Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Die Homöostase aller selbst erneuernden Geweben ist abhängig von adulten Stammzellen. Als undifferenzierte Stammzellen asymmetrische Teilungen durchlaufen, erzeugen sie Tochterzellen, dass die Stammzellen Phänotyp und Transit-Verstärkung Zellen (TA-Zellen), die aus der Stammzell-Nische zu migrieren, zu unterziehen schnelle Verbreitung und terminal zu differenzieren, um das Gewebe besiedeln zu behalten.

Epitheliale Stammzellen in der Epidermis, Haarfollikel und Darm wurden als Zellen mit einem hohen In-vitro-proliferative Potential und so langsam-cycling-Label-Beibehaltung Zellen in vivo ^1-3;. Adult-, Gewebe-spezifische Stammzellen sind verantwortlich für die Regeneration der Gewebe, in denen sie während des normalen physiologischen Umsatz als auch in Zeiten von Stress ^4-5 befinden. Darüber hinaus sind Stammzellen allgemein als multi-potent, besitzen die Fähigkeit, die zu verschiedenen Zelltypen geben innerhalb der Gewebe ^6. Zum Beispiel kann Nagetier Haarfollikelstammzellen generieren Epidermis, Talgdrüsen und Haarfollikel ^7-9. Wir haben gezeigt, dass Stammzellen aus dem menschlichen Haarfollikel Wulstregion multi-Potential ¹⁰ weisen.

Stammzellen haben sich zu einem wertvollen Werkzeug in der biomedizinischen Forschung, die aufgrund ihrer Nützlichkeit als in vitro-System für das Studium der Entwicklungsbiologie, Differenzierung, Tumorentstehung und ihre möglichen therapeutischen Nutzen. Es ist wahrscheinlich, dass adulte epithelialen Stammzellen werden in der Behandlung von Krankheiten wie ektodermale Dysplasien, Monilethrix, Netherton-Syndrom, Menkes Krankheit erblich Epidermolysis bullosa und Alopezien ^11-13 nützlich. Darüber hinaus werden andere Hautprobleme wie Brandwunden, chronische Wunden und Geschwüre aus Stammzellen verwandte Therapien ^14,15 profitieren. Angesichts des Potenzials für Reprogrammierung von adulten Zellen in einen pluripotenten Zustand (iPS-Zellen) ^16,17, kann die leicht zugänglich und erweiterbar adulten Stammzellen in der menschlichen Haut eine wertvolle Quelle von Zellen für die Induktion und Downstream-Therapie für ein breites Spektrum von Krankheiten, einschließlich bieten Diabetes und Parkinson-Krankheit.

1. Auszug epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

1. Vor dem Start des Verfahrens zur Isolierung von epithelialen Stammzellen muss man die jeweiligen Medien und Reagenzien (siehe Tabelle 1) vorzubereiten.
2. Frische erwachsenen Menschen Kopfhaut ab Facelift Verfahren oder Stanzbiopsie erfasst werden, dann in DMEM / 10% FBS / Dispase (4 mg / ml) über Nacht bei 4 ° C inkubieren Inkubation für 2-4 h bei 37 ° C ist auch wirksam. Hautstücke sollten eine maximale Breite von 1 cm bis zum Enzym zu durchdringen zu ermöglichen.
3. Übertragen Sie die Haut in einem sterilisierten Petrischale, ziehen Sie jedes einzelne Haar von der Haut durch Ergreifen des Haares in der Nähe der Hautoberfläche und zieht fest und glatt. Wählen Follikel Telogen Bühne, auf ihre Morphologie unter einem Binokular auf, schneiden Sie die Ausbuchtung Region (Abbildung 1A) übertragen Follikel in einen 15 mL sterilisiert Röhre. Anagen Follikel kann auch verwendet werden, wenn Schnitt am oberen 1 / 3 der Follikel Haarfollikel "Bulge"-Region (Abbildung 1B) erhalten werden.
4. Inkubieren der isolierten Follikel Fragmente in einer Mischung aus 0,05% Trypsin-EDTA (GIBCO) und Versene (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (1:1) für 15-20 min bei Raumtemperatur unter Schütteln in regelmäßigen Abständen, 4 ml DMEM + 10 % FBS zu stoppen Reaktion, Spin Down für 5 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Alternativ können Follikelgewebe Fragment Explantate in Kultur ohne Trypsin verdaut werden zur Kultivierung von Zellen aus einzelnen Follikel platziert.
5. Überstand vorsichtig (save ~ 0,2-0,5 ml zu verlieren Zellen) und in 1 mL KCM (Keratinozytenmedium), ohne EGF resuspendieren.

2. Kultur Primary epithelialen Stammzellen

1. Bevor die Kultivierung der epithelialen Stammzellen, Mitomycin C-behandelten 3T3-J2-Zellen (Feeder-Zellen) wie folgt zubereitet werden sollte. 3T3-J2-Zellen werden in DMEM mit 10% FBS vor der Behandlung kultiviert. Entfernen Kulturmedien und waschen Zelle zweimal mit PBS, behandeln Zelle mit 15μg / ml Mitomycin C in DMEM ohne Serum für 2 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2. Entfernen Sie die Mitomycin C-haltige DMEM zwei Waschgänge mit PBS werden die Zellen sofort einsatzbereit. (Mitomycin C-behandelten 3T3-J2-Zellen können auch vorher vorbereitet werden und bei -80 ° C auftauen und Saatgut die Zellen einen Tag vor Kultivierung primärer epithelialen Stammzellen, bei 37 ° C, 5% CO _2. 150.000-200.000 3T3-J2 Zellen pro Vertiefung der 6-Well-Platte wird empfohlen.
2. Seed isoliert Haarfollikel Stammzellen aus Schritt 1.5 auf Mitomycin 3T3-J2-Zellen in KCM ohne EGF über Nacht bei 37 C-behandelten ° C, 5% CO _2, wechselte er zur EGF-haltigen KCM am nächsten Tag. Die Zellen werden bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO _2. Alle Keratinozyten werden mit KCM mit EGF zugeführt alle 2 Tage gewachsen und für 14-20 Tage. Überprüfen Zelle täglich unter dem Mikroskop. Haarfollikelstammzellen bilden Kolonien (Abbildung 2A). Haarfollikel Explantate wird Auswüchse nach 10-14 Tagen (Abbildung 2B) zu bilden.

3. Passage epithelialen Stammzellen

1. Wash-Zellen mit PBS einmal. Entfernen 3T3-J2 Feeder-Zellen durch Versene (auf RT vorgewärmt) Behandlung. Inkubieren Kultur aufgetischt in Versene für 5 Minuten, dann schütteln und absaugen Feeder-Zellen.
2. Wash Haarfollikelstammzellen entweder mit Versene oder PBS einmal.
3. Add vorgewärmten (37 ° C, kritisch) Trypsin-EDTA (2X) und bei 37 ° C für 7 Minuten oder länger, wenn dies für die Haarfollikel Stammzellen zu lösen. Nicht länger als 15 Minuten am besten ist.
4. Add KCM w / o EGF, um das Trypsin zu stoppen, sanft Pipette auf und ab, um Zellen zu zerstreuen, Spin-Down bei 200g, 5 Minuten.
5. Re-suspend-Zellen mit KCM ohne EGF, Graf und re-Platte auf Mitomycin C-behandelten 3T3-J2-Zellen-Schicht.

4. Verewigen epithelialen Stammzellen

Primäre Zellen, auch adulte Stammzellen, zu erreichen Seneszenz nach serieller Passage und Monate in Kultur. Immortalisierung von primären Stammzellen ist ein effektiver Weg, um dieses Problem zu lindern.

1. Platte primären epithelialen Stammzellen (~ 350.000 Zellen / Well von 6-Well-Platte) bei Passage 1 auf Feeder-Schicht (3T3-J2) und Kultur für 2 Tage.
2. Kultur PA317 LXSN 16E6E7 Zelllinie einen Tag nach der Aussaat der primären epithelialen Stammzellen mit DMEM mit 10% FBS. (Diese Linie stellt die amphotrope Retrovirus LXSN16E6E7 die HPV16 E6 und E7 offene Leserahmen kodiert, und die kann verwendet werden, um stabil zu infizieren und zu verewigen vielen Zelltypen werden).
3. Gönnen PA317 LXSN 16E6E7 Zelllinie mit Mitomycin C für 2 Stunden (Same-Protokoll mit 3T3-J2-Zellen). Add Mitomycin C behandelt PA317 LXSN 16E6E7 Zelllinie zur primären epithelialen Stammzellen, Co-Kultur für 6 Tage in KCM mit EGF. Renew frischen KCM mit EGF Medien alle 2 Tage.
4. Entfernen 3T3-J2 und PA317 LXSN 16E6E7 Zelle mit Versene. Add Mitomycin-C behandelt 3T3-J2 NHP-Zellen (Neomycin, Hygromycin, Puromycin resistenter, ~ 200.000 Zellen pro Well), die epithelialen Stammzellen. Die Zellen werden unter 0,2 mg / ml G418 (Gibco) für zusätzliche ausgewähltitional 6 Tage. Renew frischen G418 mit KCM mit EGF Medien alle 2 Tage.
   Surviving epithelialen Stammzellen Stammzellen verewigt werden. Ein gut von primären epithelialen Stammzellen, die nicht mit PA317 LXSN 16E6E7 Zelle co-kultiviert als Kontrolle für G418 Auswahl sollte eingestellt werden, sollten alle Zellen in diesem gut G418 nach 6 Tagen Auswahl getötet werden.

5. Repräsentative Ergebnisse

Frühe Passage der Haut epithelialen Stammzellen und verewigt epithelialen Stammzellen bilden dichte Kolonien, bestehend aus kleinen Keratinozyten (Abbildung 2A) von Feeder-Zellen umgeben. Wenn in serumfreiem Medium mit definierten Ergänzungen kultiviert, ohne Feeder-Schicht werden die Stammzellen zerstreuen und bilden keine dichte Kolonien (sie wachsen als einzelne Zellen und kleine Cluster). Immortalized epithelialen Stammzellen eine stabile Phänotyp für> 12 Monate kontinuierlicher Übergang, sondern eher enger Kolonien als die primären Zellen zu bilden. Sie bilden keine Verankerung unabhängigen Kolonien in Soft-Agar-Assays, was darauf hinweist, dass diese immortalisierten Zellen besitzen nicht die Eigenschaften der Krebszellen. Beide primären und immortalisierten epithelialen Stammzellen ausdrückliche Haarfollikel Stammzellen Cytokeratin 15 (3A), und können in epidermale, Haarfollikel und Talgdrüsen Linien (Abb. 3B-D) zu unterscheiden.

Abbildung 1. Gerupft Haare. Nach dem Rupfen aus Dispase-behandelte Haut erscheinen Haarfollikel entweder als Telogen Club Haaren (A) mit einer Kugel von Zellen umgebenden Boden der Haare oder Anagenhaare (B) mit einer Hülse aus Epithel um die Länge der Haare. Das Telogen Wulstregion bildet eine deutliche morphologische Region zu Mikro-sezieren, während der Anagen Ausbuchtung ist weniger ausgeprägt. Die Anagenphase Birne enthält Matrixkeratinozyten, was Transit-Verstärkung Zellen, die auch isoliert und kultiviert werden können.

Abbildung 2. Stammzellen Kulturen. (A) Epitheliale Stammzellen aus der Haut bilden feste epithelialen Kolonien (durch E), wenn in KCM mit einem Feeder-Schicht von Zellen (gekennzeichnet durch F) kultiviert. (B) Haarfollikel Explantate Anlass zu epithelialen Auswüchse. Das Telogen Wulstregion (gekennzeichnet durch T) ist es, die Schüssel angeschlossen und umgeben Epithelzelle Kolonie zusammen mit Feeder-Zellen.

Abbildung 3. Stammzell-Differenzierung. (A) Stammzellen Kolonien zu halten Expression von epithelialen Markern wie Zytokeratin 15. (B) Skin epithelialen Stammzellen können entlang der Haarfollikel Linie durch K6Hf Ausdruck bestimmt unterschieden werden. (C) Die Zellen können auf de-epidermalized Dermis oder anderen Matrices an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche kultiviert werden und wird eine geschichtete Epidermis mit Hornschicht, körnige Schicht und Dorn-Schicht zu bilden. (D) Stammzellen können entlang der Talgdrüsen Linie mit Oil Red positive Globuli induziert werden.

Die Zelle Extraktion und Kultur Methoden beschrieben sind überraschend leicht und reproduzierbar. Wir haben epithelialen Stammzellen in Zellkulturen von Dutzenden von Menschen in einer breiten Altersspanne, einschließlich Patienten mit angeborenen Hautdefekte ¹⁸ erzeugt wird. Am besten ist es, den Prozess auf den Tag des Gewebes Ernte zu beginnen, jedoch Zellen bleiben in den Medien auf Eis tragfähig für mehrere Tage, die Erleichterung versand, wenn nötig. Ausrangierte Facelift Haut liefert Hunderte von lebensfähigen Follikel für die Zell-Extraktion als Einzel-Zellsuspensionen. Für weitere begrenzte Gewebe, wie aus einer Stanzbiopsie der Kopfhaut, kann Explantation Kulturen effektiver sein, da es nur wenig Möglichkeiten für die Zell-Verlust in Trypsinierung und Zentrifugation. Für Explantation Kulturen ist der wichtigste Aspekt Befestigung des Gewebes Fragment in die Schale. Die Zugabe von geringen Mengen von Medien nur für das Gewebe und minimaler Manipulation wird empfohlen, bis Auswüchse in 10-14 Tagen erscheinen.

Adult epithelialen Stammzellen aus der Haut könnte eine breite Anwendung. Kultivierten Hautzellen sind bereits in der klinischen Anwendung für Patienten mit Verbrennungen und chronischen Wunden. Die Herausforderung besteht nun hat sich die Schaffung einer besseren Hautäquivalents mit Schweißdrüsen und Haare. Die potenzielle Nutzung von Haut-Stammzellen für die Regeneration der Haare ist aufregende Möglichkeit.

Wie bereits erwähnt, stellt die Fähigkeit, eine primitive pluripotenten Zustand in adulten Zellen induzieren einen signifikanten Fortschritt für potenzielle zellbasierte Therapien ohne die Verwendung von embryonalen Stammzellen ^16,17. Allerdings ist der Prozess, ineffizienten und möglicherweise onkogenen, da virale Vektoren verwendet werden, um die Expression von Stammzell-Genen zu induzieren. Wenn man beginnt mit einer adulten Stammzellen Bevölkerung, kann es einer deutlichen Steigerung der Effizienz und vermeiden den Bedarf an stabilen virale Transfektionen zu induzieren Pluripotenz. Die Transplantation von Knochenmark-Stammzellen als eine Zelle Ansatz verwendet worden, um schwere Hauterkrankungen wie Epidermolysis bullosa behandeln. ^19,20 In Ergänzung, Berichtigung der Kollagen-7 Defekt Epidermolysis bullosa in Patienten Keratinozyten wurde in vitro erreicht. ²¹ Isolierung von epithelialen Stammzellen aus einer Hautbiopsie kann Ressourcen bereitstellen, um auf dieser früheren Arbeit erweitern und entwickeln individuelle Zelltherapien mit autologen Zellen.

Es ist interessant, dass die Haarfollikel Ausbuchtung Region ist auch die Website von anderen adulten Stammzellen / Vorläuferzellen Zellpools. Xu et al. ²² hat multipotenten mesenchymalen Stammzellen aus dieser Region identifiziert. Melanozyten Vorläufer auch in den Haaren Wulst ²³ befinden. So können die Haarfollikel Isolation hier vorgestellte Methode leicht angepasst, um diese anderen Zelltypen für weitere Experimente zu isolieren.

Diese Arbeit wird durch NIH / NCI gewähren R01CA-118916 gefördert