符合GMP的基因修饰T细胞生成程序

该协议描述了用目的基因转导人原代T细胞的简化和符合GNP的过程。这种特殊技术被设计为具有成本效益和符合GNP标准，而无需使用目前许多学术中心可用的昂贵的封闭系统制造平台。这种方法可能应用于基因修饰细胞疗法的产生，包括但不限于CAR T细胞，这是解决血液系统恶性肿瘤的范式转变。

为了从供体血液白细胞分离术后收集的细胞中分离PBMC，对样品进行基于多糖的密度梯度离心，保持试剂与样品的比例为1:2，方法是在室温下将混合物以800G离心30分钟，并关闭制动器。然后使用微量移液器将PBMC收集到干净的50毫升管中。通过离心用PBS洗涤细胞两次。

在将洗涤的细胞重悬于完全造血培养基中之前。通过为每 200 万个细胞添加 10 微升 T 细胞刺激试剂来激活约 2000 万个获得的细胞。接下来，在以每毫升20单位加入重组人白细胞介素-2后，轻轻混合溶液并将其转移到六孔板中。

在进行病毒转导之前，将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 72 小时。在第三天，将细胞培养物转移到 50 毫升锥形管中并充分混合。在室温下以300G离心管10分钟以除去活化试剂。

在计数细胞之前，完全弃去上清液并将沉淀重悬于一毫升完全培养基中。使用完全培养基调整细胞悬浮体积，以达到允许在 24 孔板中每孔接种 050 万个细胞的浓度。将重组人白细胞介素-7和重组人白细胞介素-15以适当浓度加入细胞中。

在单独的试管中，考虑要使用的最终病毒体积，将所需量的vectofusin-1加入Opti-MEM培养基中。将这种混合物与浓缩的病毒以一比一的比例混合，确保充分混合。接下来，将含有病毒的混合物添加到细胞中。

如有必要，使用完全培养基将每个孔的总体积调节至 400 微升。盖上盖子后，用石蜡膜密封，然后在1000G下在32摄氏度下离心两小时。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。

第二天，收集细胞并将其从每个孔中拉入 50 毫升管中。接下来，将细胞以400G和室温离心五分钟。小心除去上清液后，在计数细胞之前，将沉淀完全重悬于一毫升完全培养基中。

然后用培养基调节细胞浓度，达到每毫升100万个细胞，并在培养细胞之前分别以每毫升155和290单位的速度加入人重组白细胞介素-7和人重组白细胞介素-15。达到所需的细胞数量后，收获细胞并将其转移到 50 毫升管中并离心。除去上清液后，将沉淀重悬于10毫升培养基中以计数细胞。

再次离心后，完全弃去上清液，并将沉淀重悬于由50%HSA和40%HBSS组成的冻存溶液中，每个冷冻小瓶的浓度为每毫升1000万个细胞。将0.9毫升细胞悬液转移到所需数量的冷冻小瓶中，并向每个冷冻小瓶中加入10%二甲基亚砜。将冷冻小瓶放在冰上，并迅速将它们转移到控制速率的冰箱中以进行冷冻保存。

然后将冻存的样品转移到受监测的液氮罐中进行长期储存。为了评估转导效率，在荧光激活细胞分选或FACS管中向样品中加入500微升FACS缓冲液。在400G和室温下离心样品5分钟后，使用移液管完全弃去上清液。

将沉淀重悬于FACS缓冲液中CD3的1至5稀释溶液中。涡旋样品并在黑暗中的冰上孵育 30 分钟，然后如前所述离心。接下来，在完全弃去上清液后，将沉淀重悬于FACS缓冲液中的1至20稀释的7-AAD溶液中。

涡旋这种混合物，然后在黑暗环境中在冰上孵育 10 分钟。最后，向其中加入200微升FACS缓冲液，然后继续使用流式细胞仪分析样品。转导细胞的活力分析显示，在第 14 天，超过 95% 的细胞在排除 7-AAD 阳性细胞后呈 CD3 阳性并存活，表明 T 细胞成功活化和扩增。

CD3阳性细胞群内的转导效率为58.7%，与非转导细胞相比，CD3阳性细胞群的转导效率为0.51%当转导细胞从第4天扩增到第14天时，每两天进行一次传代培养，细胞扩增了25倍。该产品经过各种质量控制测试，符合所有设定的标准，表明其适合进一步使用。整个过程应采用严格的无菌技术进行。

最棘手的步骤是转导过程，需要考虑要添加的所有试剂，以保持特定的总体积。