Method Article
Wir präsentieren eine Methode für die schnelle, reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen und funktionalisierte Nanopartikel Baugruppen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Studien mit sequentiellen On-Chip-Cycloaddition bioorthogonale Chemie und Antikörper-Antigen-Capture.
Methoden für die schnelle Oberfläche Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Orientierung und Immobilisierungsdichte für Biosensor und Microarray-Anwendungen sehr wünschenswert. In dieser Studie verwenden wir eine hocheffiziente kovalente bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz), um den mikrofluidischen Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten Moleküle ermöglichen . Wir überwachen den Prozess in Echtzeit unter Dauerdurchflussbedingungen mit Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Reversible Immobilisierung zu ermöglichen und sich die experimentellen Bereich der Sensorfläche verbinden wir eine nicht-kovalente Antigen-Antikörper-Einfang-Komponente mit der Cycloaddition. Durch abwechselndes präsentiert TCO oder Tz Einheiten an die Sensoroberfläche, mehrere Capture-Cycloadditionen nun auf einer Sensoroberfläche für On-Chip-Aufbau und Wirkungsstudien zu einer Vielzahl von Mehrkomponentenstrukturen. Wir illustrate dieses Verfahren mit zwei verschiedenen Experimenten Immobilisierung auf einem Biosensorchip, ein kleines Molekül, AP1497, die FK506-bindendes Protein 12 (FKBP12) bindet und die gleiche kleine Molekül als Teil eines immobilisierten und in situ-funktionalisierten Nanopartikel.
Effizienten Konjugationsreaktionen sind wertvolle Werkzeuge für die Befestigung bioaktiver Moleküle auf Oberflächen für eine Vielzahl von Anwendungen der Biotechnologie. Vor kurzem hat die sehr schnell bioorthogonale [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazins (Tz) wurde verwendet, um Zelloberflächen subzellulärer Strukturen, Antikörpern und Nanopartikeln zu markieren ein. - 7 Hier verwenden wir die [4 +2]-Cycloaddition in Verbindung mit Antigen / Antikörper-Capture (GST / anti-GST) für reversible on-Chip-Synthese von Mehrkomponenten-Strukturen für die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Interaktionsanalyse und Überwachung der Prozess in Echtzeit (Abbildung 1). 8,9 Insbesondere die Einnahme-Cycloaddition Strategie ermöglicht Regeneration Oberfläche mit einem festgelegten Protokoll. 8 Als Folge Montage stabile Sensorflächen mit der Kontrolle über Liganden Orientierung und Dichte für eine Vielzahl von neuen Tests Formate ist nun möglich. MitDiese Strategie, die wir zeigen die Immobilisierung von TCO / Tz-derivatisierten kleine Moleküle und zeichnen die Cycloaddition Raten in einer Vielzahl von Pufferbedingungen. Wir wählten die bekannte Interaktion zwischen FKBP12 und einem Molekül, das AP1497 10-12 FKBP12 bindet, als ein Beispiel, um zu überprüfen, dass das Capture-Cyclo Strategie erhält die Fähigkeit des kleinen Moleküls um sein Ziel zu interagieren, wenn entweder direkt an immobilisierte GST-Antigene gebunden oder immobilisiert Nanopartikel (NP).
Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Zuerst wird nun die reversible Immobilisierung von kleinen Molekülen auf Sensorchips möglich. Zweitens TCO / Tz Immobilisierung kleiner Moleküle ermöglicht auch markierungsfreie Interaktionsstudien, die die Ausrichtung der kanonischen SPR Studien umzukehren, und kann eine komplementäre Ansicht eines Bindungswechsel bieten. Drittens, ermöglicht dieses Verfahren die mikrofluidische Synthese gezielt Nanopartikel und sofortige Auswertung ihrer Binding Eigenschaften. Dies verspricht, die Effizienz der Auswertung oder Screening-Nanopartikel gezielt zu verbessern und auch eine Verringerung der Mengen von Nanopartikeln erforderlich. 13-15 Viertens, kann dieser Ansatz die Reaktionskinetik der bioorthogonale Cycloadditionsreaktionen in Echtzeit unter Dauerstrom zu messen. Schließlich ist die TCO / Tz Immobilisierung Chemie in Gegenwart von Serum robust. Insgesamt erwarten wir, dass dieses vielseitige Ansatz wird allgemein erleichtern Aufbau stabiler Sensorflächen für eine Vielzahl von mikrofluidischen Studien mit Relevanz für die in-vitro-und in-vivo-Zellanwendungen.
1. Herstellung von GST und Nanopartikel (NP) Konjugate
2. Oberflächenvorbereitung
Alle Oberflächen-Plasmonresonanz-Tests werden auf einem Biacore T100 Gerät (GE Healthcare) durchgeführt, bei25 ° C unter Verwendung eines CM5-Sensorchip und P-PBS als Laufpuffer, sofern nicht anders vermerkt. Biacore Steuer-und Auswerte-Software mit dem Gerät geliefert werden, zum Aufbau von Versuchen und Analyse von Daten beschäftigt. Zwei Betriebsarten, Anwendungs Assistenten und Handlauf für die Oberflächenvorbereitung und-überwachung auf dem Chip-Capture-Cycloaddition verwendet werden. Die Methode builder-Modus wird für die Einrichtung umgekehrter Orientierung und Bindungsexperimente zur Messung Cycloaddition Reaktionsraten verwendet werden. Daten sind doppelt Referenz subtrahiert und kinetische Analysen werden mit einem 1:1 Langmuir Bindungsmodell durchgeführt.
3. Überwachung On-Chip-Capture-Cycloaddition funktionalisierter Moleküle
4. MONITORING Immobilisierung Dichte und Bestimmung von Cyclo Preise
5. Die Messung der Bindung von FKBP12 immobilisiert AP1497
Umgekehrt Orientierung Bindungsstudien beschäftigen FKBP12 als Analyt und Verbindung AP1497 als immobilisierte Liganden (Abbildung 5). Die allgemeine Methode für diesen Test ist wie folgt mit der Methode Builder-Tool einstellen:
6. Die Messung der Bindung von FKBP12 an AP1497 an immobilisiertes NPs angebaute
Das allgemeine Verfahren zur Immobilisierung von Nanopartikeln, kleines Molekül Derivatisierung und FKBP12-Bindungstest wird wie folgt mit der Methode Builder-Tool-Set-up:
Daten und Zahlen wurden von der Referenz 8 angepasst.
Effiziente reversible Immobilisierung von bioaktiven kleinen Molekülen mit der Kontrolle über Ausrichtung und Dichte spielt eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Anwendungen in der Biosensorik. Verwendung des schnellen bioorthogonalen Reaktion zwischen TCO und Tz beschreiben wir ein Verfahren zur schrittweisen Aufbau und Regeneration von Ligand Oberflächen unter Beibehaltung der biologischen Aktivität. Fig. 2 zeigt die Echtzeit-Überwachung der Tz-BnNH 2 Immobilisierung. Eine Lösung von GST-TCO über einen vorimmobilisiert anti-GST-Oberfläche, was zu ~ 400 RU Anstieg in Reaktion injiziert. Eine zweite Injektion mit Tz-BnNH 2 zeigt eine schnell ~ 15 RU Anstieg in der Antwort. Kein Dissoziation des derivatisierten Antigen nach dem Umschalten auf Laufpuffer Nachweis für die Strukturstabilität beobachtet. Die Oberfläche wird im letzten Schritt des Zyklus regeneriert, um mehrere Capture-Cyclozyklen zu ermöglichen. Unsten dieses Verfahren und Austausch der Tz-BnNH 2-Einheit mit dem AP1497-Tz Molekül erzeugt eine bioaktive Oberfläche für die Interaktionsstudien mit seinen Ziel FKBP12 (Abbildung 5) verwendet. Unterbrechung des Antikörper / Antigen-Wechselwirkung (wie in Fig. 2 gezeigt) regeneriert den anti-GST-Oberfläche, so dass eine neue molekulare Anordnung aufgebaut werden. In diesem Fall wird ein GST-Tz Injektion (Erfassung von ~ 800 RU) mit einer Injektion von NP-TCO (Cyclo ~ 600 RU) gefolgt, effektiv Immobilisierung der Nanopartikel an die Sensoroberfläche (Fig. 3). Nicht umgesetztes TCO-Gruppen auf der NP sind für Cycloaddition mit injiziert Tz-BnNH 2 (~ 22 RU) zur Verfügung. Alternativ AP1497-Tz wird verwendet, um funktionalisierte Nanopartikel-FKBP12-Wechselwirkungen (Fig. 5) zu überwachen. Keine Spaltung der Mehrkomponentenstrukturen (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) beobachtet Nachweis für Strukturstabilität und Bioaktivität (b AP1497-Tz/FKBP12Inding).
Mit Funktionen für die Echtzeit-Immobilisierung (Cycloaddition) Reaktionsüberwachung und Oberflächenerneuerung, die einfache Charakterisierung der Assoziationsrate k a (Cycloaddition Rate) erreicht, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kenntnis der Reaktionskinetik enthält Richtlinien für die Steuerung Immobilisierungsdichte (Kontaktzeit und Konzentration), ein wichtiger Parameter für die Biosensor-Assays. Injizieren steigenden Konzentrationen von Tz-BnNH 2 oder NP-TCO in Doppel GST-TCO oder GST-TZ Oberflächen bzw. erzeugt die Bindungsdaten (rote Linien). Die Bindungsdaten für zwei aufeinanderfolgende Analyten Proben der gleichen Konzentration über die gleiche Oberfläche sind nahezu deckungs reflektieren minimalen Verlust von Antikörper-Bindungskapazität durch mehrere Zyklen von Capture-Cycloaddition und Regeneration. Das Evaluation-Software bietet die Best-Fit-kinetische Analysen (schwarze Linien ) für die cycloaddition Reaktionsgeschwindigkeiten k in Abbildung 4 dargestellt ein.
Fig. 1 ist. Bioorthogonalen Konjugation Strategie zur reversiblen Immobilisierung von derivatisierten Molekülen. A. [4 +2]-Cycloaddition zwischen trans-Cycloocten (TCO) und 1,2,4,5-Tetrazin (Tz) Einheiten, die an die 1,4-Dihydropyridazin-Addukt . B. Versuchsschema für die reversible Immobilisierung von Tz / TCO markierte Moleküle. C. Versuchsschema für die reversible Immobilisierung und Funktionalisierung von Nanopartikeln. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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2. 2) Aufnahme vorge immobilisierten anti-GST von eingespritztem GST-TCO durch anti-GST-Antikörper (t = 0-420 sec), gefolgt von der Injektion von Laufpuffer (t: Echtzeit-Überwachung von Kleinmolekül-Immobilisierung 1) Ausgangs.. . = 420-540 sec), die Persistenz der Interaktion 3)-Cycloaddition zwischen erfassten GST-TCO und tetrazin (Tz-BnNH 2; ~ 15 RU Anstieg der Reaktion t = 540-1,140 sec). Keine Signalabschwächung tritt trotz Umschalten der mobilen Phase auf Laufpuffer (t = 1,140-1,820 s). 4) Regeneration der anti-GST-Oberfläche mit 2 kurzen Injektionen von 10 mM Glycin, pH 2,1 (t = 1,820-2,000 s).
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3. Echtzeit-Überwachung von Nanopartikel-Immobilisierung und Funktionalisierung. 1) Baseline. 2) Erfassung des eingespritzten GST-Tz (t = 0-60 sec). 3)-Cycloaddition zwischen erfassten GST-Tz und injiziert NP-TCO (t = 135-195 sec), gefolgt von der Injektion von Laufpuffer ohne Abklingen des Signals (t = 195 bis 300 sec). 4)-Cycloaddition zwischen immobilisierten NP-TCO-und Tz-BnNH 2 injiziert (~ 22 RU Anstieg der Reaktion, T = 300-360 sec). Es gibt keine Signalabfall trotz Wechsel der mobilen Phase zu Laufpuffer (t = 360 bis 480 sec) den Nachweis für Mehrkomponenten-Stabilität.
4. Repräsentative Sensorgramme, die binding Daten (rote Linie) und kinetische Analysen (schwarze Linien) für die Cycloadditionsreaktion zwischen Tz und TCO-markierte Moleküle in Gegenwart oder Abwesenheit von 100% FBS. Tabelle fasst Association (Cycloaddition) Geschwindigkeitskonstanten k a.
5. SPR-Studien von kleinen Molekül / Protein-Interaktionen in unterschiedlichen Konfigurationen (Top) Synthetische Derivate von FK506:. AP1497 und AP1497-Tz. Die Tabelle zeigt, kinetische und Gleichgewichtskonstanten von Bindungsdaten abgeleitet. Daten von Bindungsexperimenten, bei denen das Protein immobilisiert ist (dh herkömmlichen SPR-Experimente) sind zum Vergleich eingeschlossen.
Die hier beschriebene Methode Capture-Cycloaddition ermöglicht eine schnelle, reversible Immobilisierung von modifizierten Nanopartikeln und kleine Moleküle für markierungsfreie Chip-basierte Interaktion und kinetische Untersuchungen. Die Immobilisierung Protokoll kann in Minuten erfordern <10 uM Konzentrationen von niedermolekularen Liganden durchgeführt werden. Durch Modulation Liganden-Konzentration und Kontaktzeit Immobilisierung Dichten genau kontrolliert werden. Unsere Daten zeigen, dass auf dem Chip bioorthogonale Reaktionen erhalten die Fähigkeit der in-situ-funktionalisierten Nanopartikeln immobilisiert oder kleinen Molekülen, um mit ihren Zielen zu interagieren. Wir haben auch zwei kleine Moleküle (TCO und Tz) mit niedrigem Molekulargewicht gekennzeichnet bimolekularen Cycloaddition Raten. Wir stellen uns vor, dass ähnliche Tests durchgeführt, um zu messen und vergleichen Preise von anderen schnell bioorthogonale Reaktionen werden.
Reversible, kontinuierlichen On-Chip-Nanopartikel-Immobilisierung und in-situ-Funktionalisierung provides schnellen Zugriff auf eine Vielzahl von modifizierten Nanopartikeln für Screening-und Interaktionsanalyse alle im gleichen Experiment. 13-15 im Vergleich zu herkömmlichen Synthese von Nanopartikeln, die verschiedene Schritte zur Reinigung, Immobilisierung und Screening erfordert, stark unsere Methode Eingangsgrößen von Biomaterialien, Lösungsmittel reduziert und Reagenzien, bei gleichzeitiger Reduzierung der Umweltbelange, die sich mit Nanopartikeln Verwendung und Entsorgung. 16. Wichtig ist, dass Nanopartikel Funktionalisierungen robust Gegenwart von Serumkonzentrationen typischerweise für Zellkulturexperimente verwendet werden, und auch eine extrem hohe Serumkonzentrationen. Diese Funktion kann von Struktur-Wirkungs-Beziehungen für Nanopartikel Design in Gegenwart von Serum (das die Proteinkorona und Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel beeinflussen können) zu erleichtern. 17,18
In den meisten SPR-Assays, in denen Protein-Kleinmolekül-Wechselwirkungen untersucht werden, ist das Protein (Ligand)durch einen Affinitäts-Tag (GST, Biotin, etc.) oder durch kovalente Amidbindungen immobilisiert. Der Analyt wird dann über die Ligandenbindungsergebnisse geleitet, wo der Oberflächenmassenvariationen, die als Änderungen des Brechungsindex festgestellt werden. Die Umkehrung der kanonischen SPR Ausrichtung und Fixierung des kleinen Moleküls in eine bequeme und reversibel bietet einfachen Zugang direkte Bindung von löslichen makromolekularen Ziele zu studieren und stellt klar, phasenspezifische (immobilisiert vs löslich) Artefakte. 19,20 Assay-Formate dieser Art sind vor allem wertvoll für die Hemmung und Wettbewerbsstudien. 21. Umkehr der Orientierung kann auch vorteilhaft sein, unter mehreren Umständen, dh a) mit Analyten mit niedrigem Molekulargewicht, wenn man bedenkt, dass die Bindung Signal proportional zur Oberflächenmassenänderung b) Aggregation und Nicht-Spezifität von hydrophoben Analyten 22 eliminiert macht Datenanalyse einfach c) Charakterisierung von hochaffinen Bindemittel könneneine Herausforderung aufgrund der langen Aufenthaltszeiten (langsam off-Tarife, vor allem beim Umgang mit kovalenten Inhibitoren) 23 und die Notwendigkeit zur Regeneration Oberflächenbeschaffenheit in der Vorbereitung für den nächsten Analysezyklus d) Regenerationsmittel können erniedrigende Wirkung auf die Struktur oder Funktion des haben immobilisierten Protein.
Durch die Einbindung der bioorthogonale Capture-Cycloaddition Verfahren als Teil unserer Strategie Immobilisierung, zu umgehen, haben wir einige der Schwierigkeiten, die mit herkömmlichen kleinen Molekül Immobilisierungstechniken verbunden. Diese erfordern viel höher Liganden-Konzentrationen, da elektrostatische Anziehung, die zu Oberflächen typisch für Proteinimmobilisierung Protokolle vor-Konzentrationen sind unwirksam, mit kleinen Molekülen. Dementsprechend steigenden Konzentrationen von Liganden führt zu einer zunehmenden Verhältnissen von organischen Co-Lösungsmittel für die Liganden Auflösung. Beide Bedingungen sind nicht mit Mikrofluid-Strömungssystemen kompatibel und als Folge können herkömmliche immobilizations müssen außerhalb des Gerätes, wo Echtzeit-Überwachung ist nicht möglich. Schließlich 24, im Falle einer erfolgreichen konventionellen Immobilisierung verhindert kovalente Oberflächenmodifizierung Oberfläche Regeneration und begrenzt den experimentellen Bereich von Biosensor-Oberflächen, was zu erhöhten Investitionen in Zeit, Aufwand durchgeführt werden und Kosten.
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Wir erkennen die Finanzierung von NIH (NHLBI Vertrag Nr. HHSN268201000044C Rw, SH und SYS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
Equipment | |||
SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 |
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