Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Wir beschreiben den Einsatz von ImageStream Technologie ( Www.amnis.com), Verbindet die quantitative Durchflusszytometrie bei gleichzeitiger hoher Auflösung digital imaging, um zelluläre Mechanismen der primären Immunzellen aus gut definierten Patientengruppen zu quantifizieren. Unsere Studien liefern eine Blaupause für translationale Untersuchungen zur Abstammung spezifische zelluläre Reaktionen in kleinen Proben von Kohorten Thema zu quantifizieren.

Individuelle Abweichungen in Immunstatus bestimmen Reaktionen auf Infektionen und zur Schwere der Erkrankung und das Ergebnis. Das Altern ist mit einer erhöhten Anfälligkeit für virale und bakterielle Infektionen assoziiert und verringerte Ansprechbarkeit auf Impfstoffe mit einer gut dokumentierten Rückgang in humorale als auch zellvermittelte Immunreaktionen ^1,2. Wir haben vor kurzem die Auswirkungen der Alterung auf die Toll-like Rezeptoren (TLR), wichtige Bestandteile des angeborenen Immunsystems, die mikrobielle Infektion und Trigger mikrobiellen Abwehr Antworten ³ erkennen beurteilt. In einer großen Kohorte von gesunden menschlichen Spendern, haben wir gezeigt, dass die Monozyten im peripheren Blut von älteren Menschen haben die Expression und Funktion bestimmter TLR ⁴ und ähnlich reduzierte TLR Ebenen und Signalantwort in dendritische Zellen (DCs) verringerte, Antigen-präsentierende Zellen, die entscheidend sind in die Verknüpfung zwischen angeborenen und erworbenen Immunität ^5. Wir haben eine Fehlregulation von TLR3 in Makrophagen gezeigt, eind niedrigere Produktion von IFN durch DCs von älteren Spendern in Reaktion auf eine Infektion mit West-Nil-Virus ^6,7.

Paramount zu unserem Verständnis der Immunoseneszenz und therapeutische Intervention ist ein detailliertes Verständnis der spezifischen Zelltypen reagieren und der Mechanismus (s) der Signaltransduktion. Traditionelle Studien von Immunantworten durch bildgebende von primären Zellen und Vermessung Zellmarker durch FACS oder Immunoblot haben unser Verständnis deutlich, rückte aber diese Studien in der Regel mit technischen Mitteln durch die kleine Stichprobe zur Verfügung stehende Volumen von Patienten und die Unfähigkeit, komplexe Laborverfahren auf mehreren befragen begrenzt humanen Proben. ImageStream kombiniert quantitative Durchflusszytometrie bei gleichzeitiger hoher Auflösung digital imaging und erleichtert somit die Untersuchung in mehreren Zellpopulationen gleichzeitig für eine effiziente Erfassung von Patienten-Anfälligkeit. Hier zeigen wir die Verwendung von ImageStream in DCs zu beurteilen, TLR7 / 8Aktivierung-vermittelten Anstieg der Phosphorylierung und die nukleäre Translokation von einem Schlüssel Transkriptionsfaktors NF-kB, die die Transkription zahlreicher Gene, die für Immunantworten ⁸ initiiert. Mit dieser Technologie haben wir vor kurzem auch eine bisher unbekannte Veränderung TLR5 Signalisierung und der NF-kappaB Signalweg in Monozyten von älteren Spendern, die zu einer veränderten Immunantwort in alternden ⁹ beitragen können, unter Beweis gestellt.

1. Isolierung und Stimulation von Immunzellen

1. Erhalten 10-50 ml heparinisierten Blut von gesunden Freiwilligen nach schriftlicher Einwilligung unter den Richtlinien der lokalen Institutional Review Board. Bei Studien von Alterung oder Pathogenese der Erkrankung, Exklusion und Inklusion Kriterien für jeden Freiwilligen oder Patienten müssen explizit bestimmt werden.
2. Isolieren menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit CPT-Röhrchen oder Ficoll-Paque Plus nach den Anweisungen des Herstellers (GE Healthcare, NJ) und diese durch Experimente am Tag der Isolierung ⁷ (Reagenzien, Tabelle 1).
3. Inkubieren PBMCs (3 × 10 ⁶ / Röhrchen) in 1,5 ml Röhrchen in 0,6 ml Medium allein oder stimuliert mit TLR-Liganden oder andere aktivierende Agenzien, zB TLR7 / 8 Liganden R848 (0,6 ml Medium plus 0,6 ul von 10 mM TLR7 / 8 Liganden R848, Endkonzentration 10 uM) bei 37 ° C für 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LaborEling von Cells

1. Label-Zelllinie und andere Oberflächenmarker auf Live-Zellsuspensionen mit Fluoreszenz-konjugierte Antikörper. Label 3 x 10 ⁶ PBMCs für 20 min bei 4 ° C in 100 l PBS / 2% FBS in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit einem Cocktail von Antikörpern, die für Oberfläche Monozyt oder DC Linien (Tabelle 2). Optimale Antikörper-Verdünnungen können in Vorversuchen und Proben bestimmt werden sollte in Chargen verarbeitet werden, um viel zu viel Variation zu minimieren. Für Anbieter Antikörper Lager von 0,1 mg / ml verwenden 5 ul Antikörper (1:20 Verdünnung). Verwenden Sie einen separaten Schlauch von Zellen mit nur einer einzigen Farbe Konjugat zum Einrichten der Fluoreszenz-Kanäle auf dem Gerät markiert.
2. Nach Oberflächenmarkierung, zu fixieren Zellen in 4% PFA / PBS für 10 min bei RT. Für die Lagerung bis zum Zeitpunkt der Analyse-, Zentrifugen-Zellen bei 500 xg und Resuspendieren Sie die Zellen in dem Gefrierpunkt Puffer (90% FBS mit 10% DMSO) bei -80 ° C bis zum Tag des Assays.
3. Für die Beurteilung, Prozess-Chargen of unbehandelten und stimulierten Zellen aus einer Gruppe von Gebern zusammen, um die Variabilität zu minimieren. Am Tag der Analyse, Auftau-Zellen schnell in 37 ° C warmes Wasserbad, Zentrifuge bei 500 xg, um ein Einfrieren Puffer zu entfernen.
4. Um Zellen für den Nachweis von Zytokinen oder anderen intrazellulären Marker, resuspendieren Zellsuspensionen in 100 ul BD Perm / Waschpuffer (BD Biosciences, NJ) zu permeabilisieren. Gütesiegel für den intrazellulären Signalkomponenten mit zB 1:20 Verdünnung des Kaninchen-Anti-NF-kB (p65)-Antikörper (Endkonzentration 10 ug / ml, Santacruz Biotechnology, CA) für 20 min bei RT, Zentrifuge bei 500 xg, Überstand absaugen und Die Zellen in 100 ul BD Perm / Wash-Puffer, der 1:250 Verdünnung von Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) und Inkubation für 20 min bei RT.
5. Unmittelbar vor der Bildgebung, Gegenfärbung Zellkerne mit DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) oder Propidiumiodid (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. ImageStream Analyse

1. Durchführung von bildgebenden ImageStream auf batched Proben Variabilität zwischen den humanen Proben zu reduzieren. Geräteeinstellungen für die Leistung der Laser waren wie folgt: 200 mW für 488 nm, 10 mW für 658 nm und 250 mW bei 405 nm gemessen.
2. (: Höhe-Verhältnis Breite), um einzelne Zellen (R1) aus Schutt (niedrige Intensität PI) oder Multi-zellulären Ereignissen zu unterscheiden (Um Dateien (Abb. 1), erstens, Tor auf Ereignisse mit normaler und hoher Intensität PI PI Seitenverhältnis analysieren hoher Intensität und geringer PI-Bildformat). Monozyten sind aus dem Gate für CD14-positive Zellen. mDCs innerhalb eines Gate-Zellen, die für hoch sind für CD11c und niedrig für CD4 (R2) als auch niedrigen für Lin-1-Marker (R3).
3. Verwendung IDEAS-Software (Amnis, WA), um eine wirksame quantitatives Maß für den Grad der Aktivierung von jeder Zelle bereitzustellen. Bestimmen Ähnlichkeit (oder Co-Lokalisierung) der zytoplasmatischen Transkriptionsfaktor NF-kappaB mit nuklearen Farbstoff PI bis Translokation in den Zellkern (R4) angeben. Eine hohe Korrelation von NF-κB/PI localisierung in einem hohen Ähnlichkeitsbewertung reflektiert und gibt den Grad der Aktivierung ^10.
4. Vergleichen Sie die Ähnlichkeit Verhältnisse zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen oder Patientengruppen zu relativen Funktionstüchtigkeit der Zellen zeigen. Quantifizieren Sie Daten zwischen den Proben durch statistischen Vergleich der absoluten Werte oder falten Unterschiede. Verwenden Sie IDEAS-Software, um Bilder von Zellen, die aus wichtigen Segmenten der Bevölkerung Histogramme (Abb. 2) anzuzeigen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Wir haben Signalwege in Reaktion auf ein Modell viralen Liganden quantifiziert, indem es PBMCs mit dem TLR7 / 8 Liganden, R848 (Abb. 1). Wir haben sowohl zelluläre Lokalisation Bilder und Bevölkerungsstatistik in unserer Stichprobe Gruppen (Abb. 2). ImageStream ermöglicht es uns, Tor Zelluntergruppen direkt aus PBMCs und Bild-Zell-Antworten von gated, aber unsortierten Zellpopulationen. Hier haben wir den Effekt der TLR s quantifiziertignaling auf nukleäre Lokalisation von NF-kB (p65) in Lin1-, CD4-dim, CD11c + Dendritischen Zellen (mDCs). Zu Beginn der Studie beobachteten wir einen hohen Prozentsatz an unstimulierten Zellen mit dem Transkriptionsfaktor NF-kB (p65) im Zytoplasma. Nach Stimulation, haben behandelten Zellen eine deutlich höhere Ähnlichkeits-Score von NF-B (p65) mit Kernfärbung PI, was darauf hinweist, dass NF-kB (p65) in den Zellkern transloziert nach Stimulation (Median Ähnlichkeit Partituren sind 1,52 und 3,01 bzw. Abb. 2). Ähnliche Ergebnisse sind in TLR5-stimulierten Monocyten ^{9 angegeben.}

Abbildung 1. Färbung und Gating-Strategie, um Effekte der Stimulation auf die menschliche mDCs quantifizieren. Der NF-kappaB-Transkriptionsfaktor reguliert die Expression von zahlreichen Genen des Immunsystems. Diese Studie misst die nukleäre Lokalisation von NF-kB (p65) in mDCs aus je einem Vertreter unterliegen nach TLR7 / 8 Liga ND Stimulation. In-Fokus einzelne Zellen wurden durch Gating auf PI positive Ereignisse mit hohen nuklearen Seitenverhältnissen (R1) identifiziert. mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) waren in gated R3. Nukleäre Lokalisation von NF-kB (p65) wird in R4 dargestellt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. . Translokation von NF-kappaB in mDCs nach Stimulation der Translokation von NF-kB (p65) in den Zellkern nach Stimulation (R4) in Populationen von unbehandelten und stimulierten mDCs abgebildet, wobei die mediane Ähnlichkeits-Score ist 1.52 in der unbehandelten Probe und 3,01 in die angeregte Probe (A). Digitale Bilder gleichzeitig der unbehandelten oder R848-stimulierte Zellpopulationen zeigen repräsentative Zellen gesammelt und die Intensität der NF-B in den Zellkern (B) transloziert._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Die entscheidenden Schritte bei der Verwendung von ImageStream für translationale Studien sind die Auswahl der relevanten Vergleichsgruppen und Optimierung und Validierung von Antikörper-Spezifität. Unterschiede zwischen Fächergruppen in dem markierten Ziel wird leicht ersichtlich sein durch Histogramme und Zellen geben. In Kombination mit einer gründlichen Analyse der Veränderungen in relevanten Rezeptoren und Signalwege, werden diese Daten wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die in spezialisierten Immundysregulation Kohorten zu Grunde liegen können. Die Technik wird durch die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern mit ausreichender Affinität zu relevanten Ziele begrenzt werden. Darüber hinaus ist das Instrument am besten geeignet für eine Multi-User-Einrichtung und die Analyse-Software erfordert eine gewisse Sorgfalt zu beherrschen.

Diese Technologie ist eine leistungsstarke Technik für translationale Untersuchungen menschlicher Krankheiten. Fortschritte in der Genom-Sequenzierung und Array-Technologie ermöglichten Identifizierung von Varianten in m verwickeltalle Krankheiten, aber nur selten zu identifizieren den Mechanismus der Wirkung des Gens nominiert. Unsere Studien liefern eine Blaupause für translationale Untersuchungen in einzelnen Fächern wie der nuklearen an Plasma-Relation von NF-kappaB nach Stimulation. Von einer kleinen Blutprobe, können wir identifizieren, Differential-verarbeitung oder-Signalisierung in einer Linie spezifische Art und Weise bei einem Patienten die eigenen Zellen. Mit dieser Methode haben wir zelluläre Reaktionen in Monozyten von einer großen Kohorte von jungen und älteren Probanden und zeigte Veränderungen im Zell-Signalisierung in alternden ⁹ quantifiziert. ImageStream kann im weiteren Sinne angewendet werden, um wichtige Mechanismen in Zellen, die in zahlreichen Untersuchungen wie Therapie-Responder und Non-Respondern, oder für ein einzelnes Thema vor und nach der Behandlung oder während Streulicht und Remission zu markieren. Mit reichlich Modifikationen möglich für die Wahl des Fächergruppen unter Studie, Zelltypen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, sind die zukünftigen Anwendungen der ImageStream zahlreichen und Schulterwürde erhebliche Fortschritte in vielen Bereichen translationale ermöglichen.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, und die NCRR / GCRC Programm M01-RR00125) unterstützt. Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen und danken Herrn Dr. Mark Shlomchik, Direktor des Yale Cell Sorter Core Facility.