使用非病毒性睡美人转座子系统工程化靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞

我们的研究重点是开发一种针对侵袭性真菌感染的现成 CAR 细胞疗法。我们的目标是确定最佳靶点、CAR 设计和免疫细胞组合，以实现最佳治疗效果。最近的发展，包括我们自己的工作，都集中在开发针对烟曲霉的 CAR T 细胞疗法上。

这些工程细胞通过显著降低真菌负荷、控制抗真菌免疫和提高总生存期，在临床前模型中显示出有希望的结果。目前，该领域的大多数研究都集中在使用病毒载体或睡美人转座子系统产生对非常有限的靶标具有特异性的 CAR T 细胞。主要挑战包括确定最佳真菌靶标并生产一种既有效又可扩展的即用型细胞产品，用于临床应用。

通过该方案，我们正在解决对生成非病毒 CAR-NK 细胞的成本效益和可扩展方法的需求。它为筛选新的抗真菌靶点提供了一种可用的方法，为针对真菌感染的现成 CAR-NK 细胞疗法迈出了基础一步。首先，在显微镜下检查透明背景下的 NK-92 细胞是否有簇，在每种条件下每孔加入 2 毫升细胞培养基到六孔板中，然后将板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中。

将 8 乘以 10 倍的 6 个 NK-92 细胞转移到 15 毫升锥形底管中，并以 200 G 的离心力离心管 5 分钟，加速和减速为 3。弃去上清液后，用最多 15 毫升预热的 PBS 填充含有细胞沉淀的试管，然后再次离心。在离心过程中，将 8 μg Af-CAR 质粒 DNA 和 4 μg SB100X 小圆圈移液到一个反应管中，并保持第二个试管 DNA 自由作为模拟对照。

对于转染系统，将 3 mL 电解缓冲液加入第一管中，然后将其放入移液器站中。离心后，轻轻弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 μL 重悬缓冲液中。然后将 100 微升细胞悬液加入两个反应管中，并轻轻混合。

使用转染系统移液器从第一个反应管中吸取 DNA 细胞混合物，将转染移液管垂直插入移液器站的试管中。将第一个脉冲设置为 1， 650 伏，脉冲时间为 20 毫秒，然后按开始启动脉冲。在第一个脉冲之后，将第二个脉冲设置为 500 伏，将脉冲时间设置为 100 毫秒，然后启动第二个脉冲。

第二次脉冲完成后，慢慢地从移液器站中取出移液器。立即将细胞转移到装有 2 毫升预热细胞培养基的制备培养板的一个孔中，并以圆周运动轻轻移动板以均匀分布细胞。将板置于 37 摄氏度的加湿培养箱中，含 5% 二氧化碳。

孵育 30 分钟后，将白细胞介素-2 以 150 国际单位/毫升的终浓度添加到孔中。首先，用所需的质粒转染 NK-92 细胞。将细胞转移到 15 mL 锥形底管中。

然后离心细胞，并使用缓冲液将其稀释至每 100 微升 6 个细胞的 1 至 2 倍 10 的浓度。每 1 乘以 10 次添加 1 微升抗 EGFR-T 生物素至 6 个细胞的幂，并轻轻混合以确保溶液均匀分布。将试管在 4 摄氏度下孵育 25 分钟。

孵育后，向试管中填充最多 10 mL 的缓冲液。接下来，将试管以 200 G 离心 5 分钟，加减速为 3，离心后弃去上清液。然后加入 8 微升冷缓冲液，然后每 1 乘以 10 加入 2 微升抗生物素磁珠，以达到 6 个细胞的功效。

将试管在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。要洗涤细胞，请在试管中加入最多 10 毫升的缓冲液并离心。弃去上清液后，将细胞重悬于 500 μL 缓冲液中。

将 LS 柱放入 max 磁力架中，并用 3 ml 缓冲液清洗。缓冲液完全迁移过色谱柱后，添加细胞悬液。清洗色谱柱后，将其从磁力架上取下，放入干净的 15 mL 锥形底管中。

向色谱柱中加入 5 mL 缓冲液，并使用柱塞尽快冲洗出 EGF-R 阳性细胞。恢复后的转染效率达到 10% 至 20%，最大富集将 Af-CAR-NK-92 细胞纯度提高到 95% 以上首先，使用磁激活细胞分选技术获得富集的转基因表达 NK-92 细胞。然后在培养基中制备浓度为 2.5 倍 10 至 5 分生孢子/毫升的烟曲霉分生孢子悬浮液。

将 100 μL 分生孢子悬浮液分配到 96 孔培养板的每个孔中，并在 25 摄氏度下孵育板 16 小时。第二天，用培养基洗涤转染的 NK-92 空载和质粒两次，并在含有真菌的板的每孔 100 微升培养基中加入 4 个 NK-92 细胞的 5 乘以 10 倍以共培养。将板在 37 摄氏度下在加湿二氧化碳培养箱中孵育至少 6 小时。

将板以 300 G 离心 5 分钟后，从每个孔中收获 100 μL 上清液，而不接触底部。最后，将上清液转移到反应管中进行 ELISA。在与烟曲霉菌种管共培养期间，与模拟 NK-92 细胞相比，Af-CAR-NK-92 细胞显示出显着更高的干扰素 γ 分泌。