从植物叶片组织和蓝藻中分离出塑体球脂滴

分离高纯度的质体球对他们的研究至关重要。本文介绍了一种快速有效的分离方案，有助于其下游生化研究。这种方法的主要优点是程序的相对速度及其对众多植物物种和环境条件的适应性。

在对类囊体悬浮液进行超声处理时必须特别小心，以确保有足够的力从类囊体中剥离质体球，并随后从蔗糖梯度中提取质体球。演示这一程序的将是我实验室的博士后研究员Elsinraju Devadasu博士和我实验室的博士生Febri Susanto。首先获得六种健康玉米的三周龄幼苗，具有V5生长期，重约120克。

剪掉茎基部的所有叶子，并迅速将它们浸入冰浴中，然后将它们运送到冷藏室。在绿色安全灯下工作，从冰浴中取出玉米叶，用剪刀将它们剪成五乘五厘米的小块。在商用搅拌机上以低于7的水平在350毫升研磨缓冲液中轻轻彻底研磨一半的剪枝叶组织。

启动和停止搅拌机五到六次，以确保所有叶子都被切掉。通过大漏斗上的一层 25 微米尼龙布过滤匀浆到四个 250 毫升离心瓶中。用剩余的夹住的叶组织重复混合步骤后，将滤液均匀地分配到四个瓶子之间。

取出等分试样的叶滤液并将其放在一边，作为代表性的总叶样品储存。接下来，将滤液在 1， 840 G 和 4 摄氏度下离心六分钟。倒出所得的上清液，用刷子轻轻旋转，将沉淀重悬于含有0.2摩尔蔗糖的12毫升培养基R 0.2中。

将颗粒重新悬浮在一个瓶子中后，将悬浮液添加到下一个瓶子中，然后重复重悬液以将悬浮液合并到一个瓶子中。将混合悬浮液分布在六个三毫升超速离心管之间，每个管中的最大体积达到 2.5 毫升。然后使用100%振幅的尖端超声仪对每个管进行四次超声处理，每次10秒。

确保超声器喇叭浸没并远离液体表面，以防止起泡。在每轮中，在悬架内缓慢上下移动超声器喇叭。在交替使用四个试管的同时，在每次超声处理后将每个试管放回冰桶中，以使样品冷却。

完成后，将超声处理的粗类囊体悬浮液在 150， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 30 分钟。使用注射器和 22 号针头撇去垫子表面，并从蔗糖垫中收获产生的黄色和油性浮式粗质体球垫。从每个管中回收约500微升，并将它们放入2.0毫升的管中。

在超声处理和释放质体球之前和之后收集粗类囊体等分试样。完成后，要么继续植物组织处理，要么将粗质体球储存在零下80摄氏度，稍后再纯化。在BG11培养基中生长50毫升集胞藻属PCC 6802培养物7至10天以达到固定期。

使用分光光度计，将细胞密度调整为2.0纳米处的750光密度。为了去除多糖，离心50毫升培养物并除去上清液。在50毫升缓冲液A中重复洗涤细胞两次。

将洗涤后的沉淀重悬于25毫升缓冲液A中，并使用1， 100磅平方英寸的法国压力池破碎细胞。在寒冷条件下重复该过程三次，直到裂解的颜色在白光下从绿色变为红色，蓝色，绿色。取出细胞匀浆的等分试样并将其放在一边，作为代表性的总细胞样品储存。

将所得匀浆分布在八个三毫升超速离心管中，每个管中最多填充 2.5 毫升。用 400 微升培养基 R 覆盖该匀浆，产生阶梯度。在离心管之前，根据需要添加额外的培养基R来仔细平衡试管。

类囊体和其他较重的细胞器，包括任何多羟基链烷酸小体，显示沉淀形成，而质体球在蔗糖梯度顶部或附近形成黄色油状垫。如前所述，用注射器收获所得的粗质体球漂浮垫，并将收获物放入两毫升管中。如有必要，用针尖从超速离心管壁的侧面刮下质球。

要么继续蓝藻加工，要么将粗质体球储存在零下80摄氏度，稍后再纯化。为了使用植物组织处理方法收获纯质体球，使用500微升粗质体球，400微升培养基R 0.2和400微升培养基R制备前面描述的蔗糖梯度.离心后，将所得的纯质体球漂浮垫收获到两毫升管中。将纯质体球分装并在液氮中快速冷冻后，将它们储存在零下80摄氏度或将其冻干成干粉。

为了从蓝藻中收获纯质体球，如前所述，使用 500 微升粗质体球、750 微升培养基 R 0.7 和 750 微升培养基 R 0.2 创建蔗糖梯度。离心后，将纯质体球收集在1.5毫升管中，并将纯质体球等分。完成后，将纯质体球等分试样在液氮中快速冷冻，并直接在零下80摄氏度下储存或冻干成干粉。

在该方法中，可以看到大量的质体球或脂滴材料漂浮在蔗糖垫的顶层。随后离心后，在蔗糖梯度表面或附近获得纯化的质体球。成功分离质体球后，使用针对拟南芥原纤维蛋白1a和拟南芥光系统II亚基D1的抗体开发的用于纯度评估的免疫印迹显示，原纤维蛋白同系物主要与类囊体相关，而不是质体球。

为确保高效、集中地提取浮动垫，请在完全浸没时将注射器针头孔放在缓冲液液表面的正下方，然后轻轻向上拉。分离的质体球样品适用于随后的蛋白质组学或脂质组学研究，并已用于证明不同环境条件下靶向蛋白质-脂质组成的变化。该技术促进了质体球的新研究，包括通过随后的生化研究发现相关的蛋白激酶活性和寡聚蛋白复合物的存在。