Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann.

Lung ursprüngliche Spezifikation sowie Verzweigung Morphogenese und die Bildung von verschiedenen Lungenerkrankungen Zelllinien erfordert eine spezifische Wechselwirkung der Lunge Entoderm mit seinen umliegenden Mesenchym und Mesothel. Lung Mesenchym hat sich gezeigt, dass die Quelle der induktive Signale für Lungen-Verzweigung Morphogenese werden. Epithelial-mesenchymale-mesothelial Wechselwirkungen sind auch entscheidend für die embryonale Lunge Morphogenese. Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann (in der Abwesenheit der Mutter beeinflusst und die Durchblutung). Noch wichtiger ist diese Technik kann leicht in einer serumless, chemisch definierten Kulturmedien erfolgen. Gewinn und Verlust der Funktion kann mit Hilfe exprimierten Proteine, rekombinante virale Vektoren und / oder Analyse von transgenen Maus-Stämme, Antisense-RNA, sowie RNA-Interferenz-Gen Knockdown werden.

Orgel Kultur ist eine sehr nützliche und vielseitige Technik zur Gen-und Proteinexpression zu untersuchen. Diese ex vivo Kultur Methoden können als Vor-oder in Ergänzung zu den in-vivo-Studien verwendet werden.

1. Embryonale Lung Isolation

1. Timed-trächtigen Mäusen auf postcoitum Tag 11,5 oder 12,5 (E11.5-12.5) von CO ₂ Narkose nach dem NIH und OLAW Richtlinien geopfert. Das Tier ist in einer Kammer platziert und 100% CO ₂ wird eingeführt. Nachdem das Tier bewusstlos ist der CO _2-Strom wird erhöht. Klinische Tod des Tieres muss gewährleistet sein.
2. Alle folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank abgeschlossen sein. Die Gebärmutter ist von der trächtigen Weibchen entfernt. Zum Entfernen der Gebärmutter aus dem Tierreich sind die trächtigen Weibchen auf den Rücken gelegt und versprüht mit 70% Ethanol. Ein Schnitt in der Bauchdecke, und die Haut wird durch Ziehen der Haut nach oben, während das Tier Hinterbeine entfernt. Die Bauchhöhle wird geöffnet und die Gebärmutter ist aus dem Tier entfernt.
3. Das Blut wird durch Platzierung der Gebärmutter in einer 50 ml konische Röhrchen mit kaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt gespült, und das Rohr ist leicht für 2 Minuten rockten.
4. Die Gebärmutter wird dann in einer Petrischale unter dem stereoskopischen Präpariermikroskop gelegt, und die Embryonen aus der Gebärmutter durch Einschneiden der Gebärmutterwand mit Feder Schere freigegeben. Die Embryonen werden geerntet mit einem perforierten Löffel, und auf Eis in eine neue Petrischale mit HBSS.
5. Unter dem stereoskopischen Präpariermikroskop, sind embryonale Lunge eins nach dem anderen in eine Petrischale mit kaltem HBSS (Abbildung 1) zerlegt.
6. Die isolierten embryonalen Lunge ist auf Eis in eine Petrischale mit HBSS mit einer sterilen Transferpipette platziert.

2. Embryonale Lung Kultur

1. 500 Mikroliter bis 1 Milliliter pro Vertiefung D-MEM/F-12 mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin ergänzt ist in einem Nunclon Polystyrol Gericht aufgenommen.
2. Ein Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran ist auf der Oberseite der Medien gelegt. Wenn die Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran auf der Oberseite des Media platziert wird, stellen Sie sicher, dass die glänzende Seite gegen die Medien und raue Seite nach oben zeigt ist.
3. Ein seziert embryonalen Lunge ist auf der Oberseite des Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran mit einer sterilen Transferpipette platziert.
4. Die embryonalen Lungen-Position wird mit Hilfe der Zange. Embryonale Lunge auf dem Filter gesetzt haben sollte eine intakte Luftröhre und ihre Luftröhre mit einer geraden Position gebracht werden, so dass alle Lunge zu den gleichen Innendruck haben.
5. Die Nunclon Polystyrol Gericht ist für die gewünschte Kultur Uhrzeit in eine Zelle Inkubator (Abbildung 2) übertragen.

3. Materialien

1. Embryonale Whole Lung Isolation

1. Timed-schwanger (C57BL6 Wildtyp oder transgene) Mäuse auf postcoitum Tag 11,5 bis 13,5 (E11.5-13.5) geopfert werden.
2. Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), flüssig, ohne Calciumchlorid, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat. (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Bewahren Sie die HBSS bei Raumtemperatur und bei 4 ° C nach dem Öffnen. Aliquotieren und speichern Sie die Penicillin-Streptomycin bei -20 ° C.
3. Stereoscopic Präpariermikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland).
4. Dissection-Tools einschließlich Dumont Pinzetten, Fine Iris Schere (gerade), Noyes Frühjahr Schere und Moria ® Löffel (perforiert) (Fine Science Tools, Foster City, CA).

2. Embryonale ganze Lunge Kultur

1. Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1x), flüssig, noch 1:1 L-Glutamin, aber keine HEPES-Puffer. (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Halten Sie die DMEM/F-12 Flasche weg vom Licht (z. B. durch Aluminiumfolie abgedeckt) und lagern bei 4 ° C. Aliquotieren und speichern Sie die Penicillin-Streptomycin bei -20 ° C.
2. Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran, 8,0-m, 13 mm (Whatman Nuclepore Track-Etch-Membran (Whatman, Florham Park, NJ).
3. Nunclon Polystyrol Schüssel mit Deckel, 4 Vertiefungen (Rochester, NY).
4. Einweg Transferpipetten, sterile (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Abbildung 1. Präparation E12 embryonalen Lunge. (A) E12.5 ganze Embryo von der rechten Seite angezeigt. (B) mit der rechten Vorderbein aus dem Embryo entfernt worden ist. (C) Pinzetten von der linken Hand des Embryos stetig in die Schüssel gehalten. Die Pfeile zeigen Plan der Dissektion (D) Embryonale Lunge liegt hinter dem Herzen (entfernt) Und vor der Wirbelsäule. Diese Abbildung zeigt die Lunge nach Haut-und Herz Entfernung. (E) Pharynx Entfernung Trennung der intakten Lunge ermöglicht aus dem Embryo. (F) Überflüssige pharyngeale Gewebe und Speiseröhre wurden abgeschnitten. Dissected E12.5 embryonalen Lunge mit intakten Luftröhre und Kehlkopf wird angezeigt. (Cr) Cranial Lappen, (Med) Medial Lappen, (Ca) Schwanzflossenlappen, (Acc) Zubehör Lappen, (Le) linken Lappen.

Abbildung 2. FGF9 induziert Erweiterung des Mesenchyms und der Dilatation des Epithels in der Lunge in vitro gezüchtet. (AC) E12.5 Lunge für 48 Stunden in Abwesenheit von FGF9 angebaut wird. Notieren Sie sich die Zunahme der Verzweigung. (DF) E12.5 Lunge für 48 Stunden in Anwesenheit von FGF9 gewachsen. Beachten Sie die Erweiterung des Epithel und Mesenchym bereits nach 24 Stunden Kultur (E). Nach 48 Stunden (F), ist die Wirkung auf das Epithel noch stärker ausgeprägt. Maßstab: AF 400 um ^4.

Der vollständige Text Protokoll für diesen experimentellen Ansatz ist in Springer Protocols .

Diese Arbeit wurde durch die Saban Research Institute Pre-Doc-Award (PMDM) unterstützt und von NIH RO1 HL75773 (DW).