Method Article
Luciferase-modifizierten menschlichen Gehirns Tumorxenotransplantaten können intrakraniell in athymischen Mäusen festgestellt werden, mit anschließender Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung. In Kombination mit dem Überleben Analyse wird Biolumineszenz Überwachung ein wesentliches Recherche-Tool für die präklinische Prüfung von Therapien, zur Behandlung von Gehirntumoren betrachtet.
Transplantation Modelle mit menschlichen Gehirns Tumorzellen haben eine wesentliche Funktion in der Neuro-Onkologie-Forschung seit vielen Jahren serviert. In der Vergangenheit bestand die am häufigsten verwendete Verfahren für den menschlichen Tumorxenotransplantates Gründung der Sammlung von Zellen aus Kulturflaschen, durch die subkutane Injektion der gesammelten Zellen bei immungeschwächten Mäusen. Dieses Konzept sieht noch häufige Verwendung in vielen Labors, hat es eine deutliche Akzentverschiebung in der letzten Dekade in Richtung orthotope Xenograft Einrichtung, die in der Instanz von Hirntumoren, erfordert Tumorzelleninjektion in entsprechende neuroanatomischen Strukturen. Da intrakraniellen Xenograft Einrichtung entfällt die Möglichkeit, das Tumorwachstum durch direkte Messung, z. B. durch Verwendung von Bremssätteln, die Akzentverschiebung in Richtung orthotopen Gehirntumor Xenotransplantatmodellen Monitor verfügt über die Nutzung von nicht-invasive Bildgebung zur Beurteilung der Tumorlast in Wirtstiere notwendig. Von den derzeit verfügbaren bildgebenden Verfahren wird Biolumineszenz Überwachung allgemein als die beste Kombination von Empfindlichkeit, Zweckmäßigkeit und Wirtschaftlichkeit bieten. Hier zeigen wir Ihnen, Verfahren zur orthotopen Gehirntumor Aufbau und zur Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Behandlung bei der Prüfung der experimentellen Therapien.
1. Tumor Cell Preparation.
Zellen für die menschliche Gehirn Tumorxenotransplantaten kann entweder bezogen werden von Tumoren vermehrt als subkutane Wachstum in athymischen Mäusen oder aus der Zellkultur. Die Nutzung beider Zellquellen ist nachfolgend zusammen mit Demonstration einer Methode für die Zell-Implantation behandelt.
Zur Vorbereitung Zellen aus subkutane Tumoren für die Übertragung auf den intrakraniellen Raum, ausgeschnitten Flanke Tumoren in Kulturschalen gelegt, wo das Gewebe zunächst mit einem Skalpell und dann mechanisch zerstört durch wiederholtes Pipettieren zu einem Zellverband Suspension 1 erstellen zerkleinert. Die Zellverbandes Suspension wird dann durch einen 70 uM Nylon-Sieb-Filter, um einen einzigen Zellsuspension für intrakranielle Injektion produzieren weitergegeben. Die Zellsuspension wird bei 1000 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C, und der Überstand vor Resuspendieren des Zellpellets in einem geeigneten Volumen von Serum-freien Medien zu einer endgültigen Arbeitskonzentration (siehe unten) erhalten abgesaugt zentrifugiert. Für die Herstellung etablierten Zelllinien für intrakranielle Implantation werden die Zellen durch trypsinizing Monoschichten geerntet, oder durch das Sammeln von Neurosphäre Suspensionskulturen, dann Zentrifugieren und Resuspendieren der Zellen wie oben 2 angegeben. Die Anzahl der Zellen injiziert wird abhängige Variable neuroanatomischen Ort der Injektion. Für supratentoriellen Injektionen wir routinemäßig injiziert 3-5 x 10 5 Zellen in 3 ul Serum-freien Medien (DMEM), während für Hirnstamm-Injektionen 3, so wenig wie 5 x 10 4 Zellen in 0,5 ul injiziert werden. Injektion größerer Mengen als empfohlen können in Tumorzellen Rückfluss durch die Nadel-Darm-Trakt führen, mit den daraus resultierenden exophytischen (Abbildung 1), anstatt intrakraniellen Tumorwachstum. Nach dem Abziehen Probe für intrakranielle Injektion sollte die verbleibende Zellsuspension in Eis gelegt werden, mit Inhalt häufig geeignete Konzentration aufrecht zu erhalten, beim Ausfüllen intrakranieller Tumor Etablierung unter den Mitgliedern einer Injektion Serie gemischt.
2. Tumorzellimplantation
Beachten Sie haben alle unten beschriebenen Verfahren geprüft und von der Institutional Tierexperimente und Ausschuss an der University of California San Francisco verabschiedet.
3. Biolumineszenz Überwachung des Tumorwachstums
4. Repräsentative Ergebnisse
In dem Beispiel in Abbildung 3A gezeigt, waren Mäuse, die intrakranielle Tumorzelleninjektion für intrakranielle Lumineszenz überwacht, bis aufeinander bedeuten Lumineszenz angegebenen Werte progressive Wachstum von Tumoren, und zu welchem Zeitpunkt Therapie eingeleitet wurde (grauer Pfeil ab Tag 34: Erlotinib täglich 150 mg verabreicht / kg, bis die gewünschte Sterbehilfe). Lumineszenz-Werte für jede Maus sind auf einen normierten Wert 1 zum Zeitpunkt der Einleitung der Therapie gesetzt, mit anschließender Lumineszenz Messungen für jede Maus normalisiert, um seine endgültige Vorbehandlung Imaging-Wert. Als Beispiel einer Maus mit einem letzten Vorbehandlung Lumineszenz Lesen von 2,0 x 10 7 Photonen / sec an Tag 34, deren Lumineszenz war auf 6,0 erhöht x 10 7 Photonen / sec am Tag 38, hätte einen Tag 38 normalisierten Lumineszenz-Wert von 3,0. Mittlere normalisierte Biolumineszenz und die entsprechenden Standardfehler für Kontroll-und Behandlungsgruppen werden für jedes Imaging Zeitpunkt aufgezeichnet. In diesem Beispiel wird ein signifikanter Unterschied in mittleren normalisierten Lumineszenz bei der ersten bildgebenden Zeitpunkt nach dem Beginn der Therapie (Tag 38) deutlich, mit dem Unterschied in der mittleren Gruppe Lumineszenz zeigen weitere Steigerung bei späteren Zeitpunkten. In den meisten Fällen ist die Anti-Tumor-Aktivität der Therapie, wie qBLI angegeben, durch eine entsprechende signifikanten Unterschied im Überleben (dh, p <0,05) begleitet, wie es hier der Fall (Abbildung 3B). Panels 3C und 3D zeigen neben Hämatoxylin & Eosin-und anti-EGFR-gefärbten Schnitten von Maus-Gehirn zum Zeitpunkt der Euthanasie erhalten folgende Platzierung der resezierten Gehirn in Formalin und anschließender Paraffin-Einbettung für das Schneiden.
Abbildung 1. Indikationen intrakranieller Injektion Fehler. A) exophytischen (extrakraniellen) das Tumorwachstum (roter Kreis) kann durch eine zu große Einspritzmenge, restliche Zellsuspension an der Spritze verursacht werden, oder von der Rücknahme der Spritze zu schnell nach der Injektion der Tumorzellen. B) Injektion Tumorzellen in die Ventrikel kann dazu führen, Wirbelsäule Verbreitung von Tumorzellen (Maus nach rechts), im Gegensatz zu richtig injiziert Tumorzellen, das Signal für die an der Injektionsstelle (Maus nach links) lokalisiert bleibt.
Abbildung 2. Heatmap Bild Darstellungen von Biolumineszenz Intensität für repräsentative Mäuse von Kontrolle (links) und Behandlung (rechts) Gruppen einer Therapie Antwort zu experimentieren. The Living Image Software kann so eingestellt werden regions of interest (rote Kreise) zu definieren, oder ein Instrument Betreiber können regions of interest manuell zu definieren. Für die Verwendung von Bildern wie diesen für Figurenbau, empfehlen wir, dass das Instrument Betreiber Heatmap Bilder mit der gleichen Biolumineszenz Heatmap (oberer Teil der Abbildung), die visuelle Darstellung des Ausmaßes der Biolumineszenz Unterschied zwischen Tier Themen einzuholen zeigt.
Abbildung 3. Biolumineszenz, Überleben und Tumorgewebe Analyse aus einem Experiment, in dem therapeutischen Ansprechen ist evident. A) Plot der mittleren Biolumineszenz Lesungen für die Kontrolle und Behandlung Gruppe Mäuse mit Standardfehler jeweils angegebenen Imaging Punkt. B) Survival Grundstück für gleiche Mäusen; p-Wert durch die Verwendung von Log-Rank-Test 7 bestimmt. C) H & E gefärbten Abschnitt Gehirn der Maus mit Tumor. D) EGFR gefärbte Schnitt. E und F) Vergrößerungen der angegebenen Bereiche aus Platten C und D, jeweils mit Panel E zeigen negative Färbung für Tumor-Suppressor-Protein PTEN.
Orthotopen (intrakranielle) Gehirntumor Xenograft Einrichtung bietet eine geeignete Mikroumgebung 10 für Modellierung CNS Krebs für therapeutische Reaktion getestet werden. Diese Art der Modellierung bietet zusätzlich Informationen über die therapeutischen Zugang zu Gehirn-und Hirntumoren, die von entscheidender Bedeutung, um festzustellen, ob eine experimentelle Wirkstoff in die klinische Studie Evaluierung sollte bei Patienten vorangetrieben werden wird. Da die Menge der intrakraniellen Xenograft Tumor kann nicht direkt gemessen werden, wie durch Bremssättel, erfordert Längs-Überwachung von intrakraniellen Tumorwachstum und Ansprechen auf die Therapie nicht-invasive Bildgebung, mit unserer Erfahrung zeigt Biolumineszenz-Bildgebung wie die meisten praktischen Ansatz für Experimente, deren vorrangiges Ziel prüft Ausdehnung des Tumors auf die Therapie. Wenn die Ergebnisse der Biolumineszenz-Bildgebung mit tierischen Subjekt Überlebensanalyse kombiniert werden, bieten die beiden Datensätze eine leistungsstarke und zuverlässige Methode für die Bewertung experimentellen therapeutischen Wirksamkeit.
Schließlich ist es äußerst wichtig, dass intrakranielle Gehirn Tumorxenotransplantaten aus eingeschläfert Tier Themen werden geerntet, um morphologische und molekulare Effekte der Therapie zu beurteilen, und dafür haben wir lieber ganze Gehirn Resektion zum Zeitpunkt der Euthanasie, mit der Erhaltung der resezierten Gehirn für die spätere Analyse.
Während der vorangegangenen Präsentation gemacht wurde speziell für Hirntumor Forschung, sind die Konzepte wohl generalizeable zu anderen Krebserkrankungen des Menschen, die zugänglich orthotopen Modellierung bei Nagetieren sind.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Disposable Scapels | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975 | No.21 |
Heating Pad | Dunlap | HP950 | |
Gauze | Fisher Scientific | 22028563 | |
Cotton Swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
2% Chlorhexidine | Fisher Scientific | NC9756995 | |
3% Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H312P-4 | |
25g Needle | BD Biosciences | 305122 | |
10ul Hamilton Sharp Microsyringe | Hamilton Co | 20734 | |
Skin Stapler and Staples | Stoelting Co. | 59020 | |
Stereotaxic Frame | Stoelting Co. | 51725 | |
Living Image Software | ![]() | ||
D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | Potassium Salt |
Xenogen Lumina | ![]() |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten