跟踪实验进化人群中结构变异的动态

插入、缺失、重复和反转等结构变异在过去更难通过实验进行跟踪，并且它们的频率无法通过扩增子测序准确测量。在这里，我们提供了一种简单的具有成本效益的技术，该技术将一式三份引物设计和平行毛细管电分离置换相结合，以随着时间的推移跟踪结构变异等位基因频率。该方法旨在补充实验进化中的终点测序，并追溯新兴新生等位基因的频率。

我们希望这种方法也能使那些使用宿主内病原体数据的人受益。演示该程序的将是来自我们实验室的研究助理Jeanne Hamet。这些方法的不同步骤将显示在派生等位基因由IS10插入称为mutS的细菌基因中产生的情况下。

首先设计一对引物，以扩增突变插入位点周围野生型等位基因上的短扩增子。在插入序列中设计第三个引物正向引物二，以从野生型扩增子中产生轻微的大小变量。首先从固定野生型和突变等位基因克隆的 24 小时培养物中提取 DNA。

定量DNA后，用水将每个DNA提取物稀释至每微升5纳克。以 50/50 的比例固定两个样本。设置一个 20 微升反应，其中包含 10 纳克 DNA 样品、引物和 PCR 预混液。

接下来，使用2%琼脂糖凝胶通过电泳分离PCR产物。野生型扩增子和突变体之间的大小差异必须在凝胶上验证。为了获得校准曲线，首先以各种比例混合野生型DNA和突变型DNA。

将PCR产物稀释至每微升浓度0.1纳克。要制备分离凝胶，请将新鲜凝胶和染料混合。更换入口缓冲液。

将冲洗缓冲液放在平行毛细管电泳仪的正确抽屉位置。将22微升稀释剂标记物添加到96孔板的孔中。现在向每个样品孔中加入两微升稀释的PCR产物。

在一个孔中，从高灵敏度试剂盒中添加一个DNA大小的分子量标准，大小范围为1到6， 000个碱基对。将微孔板放入平行毛细管电泳仪中，在仪器软件上选择运行。使用数据分析软件分析结果。

首先，根据峰的已知大小识别峰。量化每个扩增子以产生校准曲线。最后，验证是否正确测量了两个等位基因的相对数量。

然后使用该校准曲线计算PCR扩增和平行毛细管电泳后结构变异的数量。这些具有代表性的结果是在mutS基因的破坏性插入之后。敲低和mutS导致超突变表型，允许细菌采样比其基本突变率更多的突变。

使用所提出的方法，跟踪了1000代的mutS结构变异频率。揭示了新兴突变等位基因的非单调轨迹。突变等位基因首次在第680代被发现。

然后等位基因的频率迅速增加，到713代达到67%。然后这种增长停滞不前，在接下来的53代中仅增加了10%，达到76%出乎意料的是，突变等位基因频率在13代的过程中从76%下降到49%，之后它增加到固定。这种方法将使那些从事实验进化的人受益。

该协议允许用户获取冻结的档案并探索进化轨迹，否则端点测序数据无法观察到这些轨迹。