用于研究钙离子通道激活的单细胞钙成像

我们研究了与温度感觉、年龄感觉和疼痛感觉相关的通道。我们对筛选通道中的小分子活性及其机制研究感兴趣。我们筛选了两种 TRPV1 激活激动剂，并对其作用机制进行了详细研究。

该技术能够实时、定量和同时监测多个细胞中的钙变化，使其成为研究应用的一种简单快速的方法。我们的目标是通过钙相关离子通道的现代化来探索各种疾病的中医治疗机制。首先，准备直径为 8 毫米的无菌载玻片，并将它们放入 24 孔板中。

向每个孔中加入 500 微升 Poly-D-赖氨酸缓冲液。将玻片在 37 摄氏度下孵育 1 小时以允许涂层。然后使用移液管丢弃每个孔中的涂层溶液。

用 Dulbecco 的 PBS 洗涤载玻片一次，然后将洗涤后的载玻片放在一边以备后用。将细胞以大约 1.5 乘以 10 的 10 倍/孔 5 次方的密度接种到准备好的 24 孔板上，然后将板放入培养箱中，直到细胞粘附。接下来，将 Fura-2/AM 储备液和 Pluronic F-127 与含有 1.3 毫摩尔钙离子的 Hank 缓冲液混合。

使用铝箔覆盖 Fura-2/AM 工作溶液以保护其避光。为了预处理细胞，将载玻片与细胞一起转移到含有 Hank 缓冲液的新 24 孔板中。使用移液管，丢弃每个孔中的缓冲液，并向每个孔中加入 500 微升 Fura-2/AM 工作缓冲液。

将板在室温下避光孵育 30 分钟，以便加载探针。然后从每个孔中取出 Fura-2/AM 工作缓冲液，并用 Hank 缓冲液洗涤细胞 3 次，以去除过量的 Fura-2/AM。首先，获取用于单细胞钙成像的预处理细胞，并启动荧光显微镜的所有组件。

从可用选项中打开荧光成像软件。选择所需的协议，然后单击 Okay（确定）。然后，从主菜单中选择 New Experiment 以启动新的实验设置。

现在，将灌注室安装在显微镜载物台上，并小心地将 Fura-2/AM 处理的细胞载玻片放入含有 Hank 缓冲溶液的腔室中。在白光下调整焦距以获得最佳观看效果。在实验控制面板上选择 Focus（聚焦）。

选择所需的聚焦波长，例如 380 纳米，然后单击 开始聚焦 开始调整焦点。使用 Rough Focus 调整单元格上的焦点以使物镜接近，然后使用 Find Focus 进行精确调整。通过 FITC 或 TRITC 的波长观察靶蛋白的表达。

然后单击 Stop Focusing 并关闭焦点面板。单击任务栏中的 Configure Experiment ，然后在配置设置中选择所需的地板进行成像。现在单击菜单栏中的 Region 按钮来定义成像区域，并选择 Desired Illumination 类型进行成像。

点击 获取图像，然后按 好 捕获图像。确定在荧光下表达靶蛋白的所需细胞，考虑 380 纳米以下对照的空白读数。要撤消所选区域，请右键单击圆圈并选择 Delete Region。

打开 References 菜单，选中 Subtract References 复选框，然后单击 Okay 应用背景减法。在 Experiment control （实验控制面板） 上，单击 Log Data （日志数据） 以记录实验数据。在控制面板的 Time Lapse 部分中，将 Data Acquisition Interval 设置为 1 秒。

然后单击实验控制面板上的 Zero Clock 和 Acquire 开始数据采集。现在根据要求对细胞进行处理。数据采集完成后，单击 Pause 暂停以停止该过程。

保存获取的数据并继续分析。要结束实验，请单击 File 并选择 Close Experiment 。最后，关闭软件并从计算机传输所有保存的数据。

载有 Fura-2 探针的原代角质形成细胞在 380 纳米波长处显示出可见的细胞形态。角质形成细胞的热反应显示加热过程中细胞内钙离子浓度增加，冷却过程中观察到类似的反应。热反应在角质形成细胞中被消除，缺乏表明该基因在热钙信号传导中作用的 STIM1 基因。

过表达 STIM1/Orai1 的 HEK293T 细胞在冷却后表现出显着的热反应，确认基因表达成功，绿色和红色荧光标记证明了这一点。通过大量表达 STIM1-Orai1 的细胞外钙浓度和环吡唑酸版本的连续变化，有效地诱导了细胞中钙的进入反应。直接移液 capsaicine（一种 TRPV1 激动剂）触发了表达 TRPV1 质粒的细胞中的细胞外钙内流。