Method Article
Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden Aplysia. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.
Es wurde vorgeschlagen, dass Änderungen in intrazellulärem Calcium die Induktion einer Reihe von wichtigen Formen der synaptischen Plastizität (zB homosynaptische Erleichterung) 1 vermitteln. Diese Hypothesen lassen sich durch gleichzeitiges Überwachen von Änderungen der intrazellulären Calcium-und Umbauten in der synaptischen Wirksamkeit getestet werden. Wir zeigen, wie dies durch die Kombination von Calcium-Imaging mit intrazellulären Aufnahme Techniken erreicht werden kann. Unsere Experimente sind in einer bukkalen Ganglienzellen der Mollusken Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat hat eine Reihe von vorteilhaften Merkmalen experimentell: Ganglia leicht aus Aplysia entfernt werden und Experimente verwendet adulten Neuronen, die normale synaptische Verbindungen herzustellen und haben eine normale Ionenkanal Verteilung. Aufgrund der niedrigen Stoffwechsel des Tieres und den relativ niedrigen Temperaturen (14-16 ° C), die natürlich für Aplysia sind, sind die Vorbereitungen für längere Zeit stabil. ent "> Um Änderungen in der intrazellulären freien Calcium wir die Zelle impermeante Version von Calcium Orange 2, die leicht 'geladen' in einem Neuron über Iontophorese ist verwenden. erkennen Wenn diese langwellige Fluoreszenz-Farbstoff bindet an Kalzium, Fluoreszenzintensität steigt. Calcium Orange hat schnelle kinetische Eigenschaften 3 und im Gegensatz ratiometrische Farbstoffe (beispielsweise Fura 2), erfordert keine Filterrad zur Bildgebung. Es ist ziemlich stabil und weniger Foto phototoxische als andere Farbstoffe (zB Fluo-3) 2,4. Wie alle nicht-ratiometrische Farbstoffe, Calcium orange relativen Änderungen der Kalziumkonzentration anzeigt. Aber weil es nicht möglich ist, um Veränderungen in Farbstoffkonzentration durch Belastung und Diffusion, kann es nicht zur absoluten kalibrierten Calciumkonzentrationen bereitzustellen.
Ein aufrechter, feste Phase, zusammengesetzten Mikroskop wurde Bildes Neuronen mit einer CCD-Kamera in der Lage ist die Aufnahme etwa 30 Bildern pro Sekunde verwendet. In Aplysia diese zeitliche Auflösungist mehr als ausreichend, um auch nur einen einzigen Dorn induzierte Veränderung der intrazellulären Calcium-Konzentration zu detektieren. Sharp Elektroden gleichzeitig verwendet zu induzieren und aufzuzeichnen synaptischen Übertragung in identifizierten prä-und postsynaptischen Neuronen. Am Ende eines jeden Prozesses vereint ein benutzerdefiniertes Skript Elektrophysiologie und Bildgebung Daten. Um eine korrekte Synchronisation zu gewährleisten verwenden wir einen Lichtimpuls aus einer LED in den Kamera-Anschluss des Mikroskops montiert. Manipulation von präsynaptischen Kalziumspiegel (zB über intrazelluläre EGTA Injektion) ermöglicht es uns, spezifische Hypothesen über die Rolle der intrazellulären Calcium bei der Vermittlung verschiedener Formen von Plastizität zu testen.
Ein. Vorbereitung
2. Bereiten Elektroden
3. Laden des Calcium-Indikatorfarbstoff
4. Calcium Imaging und elektrophysiologische Recording
5. Analyse von repräsentativen Daten
6. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Die Experimente werden in einem Ganglion Vorbereitung der Aplysia durchgeführt. Veränderungen der intrazellulären Calcium werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der iontophoretisch in das präsynaptische Neuron eingeführt wird abgebildet. Prä-und postsynaptischen Neuronen werden dann mit scharfen Elektroden aufgespießt, so dass die synaptische Übertragung kann induziert und überwacht werden.
Abbildung 2. Calcium imaging und intrazelluläre Aufnahme von identifizierten Neuronen in der bukkalen Ganglion Aplysia. (A) Foto des abgebildeten Seitenarm des Neurons B21. Die Box gibt den gemessenen Bereich von Interesse. (B1) Intrazelluläre Stimulation der B21 erinnert Aktionspotentiale (untere Kurve) und die Erleichterung postsynaptischen Potentiale (PSPs) in der postsynaptischen Follower Neuron B8 (mittlere Spur), was es auch Feuer Aktionspotentiale. Erhöhungen der präsynaptischen Calcium Fluoreszenz sind in der oberen Kurve dargestellt. (B2) Effekt der präsynaptischen EGTA auf homosynaptische Erleichterung. EGTA wurde intrazellulär in B21 ~ 15 Minuten vor intrazelluläre Stimulation injiziert. Es wird vermutet, dass EGTA ein langsam wirkendes Calciumchelator, die bei niedrigen Konzentrationen ist nicht schnell genug auf die synaptische Transmission zu unterdrücken. Beachten Sie die Reduzierung der weit verbreiteten Kalzium-Signal und die entsprechende Abnahme der PSP Amplitude. (C) Die PSP Amplitude korreliert mit der präsynaptischen Calcium Signal. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Wir demonstrieren Techniken, die verwendet werden, um gleichzeitig zu überwachen die intrazelluläre Calciumkonzentration und Beurteilung der Wirksamkeit der synaptischen Übertragung kann. Diese Techniken sind nützlich, um zu bestimmen, wie verschiedene Formen von kurzfristigen Plastizität vermittelt werden.
Das Abbildungssystem wird mit einem Fluoreszenzmikroskop und CCD-Kamera durchgeführt wird. Diese Anforderungen an die Ausrüstung sind relativ bescheiden, wenn die meisten der funktionellen Bildgebung set-ups verglichen. Die Technik ist einfach und leicht zu erlernen. Während Bildgebung mit einer CCD-Kamera ermöglicht die Visualisierung einer großen Fläche mit guter zeitlicher Auflösung, wird die räumliche Auflösung begrenzt. Es ist daher eine nützliche Technik für Testen von Hypothesen über die Rolle der relativ weit verbreitet oder 'Hintergrund' steigt der intrazellulären Calcium. Um die räumliche Auflösung und Dynamik Studie Calcium Stacheln zu verbessern, ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop, oder eine Zwei-Photonen-Mikroskop und das Calcium-Indikator Calcium Green I konntemit nur geringfügigen Änderungen des Protokolls 10 verwendet werden.
Wir haben nichts zu offenbaren.
A PHS Grant (MH51393) unterstützt diese Arbeit. Einige der Aplysia wir werden von den nationalen Ressource für Aplysia der University of Miami unter Grant RR10294 vom National Center for Research Resources, NIH zur Verfügung gestellt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent Name | Firma | Katalog-Nummer | Kommentar |
Calcium orange | Invitrogen | C-3013 | |
EGTA | Sigma | E-4378 | |
Calcium Kalibrierpuffer Kit | Invitrogen | C-3008MP | zum Testen der Empfindlichkeit und den Dynamikbereich des Signals |
Magnesiumchloridhexahydrat | Sigma | M0250 | verwendet in 0,33 M Lösung Tier zu betäuben |
Tabelle 1. Reagenzien verwendet.
Ausrüstung Name | Firma | Kommentar |
FN-1 aufrecht Fluoreszenzmikroskop | Nikon Instruments | mit Narishige ITS-FN1 Bühne |
NMN-21 Manipulatoren | Narishige | montiert auf der Bühne mit Magneten |
CoolSNAP HQ 2-CCD-Kamera | Photometrics | |
NIS Elementen AR (Version 3.22) | Nikon Instruments | Imaging-Software verwendet werden, um Fluoreszenz-Daten zu erfassen |
10X/0.3w Plan Fluor Ziel | Nikon Instruments | Dieses Wasser Immersionslinse hat einen sehr langen Arbeitstag Abstand von 3,5 mm |
X-Cite 120 PC Metallhalogenidlampe | EXFO | verwendet für die Fluoreszenz-Bildgebung |
LS-DWL Halogenlampe | Sumica | |
ET-CY3 Filter-Set | Chroma Technology | ; |
Macht 1401 A / D-Wandler | Cambridge Electronic Design | Probenahme wurde bei 3 kHz getan |
Spike II (Version 7.07) | Cambridge Electronic Design | Software zur Elektrophysiologie Daten erfassen |
SEC-10 LX-Verstärker | NPI-Elektronik | verwendet mit einem 10X Headstage |
Modell 410 Verstärker | Brownlee Präzision | zum Verstärken und Filtern des Signals |
WS-4 | minus k Technologie | Schwingungsisolierung für die Bildgebung |
Kühltisch | Maßarbeit | Messingplatte durch welche Eiswasser mit einer variablen Rate gepumpt |
Tabelle 2. Ausrüstung verwendet.
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