高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的生成和培养

患者驱动的类器官模型在遗传和功能上代表其亲本肿瘤，因此是研究卵巢癌新疗法和复杂生物学过程的可靠模型。通过概括克隆异质性、肿瘤微环境和体外细胞间相互作用，这些模型克服了癌细胞系和患者来源的异种移植物的局限性。患者来源的类器官提供长期扩增和储存能力，并模拟肿瘤生理学。

因此，它们是研究新型疗法和预测性生物标志物的理想模型。通过将肿瘤样品放入 10 厘米的组织培养皿中并使用一次性手术刀切碎组织以创建均匀的混合物来开始收获类器官。使用镊子将均匀的组织混合物放入解离管中。

对于每1至2毫升均质组织，在类器官基础培养基中加入7至8毫升每毫升1毫克的二型胶原酶溶液和一毫升DNase One溶液。使用解离机在胶原酶溶液中液化组织时以458G.液化溶液。运行程序 37 C 下划线 H 下划线 TDK 三个一小时，直到它是单细胞悬浮液。

完成后，将均质化的混合物转移到新的50毫升锥形管中。加入20至40毫升类器官基培养基，并以458G涡旋溶液，然后通过100微米细胞过滤器将溶液过滤到新标记的50毫升锥形管中。接下来，将过滤后的混合物在 1， 650 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟，并使用玻璃牧场移液管吸出上清液。

准备每毫升100微克的DNA酶一，并通过添加逐滴的DNA酶一溶液将细胞重悬于一毫升的Dnase One溶液中。在室温下孵育15分钟后，向细胞中加入25毫升类器官碱基并倒置混合。然后将细胞在1， 650 G下在4摄氏度下离心5分钟，并使用玻璃牧场移液管小心地吸出上清液。

将新形成的细胞沉淀重悬于五毫升预热的红细胞或红细胞裂解缓冲液中。以458G涡旋每个锥形管中的溶液并孵育五分钟。再次，离心悬浮在RBC裂解缓冲液中的沉淀，并使用玻璃牧场移液管吸出上清液。

用10毫升PBS洗涤沉淀并在离心细胞之前涡旋细胞。对于大细胞沉淀，吸出PBS并在沉淀顶部添加一毫升类器官基质培养基。涡旋溶液后，将300至400微升细胞悬液转移到微量离心管中。

离心五分钟后，吸出上清液并使用冷吸头将其重悬于基底膜提取物或BME和类器官碱基中。将重悬的细胞溶液以40微升等分试样接种到六孔板中。每孔最多铺五等分试样。

立即将孔板放入培养箱中20分钟，孵育后，轻轻地向每个孔中加入两毫升完整的类器官培养基。向每个孔中加入一毫升类器官碱基，并将培养基直接上下移液到类器官标签上进行解离。将所有含有重悬颗粒的培养基收集在15毫升锥形管中。

然后，在吸出上清液之前，将含有混合物的15毫升锥形管离心五分钟。向细胞沉淀中加入一毫升动物源性游离重组酶。通过涡旋混合并将悬浮液转移到1.5毫升微量离心管中。

在37摄氏度的水浴中孵育15分钟并离心5分钟后，吸出上清液。将沉淀重悬于BME和类器官基础培养基中，并将重悬的细胞溶液以40微升等分试样接种到六孔板中。每孔最多铺五等分试样。

孵育20分钟后，将两毫升完整的类器官培养基轻轻加入每个孔中。将传代类器官细胞沉淀重悬于0.5至1毫升的回收细胞培养冷冻培养基中，并将1毫升转移到每个冷冻瓶中，然后将其转移到零下80度和液氮罐中长期储存。通过将储存在液氮中的冷冻瓶转移到37摄氏度的水浴中来解冻类器官。

解冻后，将类器官转移到15毫升锥形管中，并在吸出上清液之前离心。接下来，向沉淀中加入一毫升PBS，并将重悬的沉淀转移到1.5毫升微量离心管中后，在4摄氏度下以1，650G离心5分钟后，使用玻璃牧场移液管小心地吸出上清液。将沉淀重悬于BME和类器官基础培养基中，并将重悬的细胞以40微升等分试样铺到六孔板上。

每孔最多放置五个等分试样。立即将板放入培养箱中20分钟，然后将两毫升完整的类器官培养基加入孔中。在10天内建立类器官，之后它们在培养物中显示出离散的类器官。

通过将患者来源的类器官培养物嵌入琼脂糖中并用苏木精和伊红染色进行评估来评估。重要的是要考虑与BME合作的挑战。细胞沉淀和BME的重悬必须在冰上进行，确保在此过程中不会形成气泡。

由于接受过新辅助化疗的患者遇到的问题，该技术允许进一步研究化疗对类器官生成和发育的影响。