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Hier schlagen wir einfache Methoden, um eine Hypoxie in Zellkulturen und einfache Tests veranlassen, die hypoxischen Zustand der Kulturen zu bewerten.
Hypoxie ist die Reduzierung oder das Fehlen von Sauerstoff in Organe, Gewebe oder Zellen definiert. Dieser Rückgang der Sauerstoffspannung kann durch eine reduzierte Versorgung mit Sauerstoff (Ursachen sind unzureichende Blutgefäß-Netzwerk, defekte Blutgefäß, und Anämie) oder zu einem erhöhten Verbrauch von Sauerstoff im Verhältnis zum Angebot (verursacht durch eine plötzliche höhere Zellteilungsrate) . Hypoxie kann physiologische oder pathologische wie in soliden Tumoren 1-3, rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose usw. ... Jedes Gewebe und Zellen haben eine andere Fähigkeit, sich an diesem neuen Zustand anzupassen. Während Hypoxie, ist Hypoxie-induzierbaren Faktors alpha (HIF) stabilisiert und reguliert verschiedene Gene, wie sie in der Angiogenese oder den Transport von Sauerstoff 4 beteiligt. Die Stabilisierung dieses Proteins ist ein Markenzeichen von Hypoxie, also Erkennen HIF routinemäßig zum Screening auf Hypoxie 5-7 verwendet.
In diesem Artikel schlagen wir zwei einfache Methoden, um eine Hypoxie in Säugetier-Zellkulturen und einfache Tests veranlassen, die hypoxischen Status dieser Zellen zu evaluieren.
1. Hypoxie durch CoCl 2-Lösung induzierte
Cobalt (II)-Chlorid Hexahydrat (CoCl 2 • 6 H 2 O, MG = 237,9) ist eine chemische Induktor von Hypoxie-induzierbaren Faktor-1.3 8. Dieses Produkt ist in Wasser löslich (100 mg / ml), wodurch eine klare, rote Lösung.
Die oben genannten Konzentration arbeitet für die Zell-Linien die wir getestet haben aber jede Zelllinie sollte in verschiedenen Konzentrationen (um eine Dosis-abhängige Kurve zu etablieren) getestet sowie auch in unterschiedlichen Inkubationszeiten um Drogenkriminalität Toxizität zu begrenzen und Optimierung der Assays.
2. Hypoxie in Modular Incubator Chamber induzierten
Notes:
3. Evaluation von Hypoxie
4. Repräsentative Ergebnisse:
In K562-Zellen (humane Leukämie-Zelllinie) kultiviert 2 Tage in geringem Sauerstoffgehalt, im Vergleich zu Normoxie, Hypoxie induziert eine Erhöhung der HIF-1α Protein, das durch Western-Blot (Abbildung 1) erkannt wurde.
Mit HRE-Luciferase modifizierten 293-Zellen (embryonale Nieren-Zelllinie) kultiviert in Hypoxie eine signifikante erhöht wurde von HIF-1α Aktivität in hypoxischen Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 2).
Abbildung 1: Zunahme HIF-1α in hypoxischen Zellen. K562-Zellen wurden in Kultur Normoxie und Hypoxie (Hypoxie-Kammer) für 48 Stunden und analysiert durch Western-Blot mit einem Antikörper, der spezifisch für die HIF-1α. Ein Antikörper, der spezifisch für Aktin wurde für die Be-Kontrolle eingesetzt.
Abbildung 2: HIF-1α Aktivität. HRE-Luciferase modifizierten 293-Zellen in Hypoxie und Normoxie für 48 Stunden kultiviert und anschließend lysiert, um Luciferase-Signal mit Hilfe eines Luciferase-Assay-Kit und einem Luminometer zu erkennen. Die Ergebnisse werden als relative Lumineszenz-Einheit (RLU) angegeben.
Zellproliferation und Lebensfähigkeit in hypoxischen Bedingungen variieren stark in Abhängigkeit von der Zelltypen. Daher sollten Sie die Zelle oder die Nummer der Kulturen Platten starten Sie mit, damit Sie genügend Zellen / Proteine für Ihre Experimente haben.
Kobaltchlorid-Methode hat den Vorteil, kostengünstig und schnell. Dieses Produkt imitiert Hypoxie durch Induktion HIF-1/3α können aber auch andere Gene regulieren, stellen Sie sicher, dass dieses Produkt für Ihr Projekt wird durch die Überprüfung, was andere Effekte könnte auf die Funktion und Phänotyp der bestimmte Zellen unabhängig sind von der "Mimik-adaptierten hypoxischen "-Effekt. Ein weiteres Medikament auch zur Hypoxie nachahmen ist Deferoxamin Mesylat (DFO, verwendet bei 100 uM Endkonzentration). Der Einsatz dieser Medikamente kann der Experimentator die Kultur Platte / Schale / Kolben mehrmals ohne Beeinträchtigung der "hypoxischen Zustand" zu öffnen.
Der Gehalt an Sauerstoff in dem Gasgemisch enthalten ist, kann abhängig von Ihren Experimenten und Zelltypen als Hypoxie-Werte in Abhängigkeit von der Gewebe-und Zelltypen variieren. Tatsächlich sind einige Zellen in 5% hypoxische O 2 andere brauchen weniger als 1% O 2 bis hypoxisch sein. 5% CO 2, das Gasgemisch wird hinzugefügt, um den pH-Wert der Kulturen zu stabilisieren, ist der Rest des Gases in der Regel Stickstoff.
Hypoxische Kammern haben den Vorteil, nicht mit Medikamenten, die das Verhalten der Zelle wechseln kann unabhängig von der Sauerstoff-Partialdruck. Allerdings können nicht alle Arten von Experimenten durchgeführt, wie Sauerstoff wieder in die Kammer bei jeder Öffnung und damit verringert Hypoxie werden. Sie sollten diesen Faktor in Ihrer Experimente betrachten, Hypoxie / re-Oxygenierung ist eine bestimmte Bedingung, dass einige Zelltypen beeinflussen können. Eine Alternative ist die Hypoxie-Workstations (verbunden mit vorgemischten Gas-Tanks oder Gas Mischsysteme) oder größer Hypoxie Inkubator (Hypoxie Verarbeitung Kammer mit Handschuhfach), dass die Experimente zu den Medien zu ändern und zu manipulieren Zellen in kontinuierlichen hypoxische Umgebung ermöglicht den Einsatz. Verschiedene hypoxischen Kammern haben in den vergangenen zehn Jahren kommerzialisiert worden und sollte nach Ihrem Labor eingesetzt, Projekte, Raum, Größe und Budget gewählt werden. Achten Sie immer darauf den guten Zweck und Bedingung für die Kammer zu korrigieren Kultur zu garantieren. Im Allgemeinen, wenn Sie eine Kammer, kann der Grad der Hypoxie moduliert werden, indem Sie die verschiedenen Gasgemischen (dh 1%, 5% 10% Sauerstoff).
In Bezug auf den Nachweis von HIF-1α, ist es wichtig zu wissen, dass einige Krebszellen line express HIF-1α in Normoxie. Es ist daher entscheidend für eine Normoxie-Steuerelement verwenden, um das Grundniveau von HIF in diesen Zelllinien zu bestimmen. HIF-1α kann auch in Normoxie bei nicht-malignen Zellen nach Zell-Stimulation oder Stress. Dies könnte auch auftreten, wenn diese Zellen verhungert sind sicher, dass Ihr Zellkulturen richtig ernähren und unterhalten.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
---|---|---|---|
Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 | |
Cobalt (II)-Chlorid | Sigma | C8661-25G | |
Incubator Kammer | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
HRE-Luciferase-Plasmid | Adgene | Plasmid 26731 |
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