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Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.
Entzündung des Magen-Darm-Trakt ist eine häufige Ursache für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen. Tierforschung Modelle sind kritisch untersucht die komplexen zellulären und molekularen der intestinalen Pathologie. Obwohl der Tunica mucosa ist oft das Organ von Interesse in vielen entzündlichen Erkrankungen, aktuelle Arbeiten gezeigt, dass die muscularis externa (ME) ist auch ein sehr immunkompetenten Organ, das ein dichtes Netz von Resident Immunozyten birgt. 1,2 Diese Arbeiten wurden im Rahmen des standardisierten durchgeführt Modell der intestinalen Manipulation (IM), die zur Entzündung des Darms Wand führt, hauptsächlich zum ME begrenzt. Klinisch Entzündung führt zu verlängerten intestinale Motilitätsstörungen, wie postoperativer Ileus (POI), die eine häufige und unvermeidbare Komplikation nach abdominale Chirurgie ist bekannt. 3 Die Entzündung wird durch Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren, wie IL-6 oder IL-4 1β oder hemmende Neurotransmitter dadurch wie nitric-Oxid (NO). 5 Anschließend extravasieren enorme Anzahl von Immunzellen in das ME, dominiert von neutrophilen Granulozyten (PMN) und Monozyten und schließlich halten POI. 2 tagelangen, führt dies Darmlähmung zu einem erhöhten Risiko einer Aspiration, bakterielle Translokation und infektiöse Komplikationen bis zur Sepsis und Multiorganversagen und verursacht eine hohe wirtschaftliche Belastung. 6
In diesem Manuskript demonstrieren wir die standardisierten Modell von IM-und in vivo Beurteilung der Magen-Darm-Transit (GIT) und Darmpassage. Weiterhin zeigen wir, ein Verfahren zur Trennung des ME von der Tunica mucosa durch immunologische Analyse, die von entscheidender Bedeutung, um zwischen den Entzündungsreaktionen in diesen beiden stark immunaktives Darmwand Abteile zu unterscheiden gefolgt. Alle Analysen sind leicht übertragbar auf andere Forschungs-Modelle, die gastrointestinale Funktion.
Ein. Tiere
Männliche C57Bl6 / J-Mäusen mit einem mittleren Gewicht von 25 g wurden von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland) erhalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Bundesgesetz über den Schutz von Tieren durchgeführt. Die Grundsätze der Labor animal care folgten. Die Tiere wurden auf einer 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus gehalten und mit handelsüblichen Nagetierfutter und Leitungswasser ad libitum. Die Tiere sollten mindestens 7 Tage nach der Ankunft in Ihrem Tier Anlage vor Experimenten untergebracht werden. Beachten Sie, dass alle Experimente leicht an Ratten oder andere Arten angepasst werden und mit leichten Modifikationen in großen Tiermodellen.
2. Operative Verfahren
3. Postoperative Pflege
4. Funktionelle Studien 24 Stunden nach IM
Anmerkung: Durch Multiplizieren Prozentsatz der Fluoreszenz jedes Segment mit seiner Segmentnummer ein gewichteter Mittelwert der Verteilung der Marker innerhalb des Darms wird beurteilt. Dieser Punkt wird sowohl durch die Verteilung und Entfernung von Marker Paar beeinflusst, sondern übernimmt keine spezifische zugrundeliegenden Verteilung. 7 Der berechnete Wert GC oft in Kombination mit einem Graph, der die Verteilung von FITC-Dextran über den Gastrointestinaltrakt (1A) dargestellt.
5. Histochemische Analyse von isolierten ME Proben
6. Organ Culture of ME
7. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Effekt von IM auf GIT (A + B) und Kolontransitzeit (C) wurde als das GIT Prozent der nicht absorbierbaren Fluorescein-markiertes Dextran in 15 Segmente gastrointestinalen-Magen (Sto), Dünndarm (SI 1-9 gemessenen ), Blinddarm (KEK) und Dickdarm (Co) -90 min nach der oralen Einnahme. Darmpassage wurde als die Zeit vom Herausziehen der Fistel-Sonde bis Ausscheidung eines 2 mm Glasperlen gemessen. (A) Gastrointestinal Verteilung von Fluoresceinisothiocyanat-dextran nach Sham-Operation oder IM. In scheinoperierten Tieren meisten der Markierer im Caecum oder dem proximalen Kolon verglichen mit proximalen Jejunum Lage im manipulierten Tieren. Gestrichelten Linien zeigen berechnete GC. (B) Die Berechnung der GC zeigte eine verlängerte gastrointestinale Transitzeit nach IM. (C) Colonic Laufzeit zeigten eine signifikante Verzögerung in IM Mäusen verglichen mit sham operierten Tieren. GC für die 15 Darmabschnitten sind als Mittelwert (n = 5) dargestellt. Colonic Laufzeiten angezeigt wurden meine mit allen einzelnen Werten (n = 6). *** = P <0,001, Student-t-Test.
Abbildung 2. Nachweis von MPO positiven Zellen innerhalb Dünndarms ME. (A) ME ganze Halterungen wurden mit Hanker Yates Reagenz zum Nachweis von MPO positiven PMN 24 Stunden nach Laparotomie (Sham) oder IM Verfahren angefärbt. (B) Quantifizierung der MPO positive Zelle innerhalb 5 zufällig ausgewählte Felder pro Maus. n = 6 animals pro Gruppe. *** = P <0,001, Student-t-Test.
Abbildung 3. NO-Produktion in Kulturüberständen von ME. Muscle Proben aus operierten Kontrollen, betrieben Schein und IM Mäuse wurden 24 Stunden nach der Operation entnommen und kultiviert für 24 Stunden. Unbehandelte Mäuse zeigten nur eine sehr geringe basale Produktion von NO. Nach Laparotomie NO Befreiung ohne Messung signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und Sham behandelten Tieren erhöht. 24 Stunden nach IM NO-Produktion ist drastisch im Vergleich zu unbehandelten oder Sham behandelten Tieren erhöht. n = 5 Tiere pro Gruppe. *** = P <0,001, 1 ANOVA.
Eine vergleichende Studie zur Analyse unterschiedlicher IM (Dünndarm Eventration für 10 min gegenüber vorsichtig Inspektion des Dünndarms mit zwei Watteträger gegenüber IM mit der Evakuierung des Dünndarms Inhalte in den Blinddarm) zeigten eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der chirurgischen Manipulation und POI. Im Vergleich mit den anderen Gruppen IM zeigte die höchste Menge an Leukozyten im ME (PNMS, Makrophagen und Mastzellen), die sich in langen und schweren POI. 8.
Bei der Festlegung des Modells der IM sind einheitliche Bedienung und Stärke des Darms Manipulation kritische Schritte. Durch Berühren des Mesenterium während dieses Vorgangs muss unbedingt vermieden werden, um Blutungen zu verhindern. Unzureichende Festigkeit während IM wird in einem Mangel an Dünndarms Distension führen. IM Technik und Kraft variiert zwischen verschiedenen Chirurgen führt zu einer signifikanten Veränderung der POI Auftreten. Das gleiche Betreiber sollte alle Tiere in einem Experiment zu manipulieren.
Analyse GIT und Darmpassage in vivo ist kritisch und muss sorgfältig durchgeführt werden. Jedes Tier sollte während des Verfahrens in abgedunkelten Käfigen und in einem stillen Raum untergebracht werden. Die Tiere sollten mindestens 7 Tage nach der Ankunft in der Tierhaltung zu adept für die Umwelt (Nahrung, Wasser, Zimmer, hell dunkel Zyklen, immunologischen Bedingungen) untergebracht werden. Die Messung der beiden, GIT und Darmpassage, ermöglicht ein auch zwischen Darmentzündungen und Lähmung in behandelten und nicht-behandelten Bereichen zu unterscheiden. 9 weitere anspruchsvolle Verfahren der in-vivo-Motilität Aufnahmen wach Nagetieren wurde von Königsrainer et al. 10 mit Dehnungsmessstreifen Wandler auf Magen, Jejunum und Colon platziert. Der große Vorteil dieser Methode ist, dass Motilitätsstörungen unabhängig und kontinuierlich können in verschiedenen Teilen des Magen-Darm-Trakt im gleichen Tier an aufeinanderfolgenden Tagen geprüft. Jedoch die Produktion von strain-Aufnehmer und die notwendige Operation zu implantieren sie sind aufwendig im Vergleich zur GIT.
In POI, wird die Verbreitung von Darmlähmung wie Magen-Darm-Bereich Wirkung bekannt. 11 Eine frühere Arbeit unserer Gruppe zeigt durch die Verwendung der vorliegenden Verfahren, dass Immunzellen aus intestinal manipuliert Dünndarm zum Dickdarm unmanipulierten verbreiten. 12
Der chirurgische Eingriff sollte in keinem Tod oder schwere Komplikation (wie Blutung oder Peritonitis) führen. Messung von GIT und PMN Infiltrate in ME ganzen Halterungen zeigt, dass IM eine sehr reproduzierbare und machbar Modell POI in Nagetieren induzieren.
Fixation und Myeloperoxidase Färbung muss unmittelbar nach Organentnahme durchgeführt werden. Eine längere Lagerung der Proben in wässrigen Puffer führt zu Elution von Myeloperoxidase aus dem Gewebe.
Messung von Stickoxid ist ein Beispiel meMittler Entlassung aus Organkulturen: Nach wie vor Darm-Manipulation dargestellt führte zu einer Hochregulation von iNOS in Makrophagen der ME führt zu einer übermäßigen Befreiung von NO-und Darm-Motilitätsstörungen 5 Durch die Messung der Konzentration von NO im Überstand von kultivierten ME eine Aussage über die. entzündlichen Ausmaß oder die Wirksamkeit von Therapeutika möglich. Mehrere andere Moleküle (Il-6, TNF-alpha etc) kann leicht in den Überständen des gezüchteten Gewebes werden durch klassische ELISA-oder Multiplex-Ansätze wie Luminex Multiplex Immunoassay 13 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) untersucht.
Zusammenfassend ist ein zuverlässiger und IM wertvolles Modell induzierenden Darmentzündung und anschließende Motilitätsstörungen. Der einfache mechanische Trennung von ME und Tunica mucosa ermöglicht es Forschern, zwischen der Wirkung in beiden Darmwand Fächer, die von großem Interesse ist, da der Darm ME wurde gezeigt, dass ein sehr immunologisch aktiven Gewebes zu unterscheiden. In vivo Analyse GIT und Kolontransitzeit hat als Goldstandard bei der Detektion und Quantifizierung von intestinalen Motilitätsstörungen entwickelt.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) und BONFOR (O-112,0040) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenz / Equipment | Firma | Katalog-Nummer | |
Ethilon 5/0 | Ethicon | 1666H | |
Watteträger | MaiMed | 71010 | |
Arterienkatheter | Vygon | 115-798 | |
96-Well-Platte (schwarz) | Greiner Bio One | 655096 | |
Glaskugel (2 mm Durchmesser) | Worf | auf Anfrage | |
Insect Pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
Hanker Yates Reagent | Polyscience | 560694 | |
Aquatek | Merck | HC109850 | |
DMEM | Lonza | BE12-604 F | |
FITC-Dextran (MW 70000) | Sigma Aldrich | 46.945-500MG-F |
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