作者感谢欧盟 H2020 计划（项目 GAIN4CROPS，GA 编号 862087）。AgroCropFuture 农业生态学和未来气候中的新作物卓越中心由爱沙尼亚教育和研究部资助。我们要感谢 Evelin Loit-Harro 教授提供 T. aestivum 和 Z. mays 的种子，感谢 Paula Palmet 和 Vaiko Vainola 在准备叶横截面方面的帮助，以及 João Paulo de Silva Souza 在分析方面的帮助。所有图像均来自爱沙尼亚生命科学大学的显微镜部门，在各种项目下。

1. 植物生长条件
<ol><li>分别选择小麦 （Triticum aestivum L. Var. 冬小麦， “Fredis”） 和玉米 （Zea mays L. Var. Saccharata， “Golden Bantam”） 作为代表性的 C3 和 C4 植物。在环境受控的生长室中用种子培养这两种植物。</li>
	<li>将相对湿度保持在 55%，空气温度为 25 °C/18 °C（昼/夜），光照时间为 12 小时。将植物表面的光合光子通量密度 （Q） 保持在 1200 μmol/m2/s，以代表其自然生长条件。在 400 μmol/mol 的环境 CO2 浓度下种植所有植物。</li>
	<li>每2 天用 蒸馏水给植物浇水，并在幼苗出苗后 10 天用 Hoagland 溶液施肥。在给定条件下将植物生长 60 天，并使用完全展开的叶子进行显微镜分析。</li>
</ol>2. 手绘部分的准备和查看
<ol><li>从每株植物中选择 3 片成熟的非衰老叶子，并将它们保存在蒸馏水中。使用新的单面剃须刀片，进行一次平整切割，与叶子表面形成直角，以确保截面是垂直于叶子表面的横向横截面。</li>
	<li>将叶标本放在玻璃板上的一块牙蜡上，以稳定样品并避免滑倒。通过在叶标本上笔直向下移动刀片进行切割，以干净地切开细胞。将横截面保存在蒸馏水中。</li>
	<li>将样品放在水滴上并用玻璃盖玻片覆盖，以便显微镜观察和成像，从而将样品安装在载玻片上。避免积聚气泡。</li>
	<li>在复合光学显微镜下以 10 倍和 20 倍放大倍率观察载玻片。根据软件指南保存图像以及相关比例。</li>
</ol>3. 半薄片的制备
<ol><li>如步骤 2.2 所示，在玻璃板上从 Z. mays 和 T. aestivum 的叶子上从中肋区沿肋间区域切下约 3 毫米 x 5 毫米大小的切片。确保切割部分的长度沿着叶子的纹理延伸。</li>
	<li>将植物材料放入装有 1 mL 固定缓冲液（4% 戊二醛在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中，pH = 6.9， 表 1）的注射器中。</li>
	<li>垂直握住注射器，去除空气，然后用手指放在尖端，泵送注射器以产生真空。重复直到样品位于注射器底部，表明渗透成功。</li>
	<li>将注射器的内容物转移到标记的玻璃瓶中，并在下一步之前在 4 °C 下储存 48 小时（表 2）。</li>
	<li>对于每个小瓶，用移液管轻轻去除固定剂并加入磷酸盐缓冲液，直到样品被覆盖。静置 30 分钟。重复此步骤 3 次。</li>
	<li>用移液管除去磷酸盐缓冲液，并加入四氧化锇 （CAUTION） 直至样品被覆盖。样品和其他有机物会变黑。使用双层手套。放置 1 小时。</li>
	<li>用移液管除去之前的溶液，并用蒸馏水覆盖样品。放置 30 分钟 重复此步骤 3 次，并戴上双层手套。</li>
	<li>用移液管除去前一种溶液，并用 50/50 蒸馏水-乙醇溶液覆盖样品。静置 30 分钟。使用以下系列的蒸馏水-乙醇溶液重复此步骤：30/70、20/80、10/90 和 2x，100% 乙醇。这些溶液中的任何样品都可以在 4 °C 下放置过夜。</li>
	<li>用移液管除去前一种溶液，并用 1/3 树脂-乙醇溶液覆盖样品。将样品放在搅拌板上，放置 2 小时。使用以下系列的树脂-乙醇溶液重复此步骤：1/2、1/1、2/1、3/1 和 2x，100% 树脂。这些溶液中的任何样品都可以在 4 °C 下放置过夜。</li>
	<li>用 100% 树脂覆盖平面包埋模具的型腔（16 个型腔，型腔尺寸：14 L x 4.8 W x 3 D （mm）），并将样品放在型腔的一端。为每个样品准备铅笔书写的纸质标签，并将它们放在腔体的另一端。</li>
	<li>用 100% 树脂完全填充所有腔体，如果样品和标签移动，请将其拉直。用嵌入膜覆盖模具，并按照丙烯酸树脂产品指南在烘箱中聚合。</li>
	<li>将带有样品的聚合块放在超薄切片机的样品架中。使用粗糙的玻璃刀修剪块，直到组织变得可见并去除多余的树脂。</li>
	<li>使用玻璃或金刚石刀横向 （1 μm） 切割半薄片。使用金属接种环从水面收集切片，并将它们放在载玻片上。在热板 （60 °C） 上干燥载玻片以将切片固定在玻璃上。</li>
	<li>用甲苯胺蓝（1% 水溶液）染色固定切片 5 秒，然后用蒸馏水冲洗并在热板上再次干燥。 注意：确保在通风橱下进行化学固定过程。应定期更换玻璃刀，以确保切割锋利，使切片没有撕裂或变形。</li>
</ol>4. 样品成像
<ol><li>新鲜叶切片的成像<ol><li>根据手册使用随附的软件设置复合光学显微镜。</li>
		<li>将载玻片放在载物台上。调整目镜并以 10 倍观察截面以获得概览，然后在 20 倍和 40 倍物镜下观察。</li>
		<li>在每个目标处，导航 Live 频道，专注于感兴趣的区域，并找到静脉周围的束鞘细胞。</li>
		<li>聚焦后，单击 冻结 按钮并通过按 比例 尺 按钮 工具 选项卡。将图像存储在 中。TIF 格式进行图像分析。</li>
	</ol></li>
	<li>树脂浸润切片的成像<ol><li>将自动光学显微镜与计算机上的随附软件相结合。</li>
		<li>加载透明通道并将载玻片放在显微镜载物台上。使用 40 倍物镜放大倍率聚焦切片并调整亮度以确保所有细胞结构都可见。</li>
		<li>使用导航器功能设置截面的位置区域，以确保整个截面都成像，然后单击 Stitch 按钮。</li>
		<li>单击 Done（完成 ），然后单击 Start（开始 ），以允许显微镜对整个切片进行成像。打开图像分析软件并打开显微镜拍摄的图块。</li>
		<li>使用 Align 功能，确保切片不重叠。生成图像后，使用 调整 标签。</li>
		<li>在存储之前在图像上打印比例尺。TIF 格式。</li>
	</ol></li>
	<li>使用 ImageJ 软件进行解剖测量<ol><li>打开 ImageJ 软件并通过将图像拖到窗口中来加载图像。</li>
		<li>使用“线条”工具，按如下方式校准比例：在比例尺上绘制一条线，选择 “分析”>“设置比例”，将已知距离更改为比例尺的长度，然后将长度单位更改为正确的单位。</li>
		<li>通过选择 Line Tool，在感兴趣区域画一条线，然后按 M 键来测量预期特征。</li>
		<li>对于面积测量，请选择 多边形选择工具 并在感兴趣的组织周围绘制。按 M 键结束。测量值显示为弹出窗口，可以将其复制到电子表格中以进行进一步的数据分析。</li>
	</ol></li>
</ol>

提高 C4 作物光合效率的显微镜分析

作者声明没有利益冲突。

在本文中，我们讨论了测量叶片解剖结构的定量和定性方法以及优化它们的方法。此外，该方法应用于代表性作物物种，以确定哪些解剖性状在区分 C3 和 C4 横截面时最有用。了解这些特征至关重要，因为被称为 C2 光合作用的杂交物种正在成为一种更有前途的研究途径。截至目前，只有一种作物物种 Diplotaxis tenuifolia （芝麻菜）被确定使用 C2 光合作用，但很可能比当前记录显示的25 种更多。C2 谱系中存在高水平的种内光合多样性和可塑性。这意味着确认 C2 光合作用的发生需要多条证据线，例如 CO2 补偿点、超微结构分析和免疫组织化学30。
多年来，徒手和半薄切片一直用于识别和测量特定的植物组织，但本文旨在讨论影响 C3 和 C4 作物植物之间光合分化的解剖叶结构的特定用例。徒手和半薄切片都有一些注意事项需要考虑。徒手切片虽然很容易获得，但可能会导致叶切片的厚度不一致，从而阻碍定量分析。这可以通过使用专门的设备对新鲜植物材料进行切片（例如振动切片机或低温恒温器）来避免。手工切片的较厚切片会导致多层细胞相互重叠，使细胞模糊，从而模糊解剖结构。如果切片的目的是纯粹的定性，那么手绘切片具有植物组织化学处理（即组织化学）的优势31。这允许定性指示植物细胞中存在特定化合物。相反，半薄截面几乎总是导致始终较厚的截面。但是，这些过程更长、更精细，因此容易出错。将进一步讨论可能出现的问题以及避免这些问题的方法。
定影 徒手切片和半薄切片都必须使用新鲜材料，即水分充足的植物的叶子。来自枯萎叶的切片不具有结构完整性，因为细胞的膨胀压力降低。当从树脂包埋材料中获得半薄切片时，确保叶切片在真空下固定以替换叶内的空气至关重要。这允许在渗透过程中保持结构完整性和渗透性。如果此步骤没有正确完成，细胞可能会塌陷，导致横截面不能准确描述真实的叶子结构，从而导致解剖测量不正确32。
相反，高真空压力会损坏带有软组织（如子叶）的叶片，导致细胞萎缩或样品破坏。这可以通过使用适当的真空泵设置或完全跳过它，只需将样品浸泡在固定液中来避免。如果后者是首选，则可以从四面八方切割样品，以方便固定剂浸润到组织中。
预渗透 细胞壁厚度和硬化组织是影响溶液渗透的最有影响力的解剖学特征，可实现标本的最佳固定和浸润。植物组织中菌核的作用是机械支撑和保护，这会影响渗透过程33。由于这些组织具有高度增厚的木质化细胞壁，因此会阻碍溶液的渗透。存在渗透问题的样品会导致半薄切片，树脂中带有破损的细胞和撕裂（图 5C，D）。纵向切片导致细胞扭曲，导致解剖学分析和叶片性状测量（如细胞大小和细胞密度）出现偏差（图 5F-H）。
树脂渗透 高质量的切片对于观察解剖组织至关重要，解剖组织直接受到标本嵌入介质的影响。植物组织学中最常用的包埋介质是石蜡、环氧树脂和丙烯酸树脂34,35。蜡包埋需要通过化学固定剂制备样品，并用液态蜡浸润，液态蜡在室温下硬化。这些切割通常会产生 5-10 μm 厚的切片，如此处所示，这同样可以通过手工实现（图 2），并且只需要未固定的新鲜组织。在这种情况下，束鞘周围的细胞排列对于区分 C3 和 C4 植物至关重要，这需要使用更坚固和刚性的包埋介质。在本研究中，对环氧树脂 （Spurr 树脂36） 和丙烯酸树脂 （LR White） 进行了硬度、寿命、样品渗透以及切片耐久性测试。环氧树脂几十年来一直用于生物材料的包埋37。丙烯酸树脂相对较新，最初考虑用于包埋植物标本，因为它们随着时间的推移具有弹性，因为与环氧树脂不同，它们不会因紫外线照射而变色，并且不易收缩38。LR White 丙烯酸树脂（硬质级）因其无毒和紫外线稳定配方而被选中。丙烯酸树脂的粘度往往比环氧树脂低得多，这允许更快的样品渗透，并且材料的硬度允许使用切片机39 进行更清洁的切割。图 5C，D 显示了环氧树脂在具有大量结构组织的叶标本中的结果，与丙烯酸树脂相比，由于环氧树脂的柔软性，撕裂是不可避免的（图 3）。
超薄切片机 去除多余的树脂可能会在树脂中产生裂纹，这些裂纹会渗透到样品中。为避免这种情况，考虑选择用于包埋的树脂的密度和脆性至关重要。切得更深应避免因手工或粗刀修剪而造成的任何伪影。样品应垂直于样品架对齐，并通过通过目镜增加放大倍率以及观察固定和染色的切片来验证。未以完全直角切割的植物细胞表现为锥形细胞，其中一端大于另一端40。
后染色 甲苯胺蓝（1% 水溶液溶液）用于对在超薄切片机上切割的半薄切片进行染色。如果污渍在切片上晾干时间过长，则会导致过度染色，导致切片在成像时过度饱和（图 5A）。当染色剂没有得到很好的过滤时，会导致未溶解的颗粒在切片上干燥，从而阻碍解剖结构的可视化（图 5B）。在制备甲苯胺蓝溶液时使用精细过滤器以及限制切片暴露于染色剂，可以避免此问题。染色前，将样品在 60 °C 的热板上干燥，以确保切片与玻璃显微镜载玻片结合，但在冲洗并再次干燥之前，不应暴露在甲苯胺蓝中超过 10 秒41。
解剖测量的注意事项 本文中所示的测量值只是可以使用半薄切片定量评估的许多解剖特征的一个例子，包括细胞间空隙的一部分、平均叶肉厚度（无维管组织）和每单位叶面积暴露于细胞间空气空间的叶肉表面积42。然而，虽然束鞘细胞大小是区分 C3 和 C4 代谢的重要指标，但束鞘细胞壁厚度是另一个不能仅凭光学显微镜观察的重要特征，因为它决定了束鞘细胞的泄漏程度，即 CO2 回扩散到叶肉细胞中的量42，43.高泄漏性会降低光合效率，因为 PEP 羧化酶用于固定 CO2 的大部分能量会损失 44,45,46。对于此类超微结构分析，需要透射电子显微镜和图像分析。尽管本研究仅考虑了光学显微镜检查，但该方案包括用四氧化锇处理，四氧化锇是一种造影剂和固定剂，是 TEM 显微镜检查的基石。因此，聚合样品仍可在需要时用于 TEM 分析，即使在制备时未考虑。
虽然解剖学诊断可以很容易地检测到 Kranz 样结构，但 C4 的存在可以通过气体交换测量进一步诊断，这可以显示典型的 C4 生理学，即低 CO2 补偿点、有限的 O2 对光合作用的抑制和不同的碳同位素组成 2,4,47。
还应该注意的是，Kranz 解剖结构对于 C4 光合作用的发展不是必需的，单细胞 C4 植物的发现表明 48,49,50。因此，仅靠解剖学分析可能不足以检测研究较少的类群中的 C4 生理学。解剖学特征与生理分析的耦合为研究作物和野生植物的叶片性状及其结构-功能关系提供了强大的工具。

光合作用是将光能转化为化学能的基本过程，是陆地营养网络的基石。大多数植物遵循光合作用的 C3 途径，其中主要的光合作用产物是三碳化合物甘油酸酯 3-磷酸盐。C3 光合作用是在 20 多亿年前在大气中进化而来的，其中 CO2 含量丰富，O21 含量较低。在这些条件下进化的关键光合酶核酮糖 1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶 （Rubisco） 在当前低 CO2 高 O2 条件下是次优的，因为它与 O2 竞争性反应，启动光呼吸2。光呼吸是一种浪费的途径，它消耗能量而不是产生能量并释放 CO2 作为副产品。因此，在叶绿体中 Rubisco 周围保持高 CO2 浓度以防止氧合至关重要 3,4。由于 C3 植物无法浓缩 CO2，因此 CO2 从环境空气中大量吸收到叶绿体中，抑制光合作用并影响植物生长和生物质生产 2,5,6。
在 C3 植物中，光合作用受到 CO2 通过气孔进入、通过叶肉扩散以及光合酶的生化活性的限制。CO2 的进入首先受到气孔导度的限制，气孔导度受空气温度和湿度等环境条件控制。然后 CO2 通过叶子的内部气相和液相扩散到 Rubisco7。在 C3 植物中，光合作用的所有阶段都发生在叶肉细胞的叶绿体中，植物需要保持 CO2 从大气中持续流入叶绿体。叶绿体中 CO2 的可用性取决于气孔开放性、叶肉结构以及单个细胞和叶绿体特性，这使得植物容易受到环境限制的影响，最终影响光合作用，如低水可用性和高温 7,8,9,10，特别突出了它们对气候变化条件的脆弱性11。
鉴于 C3 途径的低效率带来的挑战，以及维持最佳 CO2 水平和对环境因素的敏感性的限制，在某些植物中，另一种途径，即 C4 光合作用途径，已经进化出来。特征性地，C4 植物具有两条空间上分离的生化途径;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在叶肉细胞中发生初始 CO2 固定，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对 CO2 的亲和力高于 Rubisco，并且也缺乏氧合活性。形成的 C4 产物进一步转运到束状鞘细胞，在那里脱羧，CO2 再次被 Rubisco（C3 光合作用）释放和固定12,13,14。PEP 羧化酶对 CO2 的亲和力更大，束鞘细胞的厚细胞壁允许 CO2 在束鞘细胞中浓缩，因此，C4 植物通过空间分离 CO2 固定和卡尔文循环来最大限度地减少光呼吸。C4 途径的采用展示了大自然对环境限制的适应性反应，为在不断变化的气候条件下提高作物生产力和复原力的潜在策略提供了见解15。
C4 植物叶结构的专门解剖结构的特征是叶脉被含有叶绿体的扩大的维管束鞘细胞包围，并且叶肉细胞呈放射状排列，外环围绕束鞘细胞。叶肉细胞靠近束鞘细胞，这使得代谢物能够在两种细胞类型之间快速连续地运输。该细胞的排列是典型的 C4 植物，称为 Kranz 解剖学16。在 C3 物种中，叶肉细胞的特化和处置可能会有所不同，但束鞘细胞明显较小，并且有一些叶绿体或根本没有叶绿体。特异性 Kranz 解剖结构允许将 CO2 集中在 C3-羧化酶 Rubisco 所在的束鞘细胞中的叶绿体中，从而有效阻碍光呼吸 4,17,18。尽管其看似复杂的排列，但这些变化在被子植物的进化中独立地多次发生，表明它是一个相对可行的进化途径 19,20,21，并且各种分类群已被证明处于 C 3 和 C4 碳代谢之间的中间阶段，称为 C3-C 4 或 C 2， 具有浓缩和重新吸收 CO2 22,23,24,25 的能力。
许多 C4 植物是具有高度经济重要性的作物，对 C3 作物（如水稻）进行基因工程改造以提高其气候适应力并确保产量一直是过去几十年来感兴趣的话题26,27。然而，工程工作需要详细了解 C4 特化解剖结构及其如何控制光合作用 2,28。
建立 C4 Kranz 解剖结构是实现将 C4 光合作用工程化为 C3 作物的雄心勃勃目标的先决条件25。然而，目前对 Kranz 解剖学的调节和快速筛选其关键解剖特征的方法的理解是有限的，因此很难识别杂交物种。先前的研究表明，调节 C3 和 C4 植物光合效率的关键性状包括脉间距离、束鞘复合体的直径和束鞘细胞的大小14,29。这些性状可以使用徒手切片轻松筛选，并使用半薄切片进行定量分析。在这里，我们描述了通过徒手交叉和光学显微镜评估允许 C3 和 C4 解剖区分诊断的性状的方法，即束鞘面积、静脉间距离和静脉频率。

<table><tbody><tr><td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) pure</td><td>PENTA, CZ</td><td>10028-24-7</td><td></td></tr><tr><td>Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)</td><td>ACLAR, US</td><td>10501-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, abs. 100% a.r.</td><td>Chem-Lab NV, BE</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Danger: Highly inflammable liquid and vapour.</td></tr><tr><td>EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavities</td><td>PELCO, US</td><td>10501</td><td></td></tr><tr><td>Glass vial 2 ml</td><td>VWR Life Science, US</td><td>548-0045</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 50% solution</td><td>VWR Life Science, US</td><td>23H2856331</td><td>Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td></tr><tr><td>Histo diamond knife</td><td>Diatome, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEICA EM UC7</td><td>Leica Vienna, AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LR White resin hard grade</td><td>Electron Microscopy Sciences, US</td><td>14383</td><td>Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Normax, PT</td><td>5470308A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MP</td><td>Nikon Corporation, JP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide (OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Agar Scientific Ltd, GB</td><td>R1019</td><td>Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.</td></tr><tr><td>Pipette and pipette tips</td><td>Thermo Scientific, FI</td><td>KJ16047</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;.&lt;/sup&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) pure</td><td>PENTA, CZ</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 ml</td><td>Ecoject, DE</td><td>20010</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue, general purpose grade</td><td>Fisher Scientific, GB</td><td>2045836</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing structural traits in triticum aestivum and zea mays for c3 and c4 photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections

与 C3 机制相比，C4 光合作用的效率更高，源于其将 CO2 浓缩在束鞘细胞中的能力。C4 光合作用的有效性和内在水分利用效率与叶肉和束状叶细胞的份额、束状叶鞘的大小和密度以及束状鞘状细胞的大小、密度和细胞壁厚度直接相关。可以使用常规光学显微镜对徒手和半薄切片进行这些性状的快速显微镜分析，通过识别和检查特定细胞类型提供有关 C4 作物光合效率的宝贵信息。此外，还显示了影响解剖测量和细胞类型诊断的手绘和半薄片制备错误，以及如何避免这些错误。这种显微镜方法提供了一种有效的方法来收集对环境变化的光合适应的见解，并有助于快速筛选作物以适应未来的气候。

图 1A 显示了用于新鲜切片和光学显微镜检查的叶子切片的正确方向。使用单面剃须刀和牙科蜡片切割新鲜切片的方法如图 1B 所示。生成的部分如图 1C 所示。
图 2 显示了 C3 植物 T. aestivum 和 C4 植物 Z. mays 的代表性叶子的徒手切片。在叶脉周围可以看到束鞘细胞，玉米的细胞更圆、更绿，表明叶绿体的存在更高。从这些图像中可以获得叶厚和总束鞘面积;然而，这种方法无法进一步表征叶肉。
图 3 显示了 T. aestivum 和 Z. mays 的半薄横截面。使用这种方法，叶子的所有组织都是可见且可测量的。Kranz 的解剖结构在 Z. mays 中很明显，叶肉细胞排列在叶脉周围。束鞘扩大并充满叶绿体，特别是集中在叶肉细胞。这允许束鞘细胞和叶肉细胞之间快速交换代谢物。从这些图像中，测量了以下叶片结构性状：小脉和大脉之间的脉间距离、束鞘直径、总束鞘面积、脉面积、束鞘细胞比例、束鞘细胞面积、500 μm 以内的叶脉频率和叶片厚度。 图 4 中的箱形图显示了 T. aestivum 和 Z. mays 之间此类性状的差异。除了一个性状，即大静脉之间的静脉间距外，所有性状在 95% 置信区间处都
图 4 显示了一组箱形图，这些图代表了 T. aestivum 和 Z. mays 之间的解剖性状差异，举例说明了 C3 和 C4 束鞘结构之间的差异。作物物种之间的叶脉间距、束鞘的直径（在相同的生长条件下）、束鞘细胞和非光合材料（即叶脉）的分数以及 500 μm 截面宽度中的叶脉频率之间存在显着差异 - 所有这些都强烈表明了 C3 和 C4 叶解剖结构之间的预期。
图 5 显示了切割或制备样品时可能发生的一些错误示例。这些图像中的叶子解剖结构被掩盖或变形，因此不可靠用于表征。用甲苯胺蓝过度染色可能发生在用超薄切片机切割的切片中，其中染色留下的时间过长，从而掩盖了细胞结构（图 5A，B）。在浸润方案中，树脂不能完全渗透到叶组织中，可能会出现常见错误（图 5C，D）。沿纹理切割的叶横截面导致长方形细胞，其中叶肉和束鞘细胞无法定位或正确测量（图 5F，G，H）。
在 R （版本 4.3.1） 中进行统计分析以创建箱线图。一式三份测量叶片解剖性状 （每株 3 片叶子，每个物种 3 株）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig01.jpg"> 图 1：切割新鲜叶横截面的正确方法。（A） 为了获得横截面而确定叶片截面的方向。 （B） 使用单面剃须刀片在一块扁平的牙蜡上切开叶子的技术。 （C） 所得横截面显示为薄片，可以安装在载玻片上并在显微镜下观察。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/66843/66843fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig02.jpg"> 图 2：代表性叶子的徒手切片。 （A） C3 植物 Triticum aestivum （400 倍放大）;（B） C4 植物 Zea mays 在（200 倍放大倍率）下。细胞类型用箭头表示，其中 V = 静脉，BSC = 束鞘细胞，MC = 叶肉细胞。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/66843/66843fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig03.jpg"> 图 3：半薄横截面。 （A） 玉米 和（B） 小麦 ，显示具有 Kranz 解剖结构 （A） 的 C4 物种和没有 Kranz 解剖结构的 C3 物种 （B） 中束鞘和叶绿体位置的差异。缩写：Tl = 叶厚，BS = 束鞘，SV = 小脉，ID = 脉间距离，LV = 大脉。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/66843/66843fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig04.jpg"> 图 4：显示 小麦 和 玉米之间解剖特征差异的箱线图。 （A） 小静脉之间的静脉间距，（B） 大静脉之间的静脉间距，（C） 束鞘直径，（D） 总束鞘面积，（E） 静脉面积，（F） 束鞘细胞分数，（G） 束鞘细胞面积，（H） 500 μm 以内的静脉频率和 （I） 叶片厚度。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/66843/66843fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66843/66843fig05.jpg"> 图 5：组织处理中可能发生的常见错误示例，以红色箭头表示。 包埋在 LR White 丙烯酸树脂中的样品中过染 （A） 小麦 和 （B） 玉米;嵌入 Spurr 环氧树脂 （C） Ceratozamia robusta 和 （D） Dioon mejiae 的切片中树脂撕裂; T. aestivum 徒手切片显示 （E） 横截面和 （F） 纵向切片;由于 （G） Annona muricata 和 （H） Encephalartos villosus 的斜切导致切片偏倚。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/66843/66843fig05large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>溶液</td>
			<td colspan="3">制备</td>
			<td>最终卷</td>
		</tr><tr><td>缓冲液 1 的碱基</td>
			<td colspan="3">溶解 7.12 g Na 2 HPO 4 。200 mL 蒸馏水中 2H2O</td>
			<td>200 毫升</td>
		</tr><tr><td>缓冲液 2 的碱基</td>
			<td colspan="3">溶解 7.12 g NaH 2 PO 4 。200 ml 蒸馏水中的 2H2O</td>
			<td>200 毫升</td>
		</tr><tr><td>磷酸盐缓冲溶液</td>
			<td colspan="3">混合 36 mL 1 碱、14 mL 2 碱和 50 mL 蒸馏水</td>
			<td>100 毫升</td>
		</tr><tr><td>固定液</td>
			<td colspan="3">混合 9.25 mL 的 5% 戊二醛（注意：参见材料表）、12.5 mL 磷酸盐缓冲液和 28.25 mL 蒸馏水。储存在 4 °C。</td>
			<td>50 毫升</td>
		</tr></tbody></table>表 1：固定液的配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">步</td>
			<td colspan="6">描述</td>
			<td>期间</td>
			<td>重复</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td colspan="2">用缓冲液冲洗</td>
			<td colspan="6">用移液管轻轻去除固定剂并加入磷酸盐缓冲液，直到样品被覆盖。静置 30 分钟。</td>
			<td>30 分钟</td>
			<td>3 倍</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td colspan="2">用 1% 四氧化锇染色</td>
			<td colspan="6">（注意：参见材料表）：用移液管去除磷酸盐缓冲液，并加入四氧化锇，直到样品被覆盖。样品和其他有机物会变黑。使用双层手套。</td>
			<td>60 分钟</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td colspan="2">用蒸馏水冲洗样品</td>
			<td colspan="6">用移液管除去之前的溶液，并用蒸馏水覆盖样品。静置 30 分钟。重复此步骤 3 次。使用双层手套。</td>
			<td>30 分钟</td>
			<td>3 次</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td colspan="2">乙醇系列浸润</td>
			<td colspan="6">用移液管除去前一种溶液，并用 50/50 蒸馏水-乙醇溶液覆盖样品。静置 30 分钟。使用以下系列的蒸馏水-乙醇溶液重复此步骤：30/70、20/80、10/90 和 100% 乙醇。</td>
			<td>30 分钟</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td colspan="2">树脂-乙醇系列浸润</td>
			<td colspan="6">用移液管除去前一种溶液，并用 1/3 树脂-乙醇溶液覆盖样品。将样品放在搅拌板上，放置 2 小时。使用以下系列的树脂-乙醇溶液重复此步骤：1/2、1/1、2/1、3/1 和 100% 树脂。</td>
			<td>120 分钟</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="6">聚合前在冰箱中储存 72 小时</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="6">根据产品规格聚合浸润的叶切片，以获得树脂包埋的样品。</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表 2：树脂渗透方案。

作者聚焦：了解气候适应型作物植物结构-功能关系的创新方法

评估 C3 和 C4 叶横截面之间的解剖学差异有助于了解光合作用效率。本文描述了徒手和半薄叶横截面的制备和检查，以及作物物种 Triticum aestivum 和 Zea mays 的准备注意事项。

使用徒手和半薄切片评估 小麦和 Zea mays 的 C3 和 C4 光合作用分化的结构特征

The enhanced efficiency of C4 photosynthesis, compared to the C3 mechanism, arises from its ability to concentrate CO2 in bundle sheath cells. The ...

assessing-structural-traits-triticum-aestivum-zea-mays-for-c3-c4

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Structural Traits in Triticum aestivum and Zea mays for C3 and C4 Photosynthetic Differentiation Using Free-hand and Semi-thin Sections

774 次观看.  Estonian University of Life Sciences. 我们的研究重点是植物结构、功能关系。我们的目标是更好地了解不同植物功能类型的光合作用的局限性，以及如何改善它们以用于气候适应型作物。新技术和软件成本高昂，而且通常无法获得，这需要一定程度的试验和创新才能在对不同的植物功能类型进行成像时实现相同的分辨率。鉴定区分 C3 和 C4 叶的解剖结构，特别是在显微镜检查的准?...

视频: 作者聚焦：了解气候适应型作物植物结构-功能关系的创新方法

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB 和光谱根成像植物表型和生理研究: 实验装置和成像协议

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

科研

环境科学

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

木质素下调<em&gt;玉米</em&gt;通过dsRNAi和Klason木质素分析

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

生物工程

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

成熟水稻的横向切片（米 苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

生物化学

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

组织化学染色<em&gt;拟南芥</em&gt;次生壁元素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

生物学

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

混合式切割:用于顽拗植物组织样品的改进切法

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

基于 X 射线 Microcomputed 层析成像的玉米血管束微米尺度分型技术研究

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

获得全种子尺寸树脂部分的简单干截块方法及其应用

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

用于解释霉菌异养植物组织中真菌定植和种子共生萌发的显微镜技术

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

结合透明和荧光显微镜，可视化基因表达的变化和对芸苔疟原虫的生理反应

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

改进的玉米叶片原基成像方法

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

作者聚焦：用于荧光和共聚焦成像的玉米叶片原基横向切片和展开整片的改进方法  

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

用于荧光和共聚焦成像的玉米叶原基横向切片和展开整片的制备方法的改进方法

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

使用徒手和半薄切片评估小麦和 Zea mays 的 C₃ 和 C₄ 光合作用分化的结构特征

副本

摘要

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此视频中的章节

RGB 和光谱根成像植物表型和生理研究: 实验装置和成像协议

木质素下调

成熟水稻的横向切片（米苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

组织化学染色

混合式切割:用于顽拗植物组织样品的改进切法

基于 X 射线 Microcomputed 层析成像的玉米血管束微米尺度分型技术研究

获得全种子尺寸树脂部分的简单干截块方法及其应用

用于解释霉菌异养植物组织中真菌定植和种子共生萌发的显微镜技术

结合透明和荧光显微镜，可视化基因表达的变化和对芸苔疟原虫的生理反应

用于荧光和共聚焦成像的玉米叶原基横向切片和展开整片的制备方法的改进方法

使用徒手和半薄切片评估 小麦和 Zea mays 的 C3 和 C4 光合作用分化的结构特征

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摘要

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RGB 和光谱根成像植物表型和生理研究: 实验装置和成像协议

木质素下调

成熟水稻的横向切片（米 苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核

组织化学染色

混合式切割:用于顽拗植物组织样品的改进切法

基于 X 射线 Microcomputed 层析成像的玉米血管束微米尺度分型技术研究

获得全种子尺寸树脂部分的简单干截块方法及其应用

用于解释霉菌异养植物组织中真菌定植和种子共生萌发的显微镜技术

结合透明和荧光显微镜，可视化基因表达的变化和对芸苔疟原虫的生理反应

用于荧光和共聚焦成像的玉米叶原基横向切片和展开整片的制备方法的改进方法

使用徒手和半薄切片评估小麦和 Zea mays 的 C₃ 和 C₄ 光合作用分化的结构特征

成熟水稻的横向切片（米苜蓿L.）使用移液器吸头作为固定支架的扫描电子显微镜成像的内核