs in die Perikardhöhle E:. Repräsentativen Abschnitt eines E11.5 embryonalen Maus Herzens, Herzbeutel und epikardialen Zellmarkierung mit einem fluoreszierenden Farbstoff (CDCFDA-SE, grün) 4 h nach der Injektion. Die Zellkerne sind mit DAPI (blau) markiert. LA = linker Vorhof, LV = linker Ventrikel, RA = rechter Vorhof, RV = rechter Ventrikel F:. Vertreter Schnitt eines E14.5 embryonale Maus-Herzen, die Mosaik epikardialen Zellmarkierung mit GFP-exprimierenden Lentiviren 3 Tage nach der Injektion. GFP Spezifität zu bestätigen, wurde das GFP-Protein auch mit einem GFP-Antikörper (rot) gefärbt. Die Zellkerne sind mit DAPI (blau) markiert.
Die oben beschriebenen intrakardialen Injektion ex vivo-Protokolle sind für die myokardiale Funktion für mindestens 48 h im mittleren Stadium (E9.5-E11.5) Maus-Embryonen erhalten. Diese Injektions Ansätze ermöglichen räumlich gezielte Injektion von DNA oder Zellen. Die wenigen Beispiele in den Figuren 1-3 gezeigt nachweisen Konzept für die Abgrenzung ex vivo und in vivo molekularen Mechanismen der Entwicklungsprozesse, die in eingeschränkter Herz Regionen, wie EMT der endokardialen oder epikardialen Zellen stattfinden. Am wichtigsten ist, bieten diese Protokolle die Möglichkeit, Migration und das Schicksal der injizierten Zellen, wie menschlichen embryonalen Zellen oder huESC Derivate in einem geeigneten embryonale Umgebung eine bisher unerfüllte Aufgabe folgen. In vivo-Markierung (wie die epikardiale Zellen in Fig. 3) mit sättigenden oder Begrenzung Verdünnungen von Farbstoff oder Virus die Linie Verfolgung von Zelle (Unter-) Bevölkerung kurz-als auch langfristige bASIS, ohne die Notwendigkeit für Cre / lox-Technologie (obwohl die Kombination dieser Techniken können ebenso nützlich sein).
Mehrere wichtige Schritte während der Anwendung dieser Protokolle wurden beobachtet. Zuerst werden die Embryonen sind sehr lichtempfindlich. Es wird daher empfohlen, das Injektionsprotokoll unter einem Stereomikroskop üben so dass das Verfahren mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz innerhalb von 15 min pro Embryo durchgeführt werden. In der gleichen Zeile, sollte die gesamte Ultraschall-vermittelte Injektionsverfahren innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden, um eine gute Lebensfähigkeit von Embryonen zu erhalten und ihre Entwicklung in der Gebärmutter nicht zu gefährden. Manipulation des Uterus auf einem Minimum gehalten werden. Zusätzlich ist zu beachten, dass die Operation auf schwangeren Mäusen dazu neigt, in einer Frühgeburt führen (1-2 Tage früher als normal) ist. Jedoch sollten Neugeborene in der Regel gesund und normal entwickeln. Ferner ist die Penetration der Pipette durch die Gebärmutterwand, Dottersack und der Embryoum den Herzbeutel zu erreichen und schließlich die Herzmuskel ist eine heikle Prozedur (Schritt 5.3.13). Dieser Schritt sollte sorgfältig und vorsichtig erfolgen. Für die Optimierung ist es empfehlenswert, mehrere kurzfristige Farbstoff Injektionen durchführen, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen und auszuschließen Injektion in Nicht-Zielgebieten. Schließlich haben wir keine Entwicklungsherzfehlern zu den Einspritzverfahren für den oben angegebenen Beispielen gefunden. Doch eine genauere, Schritt-für-Bühne, morphologische und funktionelle Analyse durchgeführt werden sollte, um eine normale Entwicklung und Funktion vollständig zu ermitteln während der Phasen von Interesse.
Die Grenzen dieser Technologien sind mehrere. (I) Die Injektion unter dem Stereomikroskop wird durch die Licht-und Temperaturempfindlichkeit der Maus-Embryonen beschränkt. Dies kann durch die Anwendung der Mikroinjektionsverfahrens, um so schnell wie möglich beseitigt werden, regelmäßig zu ersetzen oder Erwärmung des Mediums und die in einem dunklen Raum. (Ii) Die Ex-vivo Kultur der Embryonen oder Explantate ist zeitlich begrenzt, im Gegensatz zu der in utero Ultraschall-gesteuerte Einspritzung, die für Langzeit-Follow-up ermöglicht. Vitalfarbstoffe neigen Zellen fast sofort beschriften und bis zu drei bis vier Tage nach der Injektion sichtbar bleiben. Jedoch wird die Intensität des Farbstoffs durch aufeinanderfolgende Zellteilungen verdünnt werden. Markierung von Zellen mit Lentiviren kann dieses Problem zu überwinden. , Aufnahme des Virus dauert jedoch mehrere Stunden und Ausdruck ist optimal nach 24-48 Stunden, die kurzfristige Analyse verhindert. (Iii) Die Ultraschall-vermittelten Injektion wird durch die Kosten der Ausrüstung beschränkt ist. Die Auflösung des 40-MHz-Wandler ist ausreichend für Mittel-und Spätstadium der Embryonen, aber vor E11.5 mehr Begrenzung für die Stufen.
Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die oben beschriebenen Herzinjektionsprotokolle sollten in Mid-Stage-Maus-Embryonen verwendet werden. Die Ex-vivo-Technik ist mit der Kultur der Embryonen isolierten Herzen oder Explantation kompatibels. Die in vivo-Verfahren ermöglicht Langzeit-Follow-up, einschließlich postnatale Entwicklung. Diese Techniken werden deutlich in der Prüfung der Differenzierungspotenzial von menschlichen Stammzellen Derivate in einer geeigneten Umgebung, sowie im Umgang mit spezifischen Fragen der Entwicklungsbiologie wie Zellmigration und regionale Cues, die wichtigsten Ereignisse in der Straße in Richtung Gestaltung eines funktionellen Herz sind zu unterstützen . Zusätzlich kann unser Verfahren und die der anderen 10 in der Zukunft für die Untersuchung anderer Organe als das Herz, abhängig vom verfügbaren ex vivo-Kulturprotokolle und / oder Entwicklungsstadium in vivo verwendet werden.
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Die Autoren danken der Stiftung Leducq (Mitralklappe) und die Agence Nationale pour la Recherche (ANR gewähren Specistem) für die Finanzierung dieser Forschung.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Setups/Hardware | |||
40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
Microinjector | VisualSonics | ||
Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
Rail system | VisualSonics | ||
rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
Vevo 2100 | VisualSonics | ||
Microinjection | |||
Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
Hamilton syringes | |||
Petri dishes | 10-cm diameter | ||
Mineral oil | Sigma | M8410 | |
Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
Play-Doh | |||
Isoflurane | Vet One | ||
hair removal agent | Nair | ||
Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
Electrode gel (Signa) | Parker | ||
Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
Ultrasound gel | Aquasonic | ||
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
Other | |||
Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
Media and culture reagents | |||
Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
M2 medium | Sigma | M7167 | |
Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
M16 medium | Sigma | M7292 | |
Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
Matrigel | BD | 356230 | |
Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
Injectates | |||
CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
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