0.我们的协议描述了一种优化且可重复的体外生成破骨细胞的方法，可用于研究其分化过程和功能背后的机制。该技术的主要优点是能够在短短一周内产生大量功能活跃的破骨细胞。通过使用纯化的单核细胞并按时添加细胞因子来实现高分化产量。
破骨细胞负责所有形式的关节炎的骨破坏，这种方法提供了筛选可以调节其分化和/或功能的新型治疗化合物的工具。演示该程序的将是来自我们实验室的博士生Patricia Riedlova。首先，通过将血液转移到新的50毫升管中来分离PBMC。
用等体积的无菌PBS稀释新鲜血液，或白细胞锥细胞和白细胞沉棕黄层的1:3比例稀释。通过倒置轻轻混合血液。准备含有三毫升密度梯度培养基的15毫升试管，并在密度梯度培养基的顶部缓慢地将8至10毫升稀释的血液分层，避免混合。
将试管在室温下以400 x g 离心30分钟，无需制动。然后用巴斯德移液管小心地丢弃顶层。收集含有PBMC的下层间层，并将该层转移到新的50毫升管中。
用无菌PBS悬浮细胞至50毫升，并通过在室温下以300×g离心10分钟并完全制动来洗去残留的密度梯度培养基。为了去除残留的血小板，重复手稿中所述的离心过程，将分离和纯化的PBMC重悬于20毫升PBS中，并按照标准方法使用血细胞计数器计数。为了富集CD14 +单核细胞，将1 x 10转移到第七个PBMC中，放入合适的聚苯乙烯圆底管中，并以300 x g 沉淀细胞五分钟。
弃去上清液并将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液中后，盖上盖子，每 100 微升用 10 微升抗体混合物孵育细胞 10 分钟。在孵育结束时，每100微升加入10微升磁性纳米颗粒珠，并盖上盖子孵育三分钟。用细胞分离缓冲液将体积加满至2.5毫升。
将试管放入磁铁中，盖上盖子孵育三分钟。现在，当管仍在磁铁中时，通过反转连续移动丢弃阴细胞群。从磁铁上取下试管，通过将附着在磁珠上的富集CD14 +单核细胞重悬于2.5毫升细胞悬浮缓冲液中来洗涤它们，然后将管放回磁铁中。
如前所述，对分离的细胞进行计数。将收集的细胞以300 x g 离心五分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于含有10%FBS的完全α最小必需培养基中，每毫升100万个细胞。
为了区分破骨细胞，将终浓度为每毫升25纳克的M-CSF添加到细胞悬液中，并通过彻底移液混合以使细胞悬液匀浆。将每孔100微升悬浮液板放在平底96孔板中。接下来，在铺板细胞周围每孔添加200微升无菌蒸馏水，以防止培养基蒸发和培养系统中的边缘效应。
将细胞在 37% 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育约 18 至 20 小时。准备补充有M-CSF和RANK配体的新鲜培养基。孵育后，使用P200移液管通过抽吸小心地除去一半的培养基，并用补充有M-CSF和RANK配体的新鲜，温暖的完全培养基代替，终浓度为每毫升25纳克。
将细胞分化为破骨细胞7至14天，每三天完全更换一次培养基。除去培养基后，用每孔100微升制备的固定溶液固定分化的贴壁破骨细胞，并孵育一分钟。不要触摸孔的底部，以免划伤贴壁细胞。
用300微升无菌蒸馏水洗涤孔三次后，将板敲干，并向每个孔中加入100微升新鲜制备的染色溶液。将板在 37 摄氏度的黑暗中孵育 20 分钟。孵育后，倒置除去染色溶液，并用每孔300微升蒸馏水洗涤板三次。
通过在纸巾上敲击盘子来去除多余的水，并将盘子打开并避光至风干过夜。使用带有平铺选项的明场显微镜，以10倍或20倍拍摄图像以捕获整个孔表面。使用带有细胞计数器插件的图像分析软件手动计数被鉴定为具有三个以上细胞核的 TRAP+紫色染色细胞的破骨细胞。
将每孔100微升分离的CD14 +单核细胞以1 x 10的细胞密度接种到每孔第五个细胞中。如前所述，在存在M-CSF和RANK配体的情况下区分破骨细胞，每三天完全更换培养基。在结束时间点，轻轻取出培养基，并用pH 7.4的200微升预热PBS洗涤每个孔两次。
不要让井在步骤之间干涸。用每孔 100 微升 4% 甲醛溶液在 PBS 中固定样品，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育 10 分钟。孵育后，用每孔200微升的PBS洗涤细胞两次。
用在PBS中稀释的每孔100微升0.1%Triton x-100溶液透化细胞，并如前所述孵育10分钟。用每孔200微升的PBS洗涤两次。为了阻断非特异性结合并增加信号，加入100微升由2%牛血清白蛋白和PBS溶液制成的封闭溶液。
在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育20分钟。除去封闭溶液后，向每个孔中加入100微升荧光共轭鬼笔环肽溶液，该溶液在2%BSA / PBS溶液中稀释。用每孔200微升的PBS洗涤两次。
用每孔 100 微升含有 300 纳摩尔 DAPI 的 PBS 溶液染色细胞核。10 到 15 分钟后，取出 DAPI 溶液并用每孔 100 微升的 PBS 代替。使用适当的免疫荧光或共聚焦显微镜在 4 到 40 倍处可视化染色。
成熟的破骨细胞被定义为TRAP+多个有核细胞。RANK配体的添加以剂量依赖性方式产生越来越多的大型TRAP+多核破骨细胞。在2至14天的培养期内研究了单核细胞破骨细胞分化的动力学。
从第五天开始可见多核破骨细胞，并在第七天达到最佳分化。破骨细胞在矿化表面上的分化允许通过分析圆孔或吸收坑的形成来评估其吸收活性。与单独的M-CSF相比，存在M-CSF和RANK配体时，吸收百分比显着增加。
此外，与未处理的对照井相比，用鱼藤酮剂量依赖性地处理抑制了矿化表面的再吸收。破骨细胞吸收的鱼藤酮依赖性抑制与ATP产生的抑制有关。在鱼藤酮存在下观察到成熟OCS的RANK配体衍生肌动蛋白环的碎裂。
重要的是要确保富集的单核细胞不含血小板，细胞以正确的密度接种，并且周围的孔充满水以避免边缘效应。该协议对于机械地询问破骨细胞如何形成以及影响它们在基础和转化科学中的功能特别有用。例如，通过使用可以调节这些过程的化合物或蛋白质。
