Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

Um Neuralleiste Stammzellen (NCSC) in vitro zu kultivieren, ist ein spezielles Medium (NCSCM) erforderlich. Wesentlicher Bestandteil der NCSCM ist Hühnerembryo-Extrakt (CEE). Wir beschreiben hier genaue Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE, einschließlich Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration zu produzieren.

Die Neuralleiste ergibt sich aus der Neuro-Ektoderm während der Embryogenese und besteht nur vorübergehend. Frühe Experimente bereits geprüften pluripotenten Vorläuferzellen zu einem integralen Bestandteil der Neuralleiste ¹ sein. Phänotypisch sind Neuralleiste Stammzellen (NCSC) durch die simultane Expression p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) und SOX10 während ihrer Wanderung von der Neuralleiste ^2,3,4,5 definiert. Diese Vorläuferzellen können in glatten Muskelzellen, chromaffinen Zellen, Neuronen und Gliazellen, sowie Melanozyten, Knorpel und Knochen ^6,7,8,9 unterscheiden. Zu kultivieren NCSC in vitro, eine besondere Neuralleiste Stammzellen Medium (NCSCM) ist ¹⁰ erforderlich. Der komplexeste Teil des NCSCM ist die Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt (CEE) vertreten eine wesentliche Quelle von Wachstumsfaktoren für die NCSC sowie für andere Arten von neuronalen Explantaten. Andere NCSCM Zutaten neben CEE sind im Handel erhältlich. Producing CCE mit Labor-Grundausstattung ist es von großer Bedeutung, um über die schwierigen Details wie die Isolierung, Mazeration, Zentrifugation und Filtration Prozesse kennen. In diesem Protokoll beschreiben wir genauer Techniken, um eine maximale Menge an reinem und hochwertigem CEE produzieren.

Die Autoren stellen fest, dass Tierversuche in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie (86/609/EWG) durchgeführt wurden, nach den Richtlinien der NIH zur Pflege und Verwendung von Tieren für experimentelle Verfahren und den Regularien der Institutional Tiere gesetzt Pflege und Nutzung Committee (IACUC) an der Universität Duisburg-Essen (Deutschland).

Teil 1: Einrichten (nicht auf Video gezeigt)

Vorbereitung von Materialien und Lösungen (vor der Einnahme der Eier aus dem Inkubator)

• Eier haben, um in einem befeuchteten Inkubator für 11 Tage bei 37 ° C (100 ° F).
• 70% Ethanol-Spray, saubere Platten, präzise sauberen Pinzette, 4 ° C (40 ° F) kalte sterile DMEM auf Eis und 60 ml sterilen Spritzen
• 50 ml Sterile Corning Rohre müssen mit 4 halbgefüllten ° C kalten DMEM der mazeriert Embryonen bei einem Verhältnis von 1:1 (mazeriert Masse: DMEM) mischen. Sobald die Eier außerhalb des Inkubators Dissektion der Hühnerembryonen ergriffen hat, um gestartet werden.
• Sterilisieren Dissektion Werkzeuge im Autoklaven oder am Tag der Dissektion, tauchen die Werkzeuge in 70% Ethanol für 20 Minuten.

Teil 2: Präparation der Hühnerembryonen (gezeigt auf Video)

1. Wet den bebrüteten Eiern mit 70% Ethanol-Spray für mindestens 30 Sekunden und trocknen Sie sie sorgfältig mit einem sauberen weichen Papiertüchern zwar nicht Schütteln der Eier nicht übermäßig.
   Hinweis: Wir empfehlen nicht sezieren mehr als 60 Hühnerembryonen gleichzeitig.
2. Öffnen Sie die Eier vorsichtig von schneidigen gegen eine scharfe Kante und nehmen Sie den Embryo mit Vorsicht nicht die Zerstörung der Dottersack oder der Hühnerembryo sich.
3. Suchen Sie nach dem Beginn der Nabelschnur schnell und öffnen Sie die klare Verpackung ohne Zerstörung der Dottersack oder kleinen Gefäßen. Dann sezieren die Nabelschnur mit präzisen sauberen Pinzette.
4. Nehmen Sie den Embryo aus dem Dottersack.
   Hinweis: Die Embryonen sollten schnell enthauptet werden (nicht im Video gezeigt).
5. Sammeln Sie die Embryonen in Minimal Essential Medium bei 4 ° C.

Teil 3: Mazeration der Hühnerembryonen

1. Nehmen Sie den Kolben aus einer 60 mL sterile Spritze aufziehen.
2. Transfer ca. 10 Embryonen in einer 60 ml Spritze.
3. Setzen Sie die Kolben vorsichtig zurück in die Spritze, um nicht zu riskieren mazeriert Material.
4. Mazerat durch Herunterdrücken des Kolbens.
5. Sammeln Sie die mazeriert Masse in die vorbereitete Corning Rohre mit DMEM bei einem Verhältnis von 1:1 (mazeriert Masse: DMEM) zur Hälfte gefüllt. Mit 10 Embryonen ein Volumen von etwa 25 mL hergestellt wird.
6. Legen Sie die Mischung auf einem Schüttler für 45 min bei 4 ° C.

Teil 4: Zentrifugation der Hühnerembryo - DMEM Suspension

1. Übertragen Sie die Hühnerembryo - DMEM Suspension in die Zentrifugenröhrchen.
2. Add sterile Hyaluronidase in einer Konzentration von 1 mg pro 25 mg des Embryos.
3. Tare die Zentrifugenröhrchen sehr genau.
   Hinweis: Dieser Schritt sollte mit Vorsicht durchgeführt werden, wie Zentrifugation bei sehr hohen g-force und Schäden materieller oder Zentrifuge kann auftreten, wenn mit unausgeglichenen Rohren ausgeführt wird. Mit einer hohen Genauigkeit Waage nach zu den drei Nachkommastellen für alle Röhren durch eine Anpassung der fehlende Betrag mit DMEM empfangen werden soll.
4. Reduzieren Sie die Temperatur der Zentrifuge auf 4 ° C.
   Hinweis: Auch die Zentrifugation Rotor sollte in einer Kühlkammer oder Kühlschrank über Nacht aufbewahrt werden.
5. Centrifuge 6 Stunden mindestens für 180.000 xgx h. Hinweis: Für bessere Ergebnisse in Bezug auf die Trennung der einzelnen Phasen zu verwenden 266,000 xgx h. Wenn möglich, verwenden Sie das Vakuum Anpassung.

Teil 5: Filtration des Hühnerembryo-Extrakt

Nach der Zentrifugation können drei Phasen zu beachten: Die obere schmuddeligen flüssigen Phase mit Fett-Fragmente, die klare flüssige Phase in der Mitte und das Pellet am Boden der Zentrifugenröhrchen. Hinweis: Schütteln oder rege Bewegung der zentrifugierten Mischung muss strikt zu vermeiden, da dies das Ergebnis der Zentrifugationsschritt durch den Verlust des klaren zentralen flüssigen Phase zu zerstören.

Hinweis: Alle folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen mit einem laminaren Luftstrom Bank durchgeführt werden:

1. Pipette die klare flüssige Phase in ein Filtersystem mit Poren von 0,45 um. Dann auf dem angeschlossenen Vakuumpumpe einschalten.
   Hinweis: Berühren Sie nicht die Pellet am Boden. Dies würde zu einer Verunreinigung des Extraktes und ein Verstopfen des Filters Systems führen.
2. Übertragen Sie die Pre-Extrakt in einen Filter mit Poren von 0,22 um und schalten Sie die angeschlossenen Vakuumpumpe wieder.
3. Aliquot der erzielten Hühnerembryo-Extraktin sterile 15 mL Corning Röhren.
4. Schnell speichern Sie die Aliquots bei -80 ° C (-62 ° F). Hinweis: Die CEE dauern bis zu zwei Jahren, wenn bei -80 ° C.

Dieses Protokoll basiert auf Modifikationen der Verfahren, die in den letzten ^10,11 beschrieben worden sind, basiert. Zusätzlich zu früheren Veröffentlichungen haben wir hier zeigen die einzelnen unterschiedlichen Schritte des Prozesses mehr ausgeweitet. Dies unterstützt den Experimentator mit den wichtigsten Daten sichern richtige Verfahren und zuverlässige Ergebnisse. Ferner ist, wie die Zerlegung Prozess ist ein wesentlicher Bestandteil der CEE-Extraktion beschreiben wir das Verfahren der Aufnahme der Embryonen aus dem Dottersack in jedem Detail. Es gibt einige wichtige Punkte zu beachten wie unten diskutiert.

Die Präparation der Hühnerembryonen sollte so bald wie möglich begonnen werden nach der Inkubation wurde beendet. Embryonen tot vor Dissektion sollte nicht für alle Schritte dieses Protokoll als enzymatische Aktivierung und Proteinabbau verwendet werden könnte das Ergebnis negativ beeinflussen.

Bevor Sie beginnen einige Hand-on-Training sollte als alle Schritte der Zerlegung durchgeführt werden müssen, um sich schnell und präzise durchgeführt werden. Es ist für den Erfolg des gesamten Verfahrens wichtig, um die Kontamination mit Eigelb, das durch eine bemerkenswerte Menge von negativ beeinträchtigen Proteine ​​begleitet wurde zu vermeiden. Nach der Embryonen wurden aus dem Dotter Säcke genommen sollten sie schnell enthauptet werden (nicht im Video gezeigt).

Temperatur sowie Schnelligkeit des Rotors sind sehr wichtig. Um enzymatische Aktivierung und eine Reduktion der Qualität und Quantität der Faktoren für die NCSCM benötigt vermeiden die Temperatur der Zentrifuge und der Rotor auf 4 ° C abgesenkt werden Nach dem Zentrifugationsschritt die klare zentrale flüssigen Phase ist die wichtige Voraussetzung Auszug mit den wesentlichen Wachstumsfaktoren für die NCSCM. Um eine erhebliche Trennung der verschiedenen Fraktionen und eine Bereicherung der Faktoren erforderlich, empfehlen wir eine Geschwindigkeit von nicht weniger als 180.000 xgx h.

Da der Unterschied in der Dichte zwischen dem klaren flüssigen Phase und der schmuddeligen flüssigen Phase an der Spitze der Zentrifugenröhrchen nicht verhindern, dass ein Remixen der beiden Teile jedes Schütteln ist zu vermeiden. Die Komponenten des schmuddeligen flüssige Phase kann nicht durch ein 0,45 um-Filter-System gefiltert werden, da die fetten Teile davon schon sehr bald zu einem Verstopfen des Filters Systems führen. Auch das Pellet am Boden der Zentrifuge sollte überhaupt nicht berührt werden, da Teile davon an der Filteranlage Verstopfungen führen würde.

In einem letzten Schritt das Potenzial der CEE für den Anbau von NCSCs muss validiert werden. Diese multipotent transiente Population von Stammzellen verliert seine Lebensfähigkeit schnell in den Medien, ohne hinzugefügt ausreichend produziert CEE. Daher ist eine transgene Maus-Linie (JoMa1), die Anfang NCSC Marker drückt in ein Transgen-Aktivität abhängigen Art und Weise und wird verwendet, um NCSC Biologie zu studieren ist in jeder neu gewonnene Höhe von CEE ¹⁰ angebaut. Die erfolgreiche Kultivierung von NCSCs stellt eine angemessene Validierung der CEE.

Die Unterstützung und Beratung von Markus Pajtler und Robert Bohrer waren von unschätzbarem Wert für die Visualisierung dieses Protokolls.